本發(fā)明涉及一種食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA的熒光原位雜交檢測方法。

背景技術(shù)：

LncRNA在食管鱗癌細胞株內(nèi)的原位檢測技術(shù)比較成熟，但食管鱗癌組織內(nèi)lncRNA的熒光原位雜交技術(shù)一直不成熟。由于食管鱗癌間質(zhì)內(nèi)的膠原和纖維素的限制，導(dǎo)致熒光劑殘留過多，背景染色較差，腫瘤實質(zhì)染色與間質(zhì)殘留區(qū)分不明顯。因此，食管鱗癌組織內(nèi)lncRNA的熒光原位雜交檢測技術(shù)有待進一步優(yōu)化。

食管鱗癌組織內(nèi)lncRNA的定量分析常用RT-PCR；亞細胞內(nèi)定位常用方法是核質(zhì)分離提取RNA，再進行RT-PCR定量分析。但是這些操作復(fù)雜，耗時耗力。

有學者利用BCIP/NBT、DAB等染料，對RNA原位雜交結(jié)果進行染色，以檢測食管鱗癌組織lncRNA的表達。但是腫瘤組織內(nèi)DAB染色非特異性顯色明顯，lncRNA雜交顯色成像質(zhì)量較差。尤其是對于表達豐度較低的lncRNA，BCIP/NBT染色的RNA原位雜交結(jié)果幾乎呈陰性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA的熒光原位雜交檢測方法，用于腫瘤組織內(nèi)lncRNA的表達水平及亞細胞定位檢測。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA的熒光原位雜交檢測方法，其特征在于，包括：制備冰凍食管鱗癌組織切片，進行固定、消化與通透，采用lncRNA探針進行檢測，進行DNA染色，封片，采用共聚焦顯微鏡檢測成像或熒光顯微鏡檢測成像。

進一步地，所述的lncRNA探針采用cy3標記。

進一步地，所述的食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA的熒光原位雜交檢測方法還包括：根據(jù)lncRNA成像位置，判斷l(xiāng)ncRNA是定位于細胞核還是細胞質(zhì)，還是核質(zhì)均勻表達。

進一步地，所述的食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA的熒光原位雜交檢測方法還包括：根據(jù)食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA成像的熒光光密度與內(nèi)參探針成像的的熒光光密度對比，計算lncRNA在食管鱗癌組織中的相對表達量。

進一步地，所述的lncRNA探針進行檢測的方法包括：在組織中加入預(yù)雜交液，37℃封閉45-60min；避光條件下，分別lncRNA探針和內(nèi)參探針加入到預(yù)熱37℃的雜交液中，得到lncRNA探針雜交液和內(nèi)參探針雜交液；棄去組織中的預(yù)雜交液，加入lncRNA探針雜交液或內(nèi)參探針雜交液，37℃避光雜交過夜，避光清洗組織。

進一步地，所述的DNA染色采用DAPI進行。

本發(fā)明根據(jù)ATCG堿基互補原理，探針與組織中l(wèi)ncRNA特異性結(jié)合，特異性檢測lncRNA的表達水平。DAPI為一種熒光染料，且對活細胞無毒副作用；可以與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合。應(yīng)用探針為cy3標記，在熒光激發(fā)下顯紅色熒光；DAPI在熒光激發(fā)下顯藍色熒光；兩種熒光顏色對比明顯。根據(jù)檢測目標lncRNA成像位置，判斷l(xiāng)ncRNA是定位于細胞核還是細胞質(zhì)，還是核質(zhì)均勻表達。根據(jù)目標lncRNA成像的熒光光密度與內(nèi)參lncRNA對比，可以計算lncRNA在腫瘤組織中的相對表達量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明的食管鱗癌組織內(nèi)lncRNA的熒光原位雜交技術(shù)，成本低，操作簡單，省時省力。本發(fā)明可以方便地檢測食管鱗癌組織內(nèi)lncRNA的表達水平，直觀展示lncRNA在食管鱗癌組織中的亞細胞內(nèi)定位情況。

2、lncRNA的熒光原位雜交圖像成像質(zhì)量高，可以直觀展示lncRNA的表達水平及亞細胞內(nèi)定位情況。

3、本發(fā)明可以直觀展示lncRNA在腫瘤實質(zhì)細胞中的表達情況，相比于RT-PCR，避免了腫瘤間質(zhì)細胞的干擾。

4、該技術(shù)可應(yīng)用于其他腫瘤組織內(nèi)的lncRNA檢測。

5、該技術(shù)易學易會，在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域及臨床上可大規(guī)模推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為應(yīng)用lncRNA熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測目標lncRNA及18S內(nèi)參對照在食管癌組織的表達情況圖(×1600)。

圖2為不同lncRNA原位檢測方法結(jié)果對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1：食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA的熒光原位雜交檢測方法

一、試劑準備：

1)lncRNA FISH Probe Mix存儲液(20μM)，恢復(fù)至室溫(銳博生物公司，貨號C10920)，該探針采用cy3標記。

2)U6，18s內(nèi)參FISH Probe Mix儲存液(20μM)，恢復(fù)至室溫(銳博生物公司，貨號分別為lnc110101，lnc110102)。

3)預(yù)雜交液：將適量Blocking Solution(銳博生物公司，貨號：C10903)與1×Pre-hybridization Buffer(銳博生物公司，貨號：C10901)按照1∶99混勻后，37℃孵育至透明澄清狀態(tài)后，分裝保存。使用前須在37℃氣浴或水浴中孵育至澄清透明。

注：1×Pre-hybridization Buffer從低溫取出時可能有沉淀析出，屬于正?，F(xiàn)象。

4)雜交液：將適量Blocking Solution(銳博生物公司，貨號：C10903)與1×Hybridization Buffer(銳博生物公司，貨號：C10902)按照1∶99混勻后，37℃孵育至透明澄清狀態(tài)后，分裝保存。使用前須在37℃氣浴或水浴中孵育至澄清透明。

注：1×Hybridization Buffer從低溫取出時可能有沉淀析出，屬于正常現(xiàn)象。

5)4％多聚甲醛

6)通透液(含0.5％TritonX-100的1×PBS)

7)1×PBS

8)20×SSC(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，貨號：V4261)

9)DEPC水(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：R0021)

10)雜交洗液I(4×SSC，0.1％Tween-20)(20×SSC經(jīng)DEPC水稀釋5倍)

11)雜交洗液II(2×SSC)(20×SSC經(jīng)DEPC水稀釋10倍)

12)雜交洗液III(1×SSC)(20×SSC經(jīng)DEPC水稀釋20倍)

13)1×DAPI染液(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：C1005)

14)膠原蛋白酶IV(sigma公司，貨號：C5138)

15)封片劑(指甲油)

16)防熒光猝滅劑(公司：碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：P0126)

二：實驗方法：

本實施例以食管鱗癌組織進行FISH實驗為例，具體步驟為：

1.制備冰凍食管鱗癌組織切片：

將新收取的新鮮組織在冰凍切片機上切片，厚度為6-8μm。切片放在常溫下吹晾3min(防止后面的洗脫步驟中組織脫片)。

2.進行組織固定、消化與通透：

a.1×PBS清洗組織5min；

b.4％多聚甲醛室溫固定10min；

c.1×PBS清洗組織5min，共3次；

d.膠原蛋白酶IV常溫下消化組織0.5min；

e.1×PBS清洗組織5min，共3次；

f.每塊組織上加入100μL預(yù)冷的通透液，4℃靜置通透5min；

g.棄去通透液后，加入1×PBS清洗組織5min，共3次。

3.采用lncRNA探針進行檢測：

a.每塊組織加入100μL預(yù)雜交液，37℃封閉45-60min；

b.預(yù)雜交同時，將雜交液在37℃中預(yù)熱。

c.避光條件下，分別把2.5μL 20μM lncRNA FISH Probe Mix儲存液和2.5μL 20μM內(nèi)參FISH Probe Mix儲存液加入到100μL雜交液中，得到lncRNA探針雜交液和內(nèi)參探針雜交液；

d.棄去每塊組織中的預(yù)雜交液，加入100μL lncRNA探針雜交液或內(nèi)參探針雜交液，避光，37℃雜交過夜；

注：探針雜交液的用量一般100μL即足以覆蓋，具體依據(jù)組織大小待雜交區(qū)優(yōu)化。

e.避光，50℃，雜交洗液I清洗組織3次，每次5min，以降低背景信號；

f.避光，50℃，雜交洗液II清洗組織1次，5min.

g.避光，50℃，雜交洗液III清洗組織1次，5min.

h.避光，1×PBS清洗組織1次，5min.

4.進行DNA染色

a.避光，室溫下1×DAPI染色5min.

b.避光，1×PBS清洗組織3次，每次5min.

5.指甲油封片

避光條件下，在載玻片上滴加熒光防猝滅劑，用封片劑(如指甲油)將其固定于載玻片上，進行熒光檢測。

注：小心封片，避免造成不必要的組織挫傷，封片的過程中盡量避免氣泡的產(chǎn)生。

6.共聚焦顯微鏡檢測成像：

LncRNA探針Cy3標記，發(fā)射波長570nm，激發(fā)波長550nm；DAPI激發(fā)波長364nm，發(fā)射波長454nm。

結(jié)果如圖1所示，根據(jù)lncRNA成像位置，判斷l(xiāng)ncRNA是定位于細胞核還是細胞質(zhì)，還是核質(zhì)均勻表達，請根據(jù)圖1具體解析。

本實施例中食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA成像的熒光光密度為0.805，18S內(nèi)參探針成像的熒光光密度為3.673，lncRNA在食管鱗癌組織中的相對表達量為0.219。熒光光密度通過LEICA Qwin V3(德國Leica公司)圖像分析系統(tǒng)測量，

注：也可用熒光顯微鏡檢測成像，但成像效果不佳，推薦采用共聚焦顯微鏡進行檢測成像。

圖1為應(yīng)用lncRNA熒光原位雜交技術(shù)檢測目標lncRNA及18S內(nèi)參對照在食管癌組織的表達情況圖(×1600)。DAPI主要定位于細胞核，并呈藍色，Cy3標記目標lncRNA呈紅色，主要定位于細胞質(zhì)。

圖2為不同lncRNA原位檢測方法結(jié)果對比圖。熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測結(jié)果成像清晰，lncRNA背景殘留較少，腫瘤間質(zhì)不存在非特異性染色；DAB顯色成像效果較差，且在腫瘤間質(zhì)存在非特異染色；BCIP/NBT顯色成像效果較差，且目標lncRNA顯色弱，檢測結(jié)果幾乎呈陰性。