一種重組單純皰疹病毒的肝素親和層析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒純化技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及到重組單純皰瘆病毒的肝素親和層析，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，它是已知的生物分子材料中具有最高負(fù)電荷密度的分子，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但現(xiàn)有肝素的純化方法難以工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有現(xiàn)有肝素的純化方法難以工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)之現(xiàn)狀，而提供一種有關(guān)重組單純皰瘆病毒的親和層析方法，主要分為初步純化和濃縮和高效液相色譜純化兩部分。
[0004]本發(fā)明包括如下步驟:
(I).病毒上清在雙羥色胺TuffrynR聚砜膠囊過濾設(shè)備中濾除細(xì)胞碎片；
(II).使用2L的聚醚砜膜盤式攪拌細(xì)胞超濾裝置進(jìn)行過濾濃縮，使用肝素親和吸附緩沖液進(jìn)行富集截留，濃縮液凍存于-80度冰箱；
(III).HR 5/5層析柱填裝肝素，再將濃縮后的樣品解凍裝入層析柱中；
(IV).pH 7.5、濃度為33mM的NaCl在153cm/h下線性流速洗脫；
(V).收集三個(gè)峰值洗脫液，凍存于-80度或液氮中。
[0005]步驟(I)中用到的是雙羥色胺TuffrynR聚砜膜0.45/0.2Am膠囊過濾設(shè)備。
[0006]步驟(I)中超濾裝置在工作中的外壓應(yīng)小于0.0lmPa，速度為50mL/min。
[0007]過濾器的有效面積為162平方厘米，截留分子量為30萬。
[0008]步驟(II) IL病毒上清濃縮需要20倍恒定氮?dú)鈮毫?3.5cm/s的速度。
[0009]步驟(II)中使用肝素親和吸附緩沖液，其配方為150 mM NaCl in 20 mMTris-HClbuffer, pH 7.5。
[0010]步驟(III)中適合于親和層析的層析柱填柱材料為tentacle-type FractogelREMD 肝素(S)，F(xiàn)ractogel EMD DEAE (M)，和 Fractogel EMD SO3- (M) gels。
[0011]步驟(III)中層析柱填充完后要用20mM HEPES buffer, pH 7.5緩沖液在無鹽條件下平衡。
[0012]步驟(III)中逐步洗脫所用NaCl的濃度和體積分別為150 mM，19.5倍層析柱體積的NaCl，進(jìn)行病毒獲取和漂洗；350nM，13倍層析柱體積的NaCl進(jìn)行病毒洗脫以及1200mM，7.5倍層析柱體積的NaCl進(jìn)行最終高嚴(yán)格漂洗。
[0013]步驟(IV)中洗脫液NaCl的線性流量運(yùn)行率為153cm/h。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):采用肝素親和層析就是利用它具有大量帶負(fù)電荷的硫酸基團(tuán)的分子特性，作為蛋白及病毒純化中的親和配體，選擇性地結(jié)合病毒表面蛋白分子及其它分子，然后利用不同濃度的鹽離子做梯度洗脫，以達(dá)到將病毒單獨(dú)洗脫下來的目的。重組單純皰瘆病毒具有能和肝素親和結(jié)合的性質(zhì)，因此選擇肝素親和層析柱能方便快捷的純化重組單純皰瘆病毒，并且能放大，為工業(yè)化大規(guī)模純化重組單純皰瘆病毒奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0015]附圖1:組單純皰瘆病毒的肝素親和層析方法流程圖。
[0016]附圖2:三峰值收集病毒樣品SDS-PAGE跑膠，然后考馬斯亮藍(lán)染色鑒定純化效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下內(nèi)容，為詳細(xì)的方案:
初步純化和濃縮:
1.粗純化的病毒上清在室溫下使用雙羥色胺TuffrynR聚砜膜(0.45/0.2Am)膠囊過濾設(shè)備(有效過濾面積500平方厘米)濾除任何細(xì)胞和細(xì)胞碎片，在低背壓(小于0.0lmPa)條件下50mL/min IL或2L的規(guī)模進(jìn)行超濾純化。
[0018]2.用無菌容器收集被純化過的滲透液或進(jìn)一步超濾后收集。
[0019]3.使用2 - L的攪拌細(xì)胞超濾裝置，直徑150mm的Omega聚醚砜膜盤式過濾器(有效過濾面積162平方厘米，截留分子量30萬)進(jìn)行濃縮；該膜要預(yù)先使用IL的Mill1-Q水和40mL含10% FBS的DMEM介質(zhì)清洗。
[0020]4.1L的病毒上清濃縮需要20倍的恒定氮?dú)鈮毫?30鎊)和極速(33.5 cm/s)。
[0021]5.在滲透時(shí)，使用肝素親和吸附緩沖液(150 mM NaCl in 20 mMTris-HClbuffer, pH 7.5)對病毒進(jìn)行富集截留，相同的模式反復(fù)滲透3次，每次使用緩沖液100mL。
[0022]6.將濃縮的病毒上清液分裝保存入-80度冰箱。
[0023]高效液相色譜純化:
7.濃縮的病毒上清在37度快速解凍然后用0.45um GHP Acrodisc濾膜(Pall GelmanSciences)過濾。
[0024]8.病毒純化實(shí)驗(yàn)在室溫進(jìn)行，在低壓液相色譜系統(tǒng)中(GradiFrac; GEHealthcare，Uppsala，Sweden)，使用肝素親和柱進(jìn)行層析，280nm紫外吸收監(jiān)測蛋白洗脫。將 tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，F(xiàn)ractogel EMD DEAE (M)，和 FractogelEMD SO3- (M) gels (Merck,Darmstadt,Germany)裝入HR 5/5 柱子，使終體積達(dá)到 ImL并在緩沖液中平衡:20mM HEPES buffer，pH 7.5，在無鹽條件下進(jìn)行。
[0025]9.將濃縮后的樣品(0.5mL)裝入 Fractogel packed 柱子。NaCl (pH 7.5，從 O到lOOOmM，以33mM /min速度升高)線性梯度在153cm/h的線性流速洗脫。
[0026]10.重復(fù)運(yùn)行每個(gè)柱子。以 Fractogel EMD Heparin (S) I mL column 進(jìn)行吸附和解吸條件優(yōu)化。病毒吸附和洗脫的最佳鹽濃度得以確定。
[0027]11.最后逐步洗脫，具體包括150 mM NaCl (19.5倍柱子體積)的病毒獲取和漂洗、350nM NaCl (13倍柱子體積)病毒洗脫以及1200mM NaCl (7.5倍柱子體積)最終高嚴(yán)格漂洗。線性流量運(yùn)行率為153cm/h。收集三個(gè)峰值的洗脫液，存于-80度或液氮中。
[0028]實(shí)施例1:
1.粗純化的重組單純皰瘆病毒上清在室溫下使用雙羥色胺TuffrynR聚砜膜膠囊過濾設(shè)備濾除任何細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
[0029]2.使用攪拌細(xì)胞超濾裝置進(jìn)行超濾，Omega聚醚砜膜盤式過濾器進(jìn)行濃縮。
[0030]3.在滲透時(shí)，使用肝素親和吸附緩沖液對病毒進(jìn)行富集截留，相同的模式反復(fù)滲透3次，每次使用緩沖液100mL。
[0031]4.將濃縮的病毒上清液用0.45um GHP Acrodisc濾膜過濾。
[0032]5.將 tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，F(xiàn)ractogel EMD DEAE (M)，和Fractogel EMD SO3- (M) gels (Merck，Darmstadt, Germany)裝入 HR 5/5 柱子，使終體積達(dá)到ImL并在緩沖液中平衡:20mM HEPES buffer, pH 7.5，在無鹽條件下進(jìn)行。
[0033]6.將GHP Acrodisc濾膜過濾后的樣品0.5mL裝入Fractogel packed柱子。用150 mM，19.5倍柱子體積的NaCl，進(jìn)行病毒獲取和漂洗；350nM，13倍柱子體積的NaCl進(jìn)行病毒洗脫以及1200mM ,7.5倍柱子體積的NaCl進(jìn)行最終高嚴(yán)格漂洗。線性流量運(yùn)行率為153cm/h?收集三個(gè)峰值的病毒洗脫液。
[0034]7.取病毒洗脫液部分用于SDS-PAGE檢測，其余凍存于_80度或液氮罐中。用10%分離膠，5%濃縮膠檢測純化的病毒。每管取5 UL病毒液，加5 yL 2 x SDS上樣緩沖液，100 °C沸水加熱變性5 min, 120 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)迀移到凝膠底部時(shí)，停止電泳。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，電泳染色結(jié)果見附圖2，從圖中可見在三個(gè)峰值中收集的病毒含量高，病毒溶液分離純化效果理想。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種重組單純皰瘆病毒的肝素親和層析方法，其特征在該方法包括如下步驟: (I).病毒上清在雙羥色胺TuffrynR聚砜膠囊過濾設(shè)備中濾除細(xì)胞碎片； (II).使用2L的聚醚砜膜盤式攪拌細(xì)胞超濾裝置進(jìn)行過濾濃縮，用肝素親和吸附緩沖液進(jìn)行富集截留，濃縮液凍存于-80度冰箱； (III).HR 5/5層析柱填裝肝素，再將濃縮后的樣品解凍裝入層析柱中； (IV).pH 7.5、濃度為33mM的NaCl在153cm/h下線性流速洗脫； (V).收集三個(gè)峰值洗脫液，凍存于-80度或液氮中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中用到的是雙羥色胺TufTrynR聚砜膜0.45/0.2Am膠囊過濾設(shè)備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中超濾裝置在工作中的外壓應(yīng)小于 0.0lmPa，速度為 50mL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于過濾器的有效面積為162平方厘米，截留分子量為30萬。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(II)IL病毒上清濃縮需要20倍恒定氮?dú)鈮毫?3.5cm/s的速度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(II)中使用肝素親和吸附緩沖液，其配方為 150 mM NaCl in 20 mMTris-HCl buffer，pH 7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(III)中適合于親和層析的層析柱填柱材料為 tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，F(xiàn)ractogel EMD DEAE (M)，和Fractogel EMD SO3- (M) gels。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(III)中層析柱填充完后要用20mMHEPES buffer, pH 7.5緩沖液在無鹽條件下平衡。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在步驟(III)中逐步洗脫所用NaCl的濃度和體積分別為150 mM, 19.5倍層析柱體積的NaCl，進(jìn)行病毒獲取和漂洗；350nM，13倍層析柱體積的NaCl進(jìn)行病毒洗脫以及1200mM ,7.5倍層析柱體積的NaCl進(jìn)行最終高嚴(yán)格漂洗。
10.根據(jù)權(quán)利要求1，12或13所述的方法，其特征在步驟(IV)中洗脫液NaCl的線性流量運(yùn)行率為153cm/h。
【專利摘要】一種重組單純皰疹病毒的肝素親和層析方法其步驟為：病毒上清濾除細(xì)胞碎片，使用聚醚砜膜盤式過濾器進(jìn)行濃縮；濃縮液凍存于-80度冰箱；HR 5/5柱子填裝肝素，再將濃縮后的樣品解凍裝入柱子中；洗脫。收集三個(gè)峰值洗脫液，凍存于-80度或液氮中。優(yōu)點(diǎn)：采用肝素親和層析就是利用它具有大量帶負(fù)電荷的硫酸基團(tuán)的分子特性，作為蛋白及病毒純化中的親和配體，選擇性地結(jié)合病毒表面蛋白分子及其它分子，然后利用不同濃度的鹽離子做梯度洗脫，以達(dá)到將病毒單獨(dú)洗脫下來的目的。
【IPC分類】C12R1-93, C12N7-02
【公開號】CN104845945
【申請?zhí)枴緾N201510183384
【發(fā)明人】劉為勇, 王濤
【申請人】湖北創(chuàng)瑞生物科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月18日