專利名稱：旱稻孢囊線蟲特異性rapd和scar標記快速分子檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記全序列、特異性SCAR標記引物序列及旱稻孢囊線蟲SCAR標記快速分子檢測方法。
背景技術：
旱稻抱囊線蟲(Heteroderaelachista Ohshima, 1974),最早發(fā)現(xiàn)于日本的櫪木縣山地稻田中(Ohshima, 1974)，廣泛分布于日本的東北地區(qū)和九州地區(qū)，主要侵染水稻，目前在伊朗和中國也有分布。該病害引起的產(chǎn)量損失范圍在 7%-19%(Bridgeet ,Nematode parasites ofrice, Plant parasitic nematodes m tropical andsubtropical agriculture. Wallingford, UKj CABI Publishing, 1990，69-108)。ニ齡幼蟲在五月中旬侵染旱稻根部，卵在五周后開始沉積，孢囊在6-8周后開始形成(ShimizuK. seasonal iluctuation and rhizospherical distribution of population oi theupland rice cyst nematode, Heterodera elachista. Japanese Journal of Nematology1977，7:49-57)。丁中(賀沛成，洪宏，伍敏敏，丁中·旱稻孢囊線蟲(Heteroderaelachista)孵化特性研究.植物保護，2011，37 (6) : 101-103)研究發(fā)現(xiàn)，旱稻孢囊線蟲適宜的孵化溫度是28-32°C，與玉米孢囊線蟲類似，最佳孵化溫度均為30°C左右(Hashmib, Krusoerg LR. Factors miluencmg emergence of juveniles from cysts oiHeterodera zera. Journal of Nematology. 1995, 27 (3) : 362-369)。在我國，目前旱稻抱囊線蟲僅在湖南湖北部分地區(qū)有報道。旱稻孢囊線蟲屬于Cyperi群組，在形態(tài)上與H. oryzae, H. sacchari和
H.Ieuceilyma非常相近。其與H. sacchari和H. Ieuceilyma最明顯的區(qū)別是在孢囊細長的下橋上缺乏指形的投影，而與H. oryzae相比，孢囊略小，ニ齡幼蟲長度略短。目前旱稻孢囊線蟲的鑒定大部分仍然依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法，但是由于形態(tài)學鑒定耗時、需要很熟練的技術作為基礎，并且需要專門從事分類的人員來完成，這些原因使傳統(tǒng)的鑒定方法時常存在一定誤差并且不適用于大規(guī)模的樣品檢測。為了彌補形態(tài)學鑒定的不足，快速、準確的對農(nóng)作物孢囊線蟲進行鑒定和檢測，分子檢測技術迅速發(fā)展。20世紀80年代后期發(fā)展成功的DNA多聚酶鏈式反應(PCR)，使得直接擴增DNA成為可能，在此基礎上還產(chǎn)生了各種新的分子標記技術，這些分子標記和檢測技術都成功的應用到植物寄生線蟲特別是農(nóng)作物孢囊線蟲的分類鑒定和檢測過程中。特異性引物PCR或多重PCR技術是近年來線蟲分子診斷取得的重要進展。通過一次PCR測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出ー個或多個線蟲種。例如Subbotin SA, Peng D L 等(Subboton S A, Peng D L, Moens M. A rapid method for theidentmcation of the soybean cyst nematoae Heterodera glycines using duplexPCR. Nematology 2001, vol. 3 (4) :365-371)運用雙重PCR檢測大豆孢囊線蟲的方法，在一個PCR反應體系中同時運用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyFl和rDNA2，從52個大豆孢囊線蟲群體中均擴增出兩個DNA片斷(181bp and345bp),檢測的敏感度高達單個孢囊、單頭ニ齡幼蟲的微量DNA。此外，PCR技術對其他植物寄生線蟲種類的檢測也有較多進展。近年來，基于PCR技術的各種分子標記迅速發(fā)展起來，各種分子標記檢測技術特異性更高，檢測更準確，在植物寄生線蟲的分子檢測中應用也越來越廣泛。1990年，Williams 等和 Welsh 等(Welsh Jj MeClelland M. Fingerprinting genomes using PCRwith arbitrary primers. Nuc IicAcids Research·，1990，18:7213-7218)兩個研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標記一RAPD標記(Random Amplified Polymorphism DNA)。RAPD引物為隨機的寡聚核苷酸，長度多為10個核苷酸左右，通過PCR反應擴增基因組DNA，從而產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，結合瓊脂糖凝膠電泳也可以獲得不同的圖譜。由于不同基因組DNA序列堿基位點具有明顯的差異，在不同區(qū)段上可與引物發(fā)生結合的位點也不盡相同，因此擴增條帶的大小數(shù)量等特征也不同，從而使不同的種表現(xiàn)出多態(tài)性。RAH)優(yōu)點是所需DNA量極少，要求設備也相對簡單，但是由于RAPD引物非常短，只有十個堿基，退火溫度也較低，如果PCR體系變化，或者儀器變化，重復性會變差，而且易產(chǎn)生非特異性的條帶。為了彌補這ー不足，可以將其轉為SCAR (sequence characterized amplifiedregion)標記。RAPD轉化的SCAR標記技術由Paran和Michelmore于1993年提出并應用(Paran I，Michelmore R W. Development ofreliabie PCR-based markers linkedto downy mildew risistence genes in lettuce, meoretical and Applied genetics1993,85:985-993.)。Edward P. Caswe 11 -Chen 等(Edward P，Caswell-Chenj ValerieMj Williamson, FrancesF. Wu. Random amplified polymorphic DNA analysis ofHeterodera cruciferae and H. schachtiI populations. Journal of Nematology1992，24(3) :343-351)運用 RAH)標記區(qū)分了 H. cruciferae 和 H. schachtii，用 10 個不同的隨機引物擴增燕麥孢囊線蟲的不同種群的DNA，產(chǎn)生了 78條清晰的譜帶。1995年Lopez-Braiia I 等對禾谷孢囊線蟲群體做了 RAPD 分析。Jianbo Li (Jianbo Li，JamalFaghhihij John M. Ferris, et al. The use of RAPD amplified DNA as markers forvirulence characteristics in soybean syst menatode. Fundamental And AppliedNematology 1996，19(2) : 143-150)等用RAPD標記技術研究了大豆抗性品種與大豆孢囊線蟲的致病型之間的關系。Blok V. C. (Blok V Cj Philips, Harrower BE. Comparison ofBritish populations of potato cyst nematodes with populations irom continentalEurope and south America using RAPDs. Genome 1997，40:286-293)等通過 RAPD 技術研究馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲兩個群體的線蟲致病型之間的遺傳關系。在RAPD標記與SCAR標記的聯(lián)合應用方面，Meng Qing-peng等(MengQmgpengj Long H, Xu J H. PCR assays ior rapid and sensitive identificationof three major root-knot nematodes,Meloidogyne incognita,M. javanica andM. arenaria. Acta Phytopathologica Sinica2004，34 (3) : 204-210)成功地將南方根結線蟲和爪哇根結線蟲特異的隨機擴增多態(tài)性DNA片段轉化為SCAR標記。Adam M. A. M.等(Adam M A M，Phillips M S，Blok V C. Molecular diagnostic key for identificationof single juveniles of seven common and economically important species ofroot-knot nematode(Meloidogyne spp·)·Plant Pathology 2007，56:190-197)運用SCAR標記技術區(qū)分了根結線蟲屬的七種線蟲。在馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的快速分子診斷中，F(xiàn)ullanodo, A. et. Al (Fullaondo A, Barrena E, Viribay M, Barrena丄，balazar A, Ritter Ε·丄dentification of potato cyst nematode species Gioooderarostocniensis and G. pallida by PCR using specific primer combinations.Nematology 1999，1:157-163)用隨機引物0PG5分別擴增出區(qū)分馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲特異性RAPD標記片段，將RAPD標記轉化成SCAR標記后，分別擴增出了315bp 和 798bp 的特異性片段。Ou, S. Q.，Peng D. L. (Ou S Q, Peng D L, Li Y, MoensM. Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplifiedregion (SCAR) primers. Nematology 2008, 10(3) : 397-403)米用 RAPD 技術，獲得了基于大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標記，構建的特異性SCAR標記引物擴增出500bp大豆孢囊線蟲的特異性SCAR片段，選用核糖體引物D2A和D3B作為內(nèi)標與上述特異性引物SCNFl和SCNRl相結合，發(fā)明了一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲，在PCR擴增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 500bp的特異性SCAR標記片段和SOObp片段。國內(nèi)外雖然有關于旱稻孢囊線蟲核糖體DNA的ITS區(qū)域的研究報道，但國內(nèi)外尚未見基于基因組DNA的旱稻孢囊線蟲RAPD和SCAR標記特異性分子檢測旱稻孢囊線蟲的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術領域的空白，本發(fā)明提供旱稻孢囊線蟲特異性RAro標記的全長序列，同時將RAro標記轉化為更加穩(wěn)定的SCAR標記，提供了特異性SCAR標記的特異性引物。本發(fā)明還提供旱稻孢囊線蟲特異性SACR快速分子檢測方法，為制定線蟲的快速分子檢測、旱稻孢囊線蟲病的早期診斷和制定線蟲病害綜合治理對策服務。旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。根據(jù)旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段的保守序列設計的特異性引物。特異性引物為HeFl和HeRl，其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3，，HeRl : 5 ’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3，。旱稻孢囊線蟲SCAR標記快速分子檢測方法，其特征在于PCR反應體系中含有上述特異性引物。所述PCR反應體系中含有特異性引物HeFl和HeRl。所述PCR反應體系為反應體系總體積為25μ1，其中含有2. 5μ I IOXPCRBuffer (含 Mg++);2. Ομ I dNTP ；1. Ομ I HeFl (0· I μ g/μ I); I. 0 μ I HeRl (O. I μ g/μ I)；O. 25 μ ITaq DNA 聚合酶(5U/μ I) ；1. Ομ I 模板 DNA ;ddH20 補足 25 μ I。其中PCR 擴增程序為94°C 預變性 5min，然后 94°C 30S, 54°C 30S, 72°C Imin 循環(huán)35次，72°C延伸lOmin，保存在4°C條件下。本發(fā)明利用RAPD技木，獲得了基于旱稻孢囊線蟲基因組DNA的特異性RAPD標記，經(jīng)克隆測序后，設計SCAR標記引物，將RAPD標記轉換成SCAR標記，利用該SCAR標記的特 異性引物，可檢測出目標線蟲。本發(fā)明構建了特異性SCAR標記的特異性引物HeFl和HeRl(即SEQ ID N02和SEQID N03)。利用旱稻孢囊線蟲特異性引物HeFl和HeRl，在PCR擴增條件下，所有旱稻孢囊線蟲群體都獲得了 434bp的特異性SCAR標記片段，而其它線蟲類則沒有434bp的特異性SCAR標記片段。本發(fā)明構建的特異性引物HeFl和HeRl，特異性強，準確，靈敏。本發(fā)明應用特異性SCAR標記PCR檢測技術檢測目標線蟲，與重復性較差的RAPD技術(RAPD-PCR),核糖體DNA限制性內(nèi)切酶技術(RFLP-PCR)檢測方法相比，更能夠省時、準確、靈敏，更能建立快速、準確的旱稻孢囊線蟲檢測技木。該技術可應用于對旱稻孢囊線蟲田間土壤樣品及旱稻孢囊線蟲病發(fā)生的早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。


圖I :用12個Operon系列的含10個堿基的隨機引物對旱稻孢囊線蟲HeOl進行 擴增。M 為標準 DNA 分子標記(DNAmarker DL 2，000) ;1_12 為隨機引物 OPAtl2, OPA03, OPA
06,OPA09, OPA13, OPB15, OPC06, OPD13, OPG06, OPG08, OPG10, OPK16; 13 為陰性對照。(代碼見表 I 和表2)圖2 :用隨機引物OPB15擴增旱稻孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲等的RAPD的特異性DNA片段結果，M 為標準 DNA 分子標記(DNAmarker DL 2，000)；l-5:He01, He02, He03, He04, He05;6-16:HfOl, Hf06, HaOI, Ha06, HalO, HgOI, Hg03, HgoOI, Hgo05, RsOl, DdOl; 17 :陰性對照。(代碼見表I)圖3 :用旱稻孢囊線蟲特異性SCAR標記引物(HeFl和HeRl)擴增5種孢囊線蟲和2種非孢囊線蟲的結果，M 為標準 DNA 分子標記(DNA marker DL 2，000);l_5:He01，He02, He03, He04, He05;6-15:Ha01, Ha06, HalO, HfOI, Hf06, HgOI, Hg03, HgoOI, RsOl, DdOl; 16 :陰性對照。(代碼見表I)
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進ー步的詳細說明。本發(fā)明的實驗選用的材料供試線蟲包括19個禾谷孢囊線蟲群體，11個菲利普孢囊線蟲群體，3個大豆孢囊線蟲群體，12個豌豆孢囊線蟲群體，5個旱稻孢囊線蟲群體，I個大麥孢囊線蟲群體，I個松材線蟲群體，I個馬鈴薯腐爛莖線蟲群體，I個香蕉穿孔線蟲群體，共計54個線蟲群體。其中17個小麥禾谷孢囊線蟲群體為本實驗室長期從山東省、青海省、河南省、甘肅省、北京等地收集保存且繁殖在小麥上的孢囊線蟲種群，9個菲利普孢囊線蟲群體為本實驗室從河南等省市收集保存，2個小麥禾谷孢囊線蟲國外群體，2個菲利普孢囊線蟲國外群體以及其他線蟲群體為本實驗室工作人員收集。如表I所示。下述供試線蟲樣品可以對外公開發(fā)放。表I供試線蟲樣品代碼及群體來源
權利要求
1.旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.根據(jù)權利要求I所述的旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段的保守序列設計的特異性引物。
3.根據(jù)權利要求2所述的特異性引物為HeFl和HeRl，其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3>
4.旱稻孢囊線蟲SCAR標記快速分子檢測方法，其特征在于PCR反應體系中含有權利要求I或2所述的特異性引物。
5.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，所述PCR反應體系中含有特異性引物HeFl和HeRl,其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3>
6.根據(jù)權利要求5所述的檢測方法，所述PCR反應體系總體積為25μ 1，其中2. 5μ I10 X PCR 含 Mg2+的 Buffer ；2. 0μ I dNTP ；1. 0μ I 濃度為 0. I μ g/ μ I 的 HeFl, ;1. O μ I 濃度為 O. I μ g/ μ I 的 HeRl ；0. 25 μ I 濃度為 5U/ μ I 的 Taq DNA 聚合酶；I. O μ I 模板 DNA ；ddH20補足25 μ I。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測方法，其中PCR擴增程序為94°C預變性5min，然后940C 30S，54°C 30S，72°C Imin 循環(huán) 35 次，72°C延伸 lOmin，保存在 4°C條件下。
全文摘要
本發(fā)明涉及旱稻孢囊線蟲特異性RAPD和SCAR標記快速分子檢測方法，屬生物技術領域。旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標記的DNA片段，具其如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根據(jù)旱稻孢囊線蟲特異性RAPD擴增片段，設計特異性引物HeF1和HeR1，將其轉化為更加穩(wěn)定的SCAR標記片段，在SCAR標記快速分子檢測旱稻孢囊線蟲的方法中，可擴增出434bp的特異性片段。本發(fā)明提高了分子檢測靈敏度并且快速準確，在旱稻孢囊線蟲檢測以及旱稻孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102690824SQ201210200140
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權日2012年6月14日
發(fā)明者丁中, 亓曉莉, 彭德良, 彭煥, 賀文婷, 黃文坤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所