一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法。通過(guò)制備植物中期染色體，進(jìn)行免疫染色實(shí)驗(yàn)，采用三維反卷積圖像復(fù)原技術(shù)得到的三維表觀基因組核型。消除了離散的熒光信號(hào)，弱化了它們?cè)趲чg的分布，展示了清晰的表觀免疫帶紋，可以分析植物不同表觀修飾標(biāo)記的信號(hào)模式以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步闡明表觀遺傳調(diào)控在細(xì)胞分裂分化和生長(zhǎng)發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】—種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法，屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002] 繪制各類真核生物的表觀基因組圖譜的工作正在進(jìn)行，這通常包括各種修飾的組蛋白、非組蛋白或DNA甲基化在基因組上的分布，并將這些修飾與基因組功能相聯(lián)系。表觀基因組的全基因組分析可以在分子水平上通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀偶聯(lián)DNA測(cè)序技術(shù)(Chromatin immunopreci tat ion-sequencing, ChlP-seq)或結(jié)合 DNA 微陣列技術(shù)(ChlP-chip)得到揭示。但真核生物基因組中含有大量的重復(fù)序列會(huì)阻礙基因組測(cè)序分析，并且這種技術(shù)不能辨別處在細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞，這樣獲得的數(shù)據(jù)代表一些基因不同表達(dá)模式的細(xì)胞群體或處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞群體所產(chǎn)生的平均值。這種細(xì)胞間的異質(zhì)性必然會(huì)限制關(guān)聯(lián)染色質(zhì)功能與組蛋白修飾的精確性，而且這些技術(shù)只能應(yīng)用于已經(jīng)測(cè)序或者已經(jīng)有芯片開發(fā)的物種。
[0003]現(xiàn)在這些問(wèn)題可通過(guò)免疫染色技術(shù)來(lái)檢測(cè)單細(xì)胞水平的表觀修飾的分布情況來(lái)解決。在有絲分裂中期很少或幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)錄，這樣消除了細(xì)胞間的差異性，細(xì)胞間的免疫標(biāo)記一致性也可以重復(fù)分析。免疫中期染色體能在單細(xì)胞中分析整個(gè)表觀基因組，包括難以用基于測(cè)序方法達(dá)到的重復(fù)序列富集的區(qū)域，并且結(jié)合4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino_2-phenylindole, DAPI)染色 / 突光原位雜交技術(shù)(Fluorescence insitu hybridization,FISH)技術(shù)能識(shí)別單個(gè)染色體/某些染色質(zhì)區(qū)域的表觀修飾情況。盡管染色體顯微技術(shù)比Chip-seq技術(shù)的分子分辨率低，但是它將提供一種有價(jià)值的表觀圖譜的補(bǔ)充方法和途徑，兩者相互補(bǔ)充。用表觀修飾抗體進(jìn)行的中期染色體免疫標(biāo)記能夠在顯微鏡下觀察和研究亞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和染色體水平的表觀修飾分布，這也被稱為表觀基因組核型(Genome Biol.2010，11，R110)。
[0004]植物染色體由于與動(dòng)物染色體結(jié)構(gòu)的差異，植物中一些顯帶技術(shù)并沒(méi)有產(chǎn)生很好的帶型，一些緊密相鄰的多條熒光帶不能分辨出來(lái)。因此，用表觀修飾的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記時(shí)只能觀察到大致的分布趨勢(shì)，并沒(méi)有像動(dòng)物中呈現(xiàn)出帶紋。借助計(jì)算機(jī)進(jìn)行的圖像處理與分析技術(shù)的發(fā)展，尤其是反卷積圖像復(fù)原技術(shù)為我們完善顯帶技術(shù)并在植物中獲得清晰的帶紋提供了機(jī)會(huì)(Chromosoma 2004，113，16)。圖像模糊是由于光學(xué)顯微系統(tǒng)中點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF)造成的，反卷積圖像復(fù)原技術(shù)是以這個(gè)概念為基礎(chǔ),運(yùn)用反卷積算法，對(duì)所得到的比較模糊的圖像進(jìn)行復(fù)原，能夠顯著提高寬場(chǎng)熒光顯微鏡所得圖像的分辨率。因此如果能將反卷積圖像復(fù)原技術(shù)運(yùn)用于植物中期染色體表觀基因組核型分析中，可以清晰地得到植物中表觀修飾標(biāo)記的信號(hào)模式以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法，該方法能夠顯著提高寬場(chǎng)熒光顯微鏡所得圖像的分辨率，在植物中期染色體中獲得清晰的帶紋，本方法操作簡(jiǎn)單、方便易行。
[0006]本發(fā)明提供的植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法，包括如下步驟: 制備植物中期染色體；使用不同的表觀修飾抗體，進(jìn)行傳統(tǒng)的免疫染色實(shí)驗(yàn)；拍照，圖
像處理；然后進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，利用不同的探針進(jìn)行染色體的識(shí)別。
[0007]所述免疫染色實(shí)驗(yàn)拍照以及圖像處理具體包括如下步驟:首先通過(guò)測(cè)量染色體的高度，設(shè)置步長(zhǎng)，通過(guò)控制Z軸步進(jìn)器，對(duì)染色體逐層掃描，采集到一組二維圖像，用Metamorph軟件的No Neighbors deconvolution程序,對(duì)這組圖像進(jìn)行反卷積處理，去模糊復(fù)原，接著用Meta morph軟件的3D Reconstruction,對(duì)這些復(fù)原的圖像沿Z軸進(jìn)行三維重建，這樣更反映了染色體表觀帶紋的真實(shí)形態(tài)。顯微鏡鏡頭的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)通常由激發(fā)光波長(zhǎng)、鏡頭數(shù)值孔徑、圖像像素距離、介質(zhì)折射率等決定。其中，圖像像素距離和介質(zhì)折射率是顯微鏡中固定的數(shù)值。一般Olympus IOOX鏡頭數(shù)值孔徑為1.35，然后根據(jù)樣品中所用的熒光染料的激發(fā)光波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行設(shè)置，處理DAPI染色形成的圖像時(shí)激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)為488 nm,FITC的為520 nm。然后再根據(jù)染色體的厚度，染色的深淺，信號(hào)的強(qiáng)弱，曝光時(shí)間的長(zhǎng)短等其他因素來(lái)進(jìn)一步調(diào)整程序中的一些參數(shù)，進(jìn)行反卷積處理。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果:
本發(fā)明采用三維反卷積圖像復(fù)原技術(shù)得到的三維表觀基因組核型，消除了離散的熒光信號(hào)，弱化了它們?cè)趲чg的分布，展示了清晰的表觀免疫帶紋。并且結(jié)合FISH技術(shù)，可以識(shí)別出染色體，進(jìn)一步分析FISH定位的一些重復(fù)序列中的表觀修飾的情況，可以作為ChlP-seq—個(gè)互補(bǔ)的手段，可以分析植物不同表觀修飾標(biāo)記的信號(hào)模式以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。
[0009]
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1玉米中期染色體DAPI染色的原始圖像,標(biāo)尺=10 V- mo
[0011]圖2玉米中期染色體H3K4me2免疫染色的原始圖像,標(biāo)尺=10 u m0
[0012]圖3玉米中期染色體DAPI染色和H3K4me2免疫染色的合成圖像，標(biāo)尺=10 u m。
[0013]圖4對(duì)圖1中DAPI染色原始圖像進(jìn)行反卷積二維重構(gòu)復(fù)原信號(hào)圖像，標(biāo)尺=10U m0
[0014]圖5對(duì)圖2中H3K4me2免疫染色的原始圖像進(jìn)行反卷積三維重構(gòu)復(fù)原信號(hào)圖像，標(biāo)尺=10 U mo
[0015]圖6對(duì)圖3中玉米中期染色體DAPI染色和H3K4me2免疫染色的合成圖像進(jìn)行反卷積三維重構(gòu)圖像,標(biāo)尺=10 u m。
[0016]圖7通過(guò)四個(gè)探針(TAG、CentC,45s rDNA、knob 180-bp)和DAPI染色來(lái)識(shí)別中期染色體，標(biāo)尺=10 U m。
[0017]圖8 FISH核型模式圖， N0R:核仁組織區(qū)。
[0018]圖9 H3K4me2的免疫染色核型模式圖。
【具體實(shí)施方式】[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例中的圖片通過(guò)熒光顯微鏡(OlympusBX-60)觀察，電荷稱合器件(charge coupled device, CCD)和Metamorph軟件進(jìn)行圖像捕獲而獲得。圖中標(biāo)尺(Bar) =10 u mo
[0020]實(shí)施例1:
1)制備玉米中期染色體于載玻片上；
2)制好的片子于60°C烤片I h，在載玻片上加50耵的3%牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA)，蓋上蓋玻片，37 °C封阻I h。揭去蓋玻片，將載玻片放于I X磷酸緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)溶液中洗3次,每次洗5 min。在載玻片上加50耵的H3K4me2的抗體(I耵抗體+49耵的3% BSA)，蓋上蓋玻片，4 °C孵育過(guò)夜。揭去蓋玻片，將載玻片放于I X PBS溶液中洗3次，每次洗5 min。在載玻片上加50 W 二抗(I W抗體+49耵的3% BSA)，蓋上蓋玻片，37 °C孵育I h。揭去蓋玻片，將載玻片放于I XPBS溶液中洗3次，每次洗5 min。 [0021]3)載玻片避光晾干后，加15 ill的DAPI，并蓋上蓋玻片，使用Olympus BX60熒光顯微鏡觀察信號(hào)，Cool Snap HQ2 C⑶相機(jī)捕捉信號(hào)，MetaMorph軟件記錄結(jié)果。首先通過(guò)測(cè)量染色體的高度，設(shè)置步長(zhǎng)，步長(zhǎng)為0.1 y m，通過(guò)控制Z軸步進(jìn)器，對(duì)染色體逐層掃描，采集到一組二維圖像，用Metamorph軟件的No Neighbors deconvolution程序，對(duì)這組圖像進(jìn)行反卷積處理，去模糊復(fù)原，接著用Metamorph軟件的3D Reconstruction,對(duì)這些復(fù)原的圖像沿Z軸進(jìn)行三維重建，這樣更反映了染色體表觀帶紋的真實(shí)形態(tài)，如圖1-6所示。顯微鏡鏡頭的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)通常由激發(fā)光波長(zhǎng)、鏡頭數(shù)值孔徑、圖像像素距離、介質(zhì)折射率等決定。其中，圖像像素距離和介質(zhì)折射率是顯微鏡中固定的數(shù)值。一般Olympus IOOX鏡頭數(shù)值孔徑為1.35，然后根據(jù)樣品中所用的熒光染料的激發(fā)光波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行設(shè)置，處理DAPI染色形成的圖像時(shí)激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)為488 nm，F(xiàn)ITC的為520 nm。然后再根據(jù)染色的深淺，信號(hào)的強(qiáng)弱，曝光時(shí)間的長(zhǎng)短等其他因素來(lái)進(jìn)一步調(diào)整程序中的一些參數(shù)，進(jìn)行反卷積處理。圖4、圖 5 中所得的結(jié)果,其參數(shù)設(shè)置為 Filter size = 12, scaling factor = 0.99, resultscale = 10。其中scaling factor設(shè)置值越大,則圖像反卷積程度越高,但是圖像本身留下來(lái)的熒光值也越低。
[0022]4)做完免疫染色之后，鏡檢過(guò)的片子用IXPBS溶液中洗3次，每次洗5 min，洗掉片子上的DAPI。在載玻片上加50 W的乙醇:冰乙酸(3:1)固定液，固定10 min。放入-20°C酒精梯度中，依次為70%，95%和100%的酒精，各脫水5 min，于空氣中晾干。然后進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)，載玻片放在70%的甲酰胺變性液(35 ml甲酰胺，5 ml 20XSSC, 10ml滅菌的雙蒸水)中，90 °C變性2.5 min。取出載玻片后即放入_20 °C酒精梯度中，依次為70%，95%和100%的酒精，各脫水5 min，于空氣中晾干。探針雜交液:配制雜交液(去離子甲酰胺:15 20X SSC:3 W，鮭魚精DNA:3 W，硫酸葡聚糖:6 W，探針:3 W)，75 V變性5 min，取出后立即放入冰上，至少5 min。雜交:將雜交液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，放入濕皿中，37 °C雜交過(guò)夜。揭去蓋玻片，將載玻片放于2XSSC溶液中，洗5 min。在載玻片上加50耵一抗(I耵抗體+49耵的0.5 % BSA)，蓋上蓋玻片，4 °C孵育過(guò)夜。揭去蓋玻片，將載玻片放于IXPBS溶液中洗3次，每次洗5 min。鏡檢觀察，拍照。用四個(gè)探針進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)(TAG信號(hào)擬為白色，CentC信號(hào)擬為綠色，45s rDNA信號(hào)擬為黃色和knob180-bp信號(hào)擬為紅色)，如圖7所示。根據(jù)以前的研究結(jié)果，按染色體長(zhǎng)度、臂比來(lái)區(qū)分，著絲粒信號(hào)主要用來(lái)明確長(zhǎng)臂和短臂的位置。I號(hào)染色體最長(zhǎng)，10號(hào)染色體最短，5號(hào)染色體為等臂，8號(hào)染色體長(zhǎng)臂和短臂的臂比最大(I:3)。然后6號(hào)染色體上有45s rDNA信號(hào)，I號(hào)染色體長(zhǎng)臂、2號(hào)染色體兩臂、4號(hào)染色體短臂上有微衛(wèi)星TAG的信號(hào)，9號(hào)和10號(hào)染色體長(zhǎng)短相差不大，但是9號(hào)染色體短臂上有knob信號(hào)，而10號(hào)染色體上沒(méi)有來(lái)區(qū)分。根據(jù)這些特征，識(shí)別出10條染色體。
[0023]5)通過(guò)染色體的識(shí)別，繪制出FISH核型模式圖，如圖8所示，H3K4me2的免疫染色核型模式圖，如圖9所示，可以進(jìn)一步分析每條染色體的表觀修飾情況以及熒光原位雜交定位的一些重復(fù)序列中的表觀修飾情況。
[0024]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本`發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種植物中期染色體表觀基因組核型的分析方法，其特征在于包括如下步驟: a.制備植物中期染色體； b.使用表觀修飾抗體，進(jìn)行傳統(tǒng)的免疫染色實(shí)驗(yàn)； c.使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，拍照，記錄結(jié)果； 采用三維反卷積圖像復(fù)原技術(shù)，對(duì)c步所得的結(jié)果進(jìn)行圖像處理，得到三維表觀基因組核型； e.進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，利用不同的探針進(jìn)行染色體的識(shí)別，拍照，記錄結(jié)果，并繪制出染色體核型的模式圖； f.根據(jù)熒光原位雜交的結(jié)果，繪制出三維表觀基因組核型的模式圖，并進(jìn)一步分析每條染色體的表觀修飾情況以及熒光原位雜交定位的一些重復(fù)序列中的表觀修飾情況。
2.如權(quán)利要求1所述的植物中期染色體三維表觀基因組核型的分析方法，其特征在于:所述免疫染色實(shí)驗(yàn)拍照以及圖像處理具體包括如下步驟: a.首先通過(guò)測(cè)量染色體的高度，設(shè)置步長(zhǎng)，通過(guò)控制Z軸步進(jìn)器，對(duì)染色體逐層掃描，采集到一組二維圖像； b、用Metamorph軟件的NoNeighbors deconvolution程序,對(duì)這組圖像進(jìn)行反卷積處理，去模糊復(fù)原； C、接著用Metamorph軟件的3D Reconstruction,對(duì)這些復(fù)原的圖像沿Z軸進(jìn)行三維重建。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103614480SQ201310647518
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】李立家, 何世斌, 顏?zhàn)R涵, 王璞, 王翔伍 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)