本發(fā)明涉及玉米穗軸顏色的早期分子鑒定，特別是涉及用于玉米穗軸顏色早期分子鑒定的分子標記的高通量檢測。
背景技術(shù)：
：玉米穗軸穎片的花青苷顯色與顯色強度是玉米DUS(特異性、一致性和穩(wěn)定性)測試的指定性狀之一。玉米穗軸顏色一般可分為紅、粉和白三種顏色。遺傳分析表明，玉米穗軸顏色為質(zhì)量性狀，紅軸相對于白軸為顯性。玉米紅軸品種脫粒后籽粒外觀品質(zhì)優(yōu)良，外觀性狀較好，農(nóng)民通常傾向于穗軸顏色為紅色的玉米品種，從而影響玉米種業(yè)公司的品種銷售。另外，紅軸的表型更有利于其他優(yōu)勢基因的表達，紅軸品種的抗性一般也較好。因此，玉米穗軸顏色的早期鑒定具有重要意義。玉米P1基因編碼Myb類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控色素合成途徑，負責穗軸穎片、籽粒種皮及其他花器官的花青苷色素的合成，是決定玉米穗軸顏色的遺傳因子。P1基因位于玉米染色體1的48,117,497至48,128,047(玉米參考基因組B73V3版本位置)區(qū)段內(nèi)。然而，目前玉米穗軸顏色的鑒定一般是在玉米成熟后直接觀測表型，還沒有鑒定出與玉米穗軸顏色相關(guān)的分子標記物，也沒有鑒定出與玉米P1基因相關(guān)的分子標記物用于玉米穗軸顏色的早期高通量檢測。因此，亟待開發(fā)適合早期高通量檢測與玉米穗軸顏色相關(guān)的分子標記物，以及能夠早期高通量檢測與玉米穗軸顏色相關(guān)的分子標記物的試劑盒和方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明根據(jù)中國玉米種質(zhì)資源中玉米軸色基因(P1基因)位點的單核苷酸多態(tài)性(SNP)信息，篩選出了適合早期高通量檢測玉米穗軸顏色的玉米軸色基因位點的SNP作為分子標記物，并且設(shè)計出了用于檢測所篩選的SNP的標記引物，以及相應的檢測分型方法，可以用于玉米穗軸顏色的早期分子鑒定與分子標記物的輔助選擇。一方面，本發(fā)明提供了適合早期高通量檢測玉米穗軸顏色的玉米軸色基因(P1基因)位點的一種或者多種SNP分子標記物，所述SNP分子標記物選自表3中所列的如下SNP標記物：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277，以玉米參考基因組B73V3版本染色體1為準，所述A003264對應的位置為47,777,278，等位位點1為T，等位位點2為C；A003265對應的位置為47,830,510，等位位點1為T，等位位點2為G；A003268對應的位置為47,910,083，等位位點1為A，等位位點2為G；A003269對應的位置為47,911,654，等位位點1為A，等位位點2為C；A003270對應的位置為47,993,442，等位位點1為A，等位位點2為G；A003271對應的位置為47,993,818，等位位點1為T，等位位點2為C；A003272對應的位置為47,997,446，等位位點1為G，等位位點2為C；A003273對應的位置為48,286,764，等位位點1為A，等位位點2為G；A003274對應的位置為48,416,761，等位位點1為T，等位位點2為C；A003277對應的位置為48,528,055，等位位點1為T，等位位點2為C。SNP位點等位基因型分型有三種：等位基因1純合型，等位基因2純合型，等位基因1和等位基因2雜合型。另一方面，本發(fā)明提供了用于早期高通量檢測玉米穗軸顏色的方法，所述方法包括從待檢測的玉米品種獲得的核酸樣品中鑒定至少一種選自表3中所列的如下SNP標記物：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)已知序列的具體SNP位點選擇鑒定方法，所述方法例如可以是：直接測序、等位基因-特異性探針雜交、等位基因-特異性引物延伸、等位基因-特異性擴增。具體的鑒定試劑可以選自例如等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。優(yōu)選地，本發(fā)明中的鑒定試劑包括等位基因特異性引物。所述特異性引物可以是選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GTCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTT(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTC(SEQIDNO:2)，通用引物：GAGGTGTTGCTGGAGTGATTGAT(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAC(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAA(SEQIDNO:5)，通用引物：GGAGAAGCAAAATATGGCGTAGCA(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGGTACGAATCCAGTGAAGCA(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AGGTACGAATCCAGTGAAGCG(SEQIDNO:8)，通用引物：TAGCTCCGGCCTGCACG(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGC(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGCAGCCCAAATTCAATCAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGC(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CTCTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGT(SEQIDNO:14)，通用引物：CTAGCCGGGTCACCCAAT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCCAGCAGGCAGCATAAATGT(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCAGCAGGCAGCATAAATGC(SEQIDNO:17)，通用引物：GATCGGGGACGCCGCTAA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTGGACTCGTCCCTCTTCG(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTTGGACTCGTCCCTCTTCC(SEQIDNO:20)，通用引物：GGCTCTTTCCCTTGTTTGTTGT(SEQIDNO:21)；(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAA(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAG(SEQIDNO:23)，通用引物：AACGACGGAGATGCAAACAGAAT(SEQIDNO:24)；(9)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTAAACATCGCTGCCCG(SEQIDNO:25)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGTAAACATCGCTGCCCA(SEQIDNO:26)，通用引物：AGTAGGACTTGGCTTATTTGGTTCGT(SEQIDNO:27)；和(10)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCGGCACATGACAAATCTGT(SEQIDNO:28)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCGGCACATGACAAATCTGC(SEQIDNO:29)，通用引物：GCTGGCATTTCTATAAGAGGGCA(SEQIDNO:30)。另外，在已知玉米軸色基因(P1基因)位點的特定SNP標記物的前提下，采用引物常規(guī)設(shè)計規(guī)則來設(shè)計擴增該段序列的引物，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是普遍掌握的常規(guī)技能，本發(fā)明的檢測方法不限于采用哪些特異性引物組。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)表3中所列的如下SNP標記物：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277可以設(shè)計出不同的引物對，但都是基于本發(fā)明提供了上述SNP標記物這個前提，因此都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明提供了選自表3中的如下SNP標記物：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277的一種或者多種在早期鑒定玉米穗軸顏色中的應用。另一方面，本發(fā)明提供了篩選玉米軸色基因(P1基因)位點與玉米穗軸顏色相關(guān)的SNP分子標記物的方法，所述方法包括如下步驟：(1)選擇玉米軸色基因(P1基因)區(qū)段附近的SNP；(2)根據(jù)所選擇的SNP，基于LGC公司的KASPMasterMix試劑盒設(shè)計對應于每個SNP的KASP引物組；(3)以玉米基因組DNA作為模板，利用步驟(2)設(shè)計的KASP引物組進行PCR擴增；(4)對經(jīng)PCR擴增后的SNP位點進行基因分型，尋找基因分型成功的SNP標記物；以及(5)將基因分型成功的SNP標記物與有統(tǒng)計學意義的數(shù)量的已知軸色表型的樣品進行對比，進行T-TEST計算，選擇差異達到極顯著水平的P<0.01的SNP分子標記物作為與玉米穗軸顏色相關(guān)的SNP分子標記物。優(yōu)選地，所述與玉米穗軸顏色相關(guān)的SNP分子標記物為選自表3中的玉米軸色基因(P1基因)位點的如下SNP標記物的一種或者多種：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277。另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定選自表3中的如下SNP標記物的等位基因特異性引物組：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277。所述等位基因特異性引物組可以是根據(jù)LGC公司的KASPMasterMix試劑盒設(shè)計的KASP引物組，例如，可以是選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GTCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTT(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTC(SEQIDNO:2)，通用引物：GAGGTGTTGCTGGAGTGATTGAT(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAC(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAA(SEQIDNO:5)，通用引物：GGAGAAGCAAAATATGGCGTAGCA(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGGTACGAATCCAGTGAAGCA(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AGGTACGAATCCAGTGAAGCG(SEQIDNO:8)，通用引物：TAGCTCCGGCCTGCACG(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGC(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGCAGCCCAAATTCAATCAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGC(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CTCTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGT(SEQIDNO:14)，通用引物：CTAGCCGGGTCACCCAAT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCCAGCAGGCAGCATAAATGT(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCAGCAGGCAGCATAAATGC(SEQIDNO:17)，通用引物：GATCGGGGACGCCGCTAA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTGGACTCGTCCCTCTTCG(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTTGGACTCGTCCCTCTTCC(SEQIDNO:20)，通用引物：GGCTCTTTCCCTTGTTTGTTGT(SEQIDNO:21)；(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAA(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAG(SEQIDNO:23)，通用引物：AACGACGGAGATGCAAACAGAAT(SEQIDNO:24)；(9)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTAAACATCGCTGCCCG(SEQIDNO:25)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGTAAACATCGCTGCCCA(SEQIDNO:26)，通用引物：AGTAGGACTTGGCTTATTTGGTTCGT(SEQIDNO:27)；和(10)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCGGCACATGACAAATCTGT(SEQIDNO:28)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCGGCACATGACAAATCTGC(SEQIDNO:29)，通用引物：GCTGGCATTTCTATAAGAGGGCA(SEQIDNO:30)。另外，在已知玉米軸色基因(P1基因)位點的特定SNP標記物的前提下，采用引物常規(guī)設(shè)計規(guī)則來設(shè)計擴增該段序列的引物，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是普遍掌握的常規(guī)技能，本發(fā)明的檢測方法不限于采用哪些特異性引物組。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)表3中所列的如下SNP標記物：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277可以設(shè)計出不同的引物對，但都是基于本發(fā)明提供了上述SNP標記物這個前提，因此都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定選自表3中的如下SNP標記物的試劑盒：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277，所述試劑盒包含選自如下的試劑：等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。優(yōu)選地，所述試劑盒包含等位基因特異性引物組。進一步優(yōu)選地，所述等位基因特異性引物組為選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GTCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTT(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTC(SEQIDNO:1)，通用引物：GAGGTGTTGCTGGAGTGATTGAT(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAC(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAA(SEQIDNO:5)，通用引物：GGAGAAGCAAAATATGGCGTAGCA(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGGTACGAATCCAGTGAAGCA(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AGGTACGAATCCAGTGAAGCG(SEQIDNO:8)；通用引物：TAGCTCCGGCCTGCACG(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGC(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGCAGCCCAAATTCAATCAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGC(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CTCTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGT(SEQIDNO:14)，通用引物：CTAGCCGGGTCACCCAAT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCCAGCAGGCAGCATAAATGT(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCAGCAGGCAGCATAAATGC(SEQIDNO:17)，通用引物：GATCGGGGACGCCGCTAA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTGGACTCGTCCCTCTTCG(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTTGGACTCGTCCCTCTTCC(SEQIDNO:20)，通用引物：GGCTCTTTCCCTTGTTTGTTGT(SEQIDNO:21)；(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAA(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAG(SEQIDNO:23)，通用引物：AACGACGGAGATGCAAACAGAAT(SEQIDNO:24)；(9)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTAAACATCGCTGCCCG(SEQIDNO:25)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGTAAACATCGCTGCCCA(SEQIDNO:26)，通用引物：AGTAGGACTTGGCTTATTTGGTTCGT(SEQIDNO:27)；和(10)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCGGCACATGACAAATCTGT(SEQIDNO:28)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCGGCACATGACAAATCTGC(SEQIDNO:29)，通用引物：GCTGGCATTTCTATAAGAGGGCA(SEQIDNO:30)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)具體的SNP標記物設(shè)計其它適于本發(fā)明用于檢測本發(fā)明的SNP標記物的等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針，只要等位基因特異性寡核苷酸、DNA探針和RNA探針能夠與所述SNP標記物進行等位基因特異性雜交。優(yōu)選地，所述試劑固定在基質(zhì)上。進一步優(yōu)選地，所述試劑排列在陣列上。另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定表3中的一種或者多種如下SNP標記物的試劑在早期鑒定玉米穗軸顏色中的應用：A003264、A003265、A003268、A003269、A003270、A003271、A003272、A003273、A003274和A003277。優(yōu)選地，用于鑒定用于鑒定表3中的一種或者多種如下SNP標記物的試劑選自：等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。優(yōu)選地，所述等位基因特異性引物為選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GTCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTT(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCACTGTCCACTTCATTCTCAGTTC(SEQIDNO:2)，通用引物：GAGGTGTTGCTGGAGTGATTGAT(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAC(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TCCACTGCACTGCTACCAAGAA(SEQIDNO:5)，通用引物：GGAGAAGCAAAATATGGCGTAGCA(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGGTACGAATCCAGTGAAGCA(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AGGTACGAATCCAGTGAAGCG(SEQIDNO:8)，通用引物：TAGCTCCGGCCTGCACG(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTGTGCATTTCAATGTAGATTAGGC(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGCAGCCCAAATTCAATCAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGC(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CTCTACTAGTCTACTACGATTTGGAACAGT(SEQIDNO:14)，通用引物：CTAGCCGGGTCACCCAAT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCCAGCAGGCAGCATAAATGT(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCAGCAGGCAGCATAAATGC(SEQIDNO:17)，通用引物：GATCGGGGACGCCGCTAA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TTGGACTCGTCCCTCTTCG(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TTTGGACTCGTCCCTCTTCC(SEQIDNO:20)，通用引物：GGCTCTTTCCCTTGTTTGTTGT(SEQIDNO:21)；(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAA(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGACACTTTGGCGTGTAGTAGTAG(SEQIDNO:23)，通用引物：AACGACGGAGATGCAAACAGAAT(SEQIDNO:24)；(9)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTAAACATCGCTGCCCG(SEQIDNO:25)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGTAAACATCGCTGCCCA(SEQIDNO:26)，通用引物：AGTAGGACTTGGCTTATTTGGTTCGT(SEQIDNO:27)；和(10)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-TCCGGCACATGACAAATCTGT(SEQIDNO:28)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CCGGCACATGACAAATCTGC(SEQIDNO:29)，通用引物：GCTGGCATTTCTATAAGAGGGCA(SEQIDNO:30)。除非另有定義，否則在本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語，具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員通常理解的相同的意義?！癝NP”，即“單核苷酸多態(tài)性”是指基因組中單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性。“等位基因”是指位于一對同源染色體的給定基因座位置上的一對基因。SNP等位基因就是表征所述SNP的兩個核苷酸?！暗任换蛱禺愋怨押塑账帷笔侵概c包含單核苷酸變異的等位基因靶核苷酸雜交的寡核苷酸?！暗任换蛱禺愋噪s交”是指當?shù)任换蛱禺愋怨押塑账崤c其靶核酸雜交時，所述等位基因特異性寡核苷酸與包含單核苷酸變異的等位基因靶核苷酸特異性堿基配對?！暗任换蛱禺愋砸铩笔侵改苡糜跀U增包含單核苷酸變異的等位基因靶核苷酸的特異性引物。本發(fā)明所鑒定的SNP分子標記物、用于檢測所述SNP分子標記物的引物以及相應的檢測分型方法具有通量高，成本低，準確率高的特點，為分子標記法輔助選擇不同軸色的玉米后代提供了新的技術(shù)手段，可以用于玉米穗軸顏色的早期分子鑒定。附圖說明圖1顯示了KASP法檢測樣品中成功分型的各基因型點簇分布圖。圖2顯示了玉米染色體1上根據(jù)本發(fā)明鑒定的10個SNP標記物與P1基因的物理連鎖關(guān)系(基因組位V3)。具體實施方式下面結(jié)合實施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步描述。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實施例1玉米軸色基因(P1基因)位點的SNP分子標記物的選擇P1基因位于玉米染色體1的48,117,497至48,128,047區(qū)段內(nèi)(參考玉米基因組B73V3版本的位置)，從中玉金標記玉米56KSNP芯片上，在47,706,976和48,656,129區(qū)間內(nèi)選擇10個SNP位點進行標記物開發(fā)，見表1。表1與P1基因相連鎖的SNP位點信息(染色體位置為玉米參考基因組B73V3版本位置)位點名稱染色體號染色體位置(V3)等位位點1等位位點2PZE-101064724147,777,278TCPZE-101064790147,830,510TGPZE-101064805147,910,083AGPZE-101064865147,911,654ACPZE-101064883147,993,442AGPZE-101064893147,993,818TCZM013299-0478147,997,446GCPZE-101064994148,286,764AGPZE-101065040148,416,761TCPZE-101065132148,528,055TC根據(jù)市售獲得的LGC公司的KASPMasterMix檢測試劑盒，采用Primer3引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計，設(shè)計結(jié)果見表2，共設(shè)計了10個KASP標記物引物組，每個標記物引物組包含特異引物1、特異引物2和通用引物，其中特異引物1和特異引物2的5’端分別連接了Allele-1tail和Allele-2tail。Allele-1tail和Allele-2tail這兩條加尾序列分別標記了FAM和HEX熒光基團，具體序列顯示如下：Allele-1tail：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAllele-2tail：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT表2標記物引物組設(shè)計實施例2高通量檢測玉米軸色基因P1位點的SNP分子標記物采用實施例1設(shè)計的10個KASP引物組，以玉米基因組DNA作為模板，經(jīng)PCR擴增后對SNP位點進行分析。1.提取樣品基因組DNA：按TIANGEN公司提供的植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號：DP-305)，并按照試劑盒說明書提取供試玉米樣品基因組DNA，具體步驟如下：(1)在液氮中研磨100mg新鮮或20℃冷凍的樣品材料；(2)將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預裝有700μl，65℃預熱的緩沖液GP1的離心管中，所述緩沖液GP1中含有終濃度為0.1wt％的巰基乙醇，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65℃水浴20分鐘，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；(3)加入700μl氯仿，充分混勻，12,000rpm離心5min；注：若提取富含多酌或淀粉的植物組織，可在第3步前，用酚:氯仿(1:1)進行等體積抽提；(4)小心的將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管，加入700μl的緩沖液GP2，充分混勻；(5)將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3，12,000rpm離心30s，棄掉廢液；(6)向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液GD(使用前檢查是否己加入無水乙醇)，12,000rpm離心30s，棄掉廢液；(7)向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW(使用前檢查是否己加入無水乙醇)，12,000rpm離心30s，倒掉廢液；(8)重復步驟(7)；(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(10)將吸附柱CB3放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量50-200μl洗脫緩沖液TE(pH值在7.0-8.5之間)，室溫放置2-5min。12000rpm離心2min收集DNA溶液；以及(11)用紫外分光光度計檢測DNA的含量及純度，結(jié)果顯示所測樣品A260/280介于1.8～2.0之間，表明所提取的DNA純度較高。2.PCR擴增：以步驟1制得的基因組DNA為模板，DNA稀釋及轉(zhuǎn)板在TECAN液體自動化工作站上進行；PCR整個過程在DouglasScenfiticArrayTape平臺上完成；在Nexar工作站上將DNA和PCRmix加入384PCR反應ArrayTape中；在Soellex水浴中完成PCR反應；在Araya上完成檢測熒光強度，讀取數(shù)據(jù)；在Intellics管理系統(tǒng)中完成程序設(shè)定和數(shù)據(jù)分析；引物的核苷酸序列如表2所示。PCR反應體系為3μl，組分如下：PCR擴增反應條件為：94℃預變性15min；第一步擴增反應，94℃預變性20秒，65℃-55℃60秒，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低1℃；第二步擴增反應，94℃預變性20秒，55℃60秒，35個循環(huán)。在Araya熒光閱讀儀上讀取熒光信號。數(shù)據(jù)讀取使用DouglasScenfitic公司Intellics軟件進行。結(jié)果分析使用DouglasScenfitic公司Intellics軟件進行。3.基因分型SNP位點等位基因型分型有三種：等位基因1純合型，等位基因2純合型，等位基因1和等位基因2雜合型。如上述2所述，對PCR擴增反應獲得的結(jié)果進行分析。參見圖1，SNP位點等位基因1純合型(簇1)、SNP位點等位基因2純合型(簇2)、等位基因1和等位基因2雜合型(簇3)，分別組成分型明確的三個群，陰性對照(簇4)沒有明顯擴增，這樣的基因型點簇分布圖對應基因分型成功的標記物，10個標記物均為基因分型成功的標記物(參見表3)。表3分型結(jié)果標記物名稱位點名稱分型結(jié)果A003264PZE-101064724成功A003265PZE-101064790成功A003268PZE-101064805成功A003269PZE-101064865成功A003270PZE-101064883成功A003271PZE-101064893成功A003272ZM013299-0478成功A003273PZE-101064994成功A003274PZE-101065040成功A003277PZE-101065132成功4.基因型與表型的關(guān)聯(lián)按照表4對上述分型成功的10個標記物的三種等位基因分型(等位基因1純合型，等位基因2純合型，等位基因1和等位基因2雜合型)分別賦予數(shù)字2，0和1。表4標記物基因型數(shù)字化參見表5，對72份已知軸色表型樣品的軸色表型與基因型進行對比，在軸色表型分組之間對標記物結(jié)果進行T-TEST計算，P<0.05說明兩組間差異達到顯著水平，P<0.01說明兩組間差異達到極顯著水平，分別計算了白色/紅色(包括粉色)、白色/紅色(不包括粉色)的P值，P值<0.01的標記物作為可用標記物。參見表6，表4所示的10個標記物P值<0.01，因此均可以用來區(qū)分玉米白/紅(粉)軸色(參見表5、表6與圖2)。圖2顯示了玉米染色體1上軸色表型與基因型成功關(guān)聯(lián)的10個標記物與P1基因的物理連鎖關(guān)系(基因組位V3)。表6基因型和軸色表型的關(guān)聯(lián)性表5軸色表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)對比備注：“2”、“0”和“1”是根據(jù)樣品基因型數(shù)字化的結(jié)果，“－”表示基因分型失敗。SEQUENCELISTING<110>中玉金標記（北京）生物技術(shù)股份有限公司<120>高通量檢測玉米軸色基因分型的方法及其試劑盒<130>PM2088YJ66CN<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>1gaaggtgaccaagttcatgctgtcactgtccacttcattctcagttt47<210>2<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>2gaaggtcggagtcaacggatttcactgtccacttcattctcagttc46<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3gaggtgttgctggagtgattgat23<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>4gaaggtgaccaagttcatgcttccactgcactgctaccaagac43<210>5<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>5gaaggtcggagtcaacggatttccactgcactgctaccaagaa43<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6ggagaagcaaaatatggcgtagca24<210>7<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>7gaaggtgaccaagttcatgctcaggtacgaatccagtgaagca43<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>8gaaggtcggagtcaacggattaggtacgaatccagtgaagcg42<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>9tagctccggcctgcacg17<210>10<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>10gaaggtgaccaagttcatgcttttgtgcatttcaatgtagattagga47<210>11<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>11gaaggtcggagtcaacggattttgtgcatttcaatgtagattaggc46<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>12cagcagcccaaattcaatcagt22<210>13<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>13gaaggtgaccaagttcatgctctactagtctactacgatttggaacagc49<210>14<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>14gaaggtcggagtcaacggattctctactagtctactacgatttggaacagt51<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>15ctagccgggtcacccaat18<210>16<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>16gaaggtgaccaagttcatgctcccagcaggcagcataaatgt42<210>17<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>17gaaggtcggagtcaacggattccagcaggcagcataaatgc41<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>18gatcggggacgccgctaa18<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>19gaaggtgaccaagttcatgctttggactcgtccctcttcg40<210>20<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>20gaaggtcggagtcaacggatttttggactcgtccctcttcc41<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>21ggctctttcccttgtttgttgt22<210>22<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>22gaaggtgaccaagttcatgctcggacactttggcgtgtagtagtaa46<210>23<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>23gaaggtcggagtcaacggattcggacactttggcgtgtagtagtag46<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>24aacgacggagatgcaaacagaat23<210>25<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>25gaaggtgaccaagttcatgctggtaaacatcgctgcccg39<210>26<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>26gaaggtcggagtcaacggattcggtaaacatcgctgccca40<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>27agtaggacttggcttatttggttcgt26<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>28gaaggtgaccaagttcatgcttccggcacatgacaaatctgt42<210>29<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>29gaaggtcggagtcaacggattccggcacatgacaaatctgc41<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>30gctggcatttctataagagggca23當前第1頁1 2 3