專利名稱：重組單純皰疹病毒、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組單純皰疹病毒，特別是涉及一種在抗腫瘤活性及腫瘤靶向性上有所改進(jìn)的單純皰疹病毒。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)提出單純皰疫病毒(herpes simplex virus, HSV)可用于溶瘤法治療癌癥，并通過剔除ICP34.5基因和ICP47基因?qū)渭儼捳畈《具M(jìn)行改進(jìn)，使其可選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而不傷害正常細(xì)胞，然而這種改進(jìn)并不能有效地使單純皰疹病毒特異性地只選擇在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而是也會有單純皰疹病毒在某些正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，從而對這些正常細(xì)胞造成傷害。如何實(shí)現(xiàn)使單純皰疹病毒特異性地只殺傷腫瘤細(xì)胞，而不破壞正常細(xì)胞一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員研究的重點(diǎn)課題。端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，其作用是維護(hù)染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，包括防止染色體末端融合，保護(hù) 染色體結(jié)構(gòu)基因和避免遺傳信息在復(fù)制中丟失。端粒酶是由小分子RNA和蛋白質(zhì)組成的逆轉(zhuǎn)錄酶，能利用自身RNA為模板合成端粒DNA，彌補(bǔ)隨細(xì)胞有絲分裂逐漸縮短的端粒。其有三個主要組成部分:人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase-as sociated protein,TP1/TLP1)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)。端粒酶 RNA 在大多數(shù)細(xì)胞中都表達(dá)，而人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶是端粒酶的限速成分，僅在端粒酶陽性的細(xì)胞中表達(dá)，與端粒酶活性相關(guān)。盡管一些腫瘤細(xì)胞在重組時通過替代性端粒延長(alternative lengthening oftelomeres, ALT)機(jī)制來維持端粒長度，但仍有85%以上的腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)hTERT來活化端粒酶，而且hTERT僅在極少數(shù)正常體細(xì)胞中表達(dá)。這就為腫瘤治療提供了一個很好的契機(jī)。單純皰疫病毒表達(dá)的感染細(xì)胞蛋白(infected cell proteins, I CPs)分為三個等級:初始(immediate early, IE)、早期(early)和晚期(late)。其中IE蛋白是影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，包括:ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，而其中ICP4是最關(guān)鍵的復(fù)制相關(guān)蛋白?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤特異性啟動子。根據(jù)其特點(diǎn)，可分為以下幾種:(I)泛腫瘤特異啟動子，指在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其功能的啟動子，如hTERT啟動子、存活素(survivin)啟動子等。(2)組織特異性啟動子，如前列腺特異性抗原(PSA)啟動子。(3)某些腫瘤特有的啟動子，如肝癌細(xì)胞特有的甲胎球蛋白(AFP)啟動子、上皮細(xì)胞腫瘤的癌胚抗原(CEA)啟動子等。這些腫瘤特異性啟動子已廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療及腫瘤診斷領(lǐng)域。若將ICP4啟動子替換為hTERT啟動子(hTERTp)或其它腫瘤特異性啟動子，使新重組單純皰疹病毒只能在hTERT高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)其早期復(fù)制蛋白ICP4，從而進(jìn)行復(fù)制增殖，殺傷腫瘤細(xì)胞，有望解決上述技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種重組單純皰疹病毒，該重組單純皰疹病毒能選擇性地在人腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，而不在人正常細(xì)胞中繁殖，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，且不傷害正常細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種上述重組單純皰疹病毒的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于，提供一種藥物組合物及其在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，以及上述重組單純皰疹病毒在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于，提供另一種重組單純皰疹病毒、其在制備診斷腫瘤的藥物中的應(yīng)用以及一種腫瘤診斷試劑盒。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的重組單純皰疹病毒，其是將含有ICP4基因的單純皰疹病毒基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp或其它腫瘤特異性啟動子。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的重組單純皰疹病毒，其微生物保藏號為CGMCC N0.6397。前述的重組單純皰疹病毒，其中該單純皰疹病毒剔除了 ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種制備前述重組單純皰疹病毒的方法，其包括以下步驟:用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp取代含有ICP4基因的單純皰疹病毒中的ICP4基因啟動子，構(gòu)建該重組單純皰疹病毒 HSV-hTERTp_ICP4:
(I)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒 pICP4del_hTERTp_ICP4 和 pICP4del_eGFP:a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并純化其基因組DNA ；b.擴(kuò)增ICP4基因上游側(cè)翼序列:以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物:ICP4USf 正向引物:CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGGICP4USr 反向引物:AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA擴(kuò)增出ICP4基因上游側(cè)翼序列；擴(kuò)增ICP4基因下游側(cè)翼序列:以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物:ICP4DSf 正向引物:AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGCICP4DSr 反向引物:AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT擴(kuò)增出ICP4基因下游側(cè)翼序列；將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP73質(zhì)粒上，構(gòu)建pICP4del及pICP4del_eGFP質(zhì)粒:將SalI酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的上游側(cè)翼序列及Sall/Hindlll雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的下游側(cè)翼序列混合并連接到pSP73的EcoRV/Hindlll位點(diǎn)，得到pICP4del ;用 EcoRI/XhoI 從 pcDNA3.1-eGFP 切下 CMV 啟動子控制的 eGFP 表達(dá)盒，經(jīng) T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pICP4del的EcoRV位點(diǎn)，得到pICP4del_eGFP ；c.分三次PCR擴(kuò)增出ICP4基因中三段序列:首先，使用以下引物:
ICP4-1st 正向引物:TTTTTTGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCC
ICP4-lst 反向引物:TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGTI CP4-2nd 正向引物:CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTGI CP4-2nd 反向引物:CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCGI CP4-3rd 正向引物:CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTGI CP4-3rd 反向引物:TTTTTTCTCGAGTTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出三段基因片段ICP4_lst、ICP4-2nd和ICP4-3ri，而后分別將該三段基因片段插入pSP73質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)構(gòu)建出以下三種質(zhì)粒 wSPTS-1CPA-l'pSPTS-1CPAj'pSPTS-1CPA-S^1，從該三種質(zhì)粒中用 EcoRI 和BsrGI 剪切出 ICP4-lst、用 BsrGI 和 PvuI 剪切出 ICP4_2nd 及用 PvuI 和 XhoI 剪切出 ICP_3rd待用；d.從含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp的質(zhì)粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代從pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV啟動子，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3_NHN 是在 pcDNA3 的 NheI 位點(diǎn)插入 Nhe1-Hap1-NheI 酶切位點(diǎn)序列所得；e.將步驟c中的該ICP4_lst、ICP4_2nd和ICP4_3ri混合并連接到步驟d中的該pcDNA3-NHN-hTERTp 的 EcoRI 及 XhoI 位點(diǎn)，得到質(zhì)粒 pcDNA3-NHN_hTERTp_ICP4 ；f.用Sail酶切步驟b中含ICP4基因上下游側(cè)翼序列的質(zhì)粒pICP4del，并補(bǔ)平末端待用，用PmeI和HpaI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3-NHN_hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表達(dá)盒片段，并將其與該酶切后待用的pICP4del質(zhì)粒連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4 ；g.構(gòu)建BHK-1CP4輔助細(xì)胞:用EcoRI和XhoI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV啟動子的下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)，得到pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒；將該pcDNA3-CMV_ICP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒DNA可重組到BHK細(xì)胞基因組中，使有些BHK重組細(xì)胞獲得對新霉素的抗性和表達(dá)ICP4，用抗菌素G418殺死未重組的BHK細(xì)胞，經(jīng)過幾輪的亞克隆篩選，用RT-PCR方法篩選出表達(dá)ICP4的BHK-1CP4輔助細(xì)胞；(2)剔除基因組中ICP4基因啟動子并插入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp啟動子:A.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并提取病毒基因組DNA ；B.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟(l)b中該質(zhì)粒pICP4del_eGFP共轉(zhuǎn)入步驟(l)g中該BHK-1CP4輔助細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pICP4del-eGFP中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒置換了該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV的ICP4基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，就能純化出重組病毒HSV-d4GFP ；C、培養(yǎng)步驟B中該HSV-d4GFP病毒，并提取基因組DNA ；D、將步驟C該重組病毒HSV-d4GFP的基因組DNA和步驟⑴f該質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4 的 DNA 共轉(zhuǎn)入該 BHK-1CP4 輔助細(xì)胞，經(jīng)同源重組，hTERTp_ICP4表達(dá)盒置換了該重組病毒HSV-d4GFP的綠色熒光蛋白表達(dá)盒GFP，使新重組病毒的毒斑不發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選無熒光毒斑，就能純化出該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP40
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其中先剔除該含有ICP4基因的單純皰疹病毒的ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種，再以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp替換ICP4基因啟動子；或在以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp替換ICP4基因啟動子得到該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4后，再剔除該重組單純皰疹病毒HSV_hTERTp_ICP4的ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種。前述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其中以其它腫瘤特異性啟動子替代該人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp。前述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其中該方法還包括對所有涉及的質(zhì)粒進(jìn)行測序以證實(shí)無突變發(fā)生的步驟。前述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其中該綠色熒光蛋白表達(dá)盒可由青色熒光蛋白表達(dá)盒、紅色熒光蛋白表達(dá)盒、黃色熒光蛋白表達(dá)盒或其它指示蛋白表達(dá)盒所替換。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的藥物組合物，其中該藥物組合物包含前述的重組單純皰疹病毒，以及藥物可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的藥物組合物，其中該藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體以及前述的重組單純皰疹病毒，每毫升所述注射液中含有IO2 IOltl個該重組單純皰疫病毒。前述的藥物組合物，其中該藥學(xué)上可接受的載體為pH值為4.0 9.0的磷酸緩沖液。前述的藥物組合物，其中該注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑；以該注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0.01 30% (重量)，所述保護(hù)劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或一種以上；每千克該注射液含有200 700毫克所述滲透壓調(diào)節(jié)劑，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的前述的重組單純皰疹病毒，或前述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的另一種重組單純皰疹病毒，其是在前述的重組單純皰疹病毒基因組中插入熒光蛋白表達(dá)盒。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的另一種重組單純皰疹病毒，其中該熒光蛋白表達(dá)盒為綠色熒光蛋白表達(dá)盒、青色熒光蛋白表達(dá)盒、紅色熒光蛋白表達(dá)盒、黃色熒光蛋白表達(dá)盒及其它指示蛋白表達(dá)盒中任一種。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的前述的另一種重組單純皰疹病毒在制備診斷腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種腫瘤診斷試劑盒，其中該腫瘤診斷試劑盒包含前述的另一種重組單純皰疹病毒。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的腫瘤診斷試劑盒，其特征在于該腫瘤診斷試劑盒檢測的樣品選自受試者全血、血漿、淋巴細(xì)胞懸浮液、骨髓、胸腔積液或腹腔積液。前述的腫瘤診斷試劑盒，其特征在于該腫瘤診斷試劑盒還包括:RPMI_1640培養(yǎng)基、PH為7的紅細(xì)胞裂解液和pH為7.2 7.4的磷酸緩沖液，其中，所述紅細(xì)胞裂解液包含
0.15M氯化銨、IOnM碳酸氫鉀和InM乙二胺四乙酸；或RPM1-1640培養(yǎng)基、比重為1.077
0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺和pH為7.2 7.4的磷酸緩沖液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明重組單純皰疹病毒、其制備方法及應(yīng)用可達(dá)到相當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)步性及實(shí)用性，并具有產(chǎn)業(yè)上的廣泛利用價(jià)值，其至少具有下列優(yōu)點(diǎn):(I)本發(fā)明的重組單純皰疹病毒相對于現(xiàn)有的皰疹病毒而言，能更有效地選擇性地在人腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，而不在人正常細(xì)胞中繁殖，從而更有效地殺傷癌細(xì)胞，保護(hù)正常細(xì)胞；(2)本發(fā)明的另一種重組單純皰疹病毒，其是在前一種重組單純皰疹病毒基因組中插入了熒光蛋白表達(dá)盒，其能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)光，所以可更快速、準(zhǔn)確、靈敏并廣譜地實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷以及腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷。本發(fā)明獲得的重組單純皰疹病毒的 分類命名為I型單純皰疹病毒，拉丁文學(xué)名為Herpes Simplex Virus Type 1，于2012年8月14日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCN0.6397。被保藏的生物材料oHSVl-hTERTp_ICP4株，其株號的含義為:oHSVl指I型單純皰疹病毒17+株(HSVl) ；hTERTp_ICP4指以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp替換ICP4基因啟動子。上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，詳細(xì)說明如下。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1將野生型單純皰疹病毒17+毒株的基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp的方法步驟示意圖。圖2顯示實(shí)施例1制備的重組單純皰疹病毒oHSVl_hTERTp_ICP4與野生型單純皰疹病毒(17+)感染正常細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)的對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3顯示實(shí)施例2制備的重組單純皰疹病毒oHSVl_d34.5-d47_hTERTp_ICP4與現(xiàn)有技術(shù)中只剔除了野生型單純皰疹病毒基因組 的ICP34.5基因和ICP47基因的病毒(oHSVl-d34.5-d47)感染正常人白細(xì)胞的對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4A-圖4F顯示重組單純皰疹病毒oHSVl_hTERTp_ICP4對肝癌、肺癌、頭頸鱗癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和前列腺癌的殺傷作用試驗(yàn)結(jié)果(Μ0Ι = I)。
具體實(shí)施例方式為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的重組單純皰疹病毒、其制備方法及應(yīng)用其具體實(shí)施方式
、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。本發(fā)明提供了一種重組單純皰疹病毒，其中，該重組皰疹病毒是將含有ICP4基因的單純皰疹病毒基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp或其它腫瘤特異性啟動子。該含有ICP4基因的單純皰疹病毒可為野生型單純皰疹病毒、剔除了野生型單純皰疹病毒基因組中任何基因片段(除了 ICP4基因和ICP4基因啟動子)的病毒，但不局限于此，可為本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)技術(shù)對其進(jìn)行變化所得的任何含有ICP4基因的單純皰疹病毒。更具體地，本發(fā)明提供了一種重組單純皰疹病毒，其微生物保藏號為CGMCCN0.6397。 優(yōu)選地，該單純皰疹病毒剔除了 ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種，剔除ICP34.5基因(神經(jīng)毒基因)，可使溶瘤病毒更安全；而剔除ICP47基因，以促進(jìn)免疫應(yīng)答及增強(qiáng)溶瘤活性。優(yōu)選剔除ICP34.5和ICP47兩種基因。本發(fā)明還提供了一種制備所述重組單純皰疹病毒的方法，其中該方法包括以下步驟:用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp取代含有ICP4基因的單純皰疹病毒基因組中的ICP4基因啟動子，構(gòu)建該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4:(I)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒 pICP4del_hTERTp_ICP4 和 pICP4del_eGFP:a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并純化其基因組DNA ；b.擴(kuò)增ICP4基因上游(US)側(cè)翼序列(FlankingRegion,簡稱FLR):以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物:ICP4USf 正向引物:CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGGICP4USr 反向引物:AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA擴(kuò)增出ICP4基因上游側(cè)翼序列；擴(kuò)增ICP4基因下游(DS)側(cè)翼序列:以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物:ICP4DSf 正向引物:AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGCICP4DSr 反向引物:AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT擴(kuò)增出ICP4基因下游側(cè)翼序列；將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP73質(zhì)粒上，構(gòu)建pICP4del及pICP4del_eGFP質(zhì)粒:將SalI酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的上游側(cè)翼序列及Sall/Hindlll雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的下游側(cè)翼序列混合并連接到pSP73的EcoRV/Hindlll位點(diǎn)，得到pICP4del ;用 EcoRI/XhoI 從 pcDNA3.1-eGFP 切下 CMV 啟動子控制的 eGFP 表達(dá)盒，經(jīng) T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pICP4del的EcoRV位點(diǎn)，得到pICP4del_eGFP ；c.分三次PCR擴(kuò)增出ICP4基因中三段序列:首先，使用以下引物:ICP4-1st 正向引物:TTTTTTGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCCICP4-lst 反向引物 TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGT
ICP4-2nd 正向引物:CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTGICP4-2nd 反向引物:CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCGICP4-3rd 正向引物:CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTGICP4-3rd 反向引物:TTTTTTCTCGAGTTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出三段基因片段ICP4_lst、ICP4-2nd和ICP4-3ri，而后分別將該三段基因片段插入pSP73質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)構(gòu)建出以下三種質(zhì)粒 mSPTS-1CPA-l'pSPTS-1CPAj'pSPTS-1CPA-S^1，從該三種質(zhì)粒中用 EcoRI 和BsrGI 剪切出 ICP4-lst、用 BsrGI 和 PvuI 剪切出 ICP4_2nd 及用 PvuI 和 XhoI 剪切出 ICP_3rd待用；d.從含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp的質(zhì)粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代從pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV啟動子，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3_NHN 是在 pcDNA3 的 NheI 位點(diǎn)插入 Nhe1-Hap1-NheI 酶切位點(diǎn)序列所得；e.將步驟c中的該ICP4_lst、ICP4_2nd和ICP4_3ri混合并連接到步驟d中的該pcDNA3-NHN-hTERTp 的 EcoRI 及 XhoI 位點(diǎn)(該三種基因片段 ICP4_lst、ICP4_2nd 和 ICP^Slrd的連接次序是由其端位序列與該pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位點(diǎn)的序列所決定的，其可自動進(jìn)行匹配連接)，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4 ；f.用Sail酶切步驟b中含ICP4基因上下游側(cè)翼序列的質(zhì)粒pICP4del，并補(bǔ)平末端待用，用PmeI和HpaI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3-NHN_hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表達(dá)盒片段，并將其與該酶切后待用的pICP4del質(zhì)粒連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_IC P4 ；g.構(gòu)建BHK-1CP4輔助細(xì)胞:用EcoRI和XhoI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV啟動子的下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)，得到pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒；將該pcDNA3-CMV_ICP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒DNA可重組到BHK細(xì)胞基因組中，使有些BHK重組細(xì)胞獲得對新霉素的抗性和表達(dá)ICP4，用抗菌素G418殺死未重組的BHK細(xì)胞，經(jīng)過幾輪的亞克隆篩選，用RT-PCR方法篩選出表達(dá)ICP4的BHK-1CP4輔助細(xì)胞；(2)剔除基因組中ICP4基因啟動子并插入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp啟動子:A.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并提取病毒基因組DNA ；B.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟(l)b中該質(zhì)粒pICP4del_eGFP共轉(zhuǎn)入步驟(I) g中該BHK-1CP4輔助細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pICP4del-eGFP中綠色熒光蛋白表達(dá)盒GFP置換了該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV的ICP4基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，就能純化出重組病毒HSV-d4GFP (d4表示剔除ICP4基因);C、培養(yǎng)步驟B中該HSV-d4GFP病毒，并提取基因組DNA ；D、將步驟C該重組病毒HSV-d4GFP的基因組DNA和步驟(I) f該質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4 的 DNA 共轉(zhuǎn)入該 BHK-1CP4 輔助細(xì)胞，經(jīng)同源重組，hTERTp_ICP4表達(dá)盒置換了該重組病毒HSV-d4GFP的綠色熒光蛋白表達(dá)盒GFP，使新重組病毒的毒斑不發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選無熒光毒斑，就能純化出該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP40同理，所述重組單純皰疹病毒的制備方法，其中，可先剔除該含有ICP4基因的單純皰疹病毒的ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種，再以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp替換ICP4基因啟動子；或在以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp替換ICP4基因啟動子得到該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4后，再剔除該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4的ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種。所述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其中可以其它腫瘤特異性啟動子替代該人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp，來替換該含有ICP4基因的單純皰疹病毒中的ICP4基因啟動子，完成基因重組。優(yōu)選地，上述重組單純皰疹病毒的制備方法還包括對所有涉及的質(zhì)粒進(jìn)行測序以證實(shí)無突變發(fā)生的步驟。對于質(zhì)粒序列的監(jiān)控，可以保證整個制備過程的準(zhǔn)確性。另外，所述重組單純皰疹病毒的制備方法中，不局限于只使用綠色熒光蛋白表達(dá)盒，還可由青色熒光蛋白表達(dá)盒、紅色熒光蛋白表達(dá)盒、黃色熒光蛋白表達(dá)盒及其它指示蛋白表達(dá)盒中任一種所替換。本發(fā)明還提供了一 種藥物組合物，其中，該藥物組合物前述的重組皰疹病毒，以及藥物可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選該藥物組合物為注射液，該注射液包括藥學(xué)上可接受的載體以及前述的重組單純皰疹病毒，每毫升所述注射液中含有IO2 101°個該重組單純皰疹病毒。較優(yōu)地，其中該藥學(xué)上可接受的載體為PH值為4.0 9.0的磷酸緩沖液。另外，較優(yōu)地，該注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑；以該注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0.01 30% (重量)，所述保護(hù)劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或一種以上；每千克該注射液含有200 700毫克所述滲透壓調(diào)節(jié)劑，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。上述單純皰疹病毒與藥物組合物可用于制備治療腫瘤的藥物。另外，本發(fā)明還提供了另一種重組單純皰疹病毒，其是在前述重組單純皰疹病毒基因組中插入熒光蛋白表達(dá)盒，該熒光蛋白表達(dá)盒可為綠色熒光蛋白表達(dá)盒、青色熒光蛋白表達(dá)盒、紅色熒光蛋白表達(dá)盒、黃色熒光蛋白表達(dá)盒及其它熒光蛋白表達(dá)盒中任一種；由于該熒光蛋白表達(dá)盒能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)光，所以可以實(shí)現(xiàn)更快速、準(zhǔn)確、靈敏并廣譜地實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷以及腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷。基于上述在前述重組單純皰疹病毒基因組中插入熒光蛋白表達(dá)盒的另一種重組單純皰疹病毒，本發(fā)明提供了一種腫瘤診斷試劑盒，該腫瘤診斷試劑盒包括前述另一種重組單純皰疹病毒，該腫瘤診斷試劑盒檢測的樣品選自受試者全血、血漿、淋巴細(xì)胞懸浮液、骨髓、胸腔積液和腹腔積液，該腫瘤診斷試劑盒還包括:RPM1-1640培養(yǎng)基、pH為7的紅細(xì)胞裂解液和pH為7.2 7.4的磷酸緩沖液，其中，所述紅細(xì)胞裂解液包含0.15M氯化銨、IOnM碳酸氫鉀和InM乙二胺四乙酸；或RPM1-1640培養(yǎng)基、比重為1.077 0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺和pH為7.2 7.4的磷酸緩沖液。對于該腫瘤診斷試劑盒的使用方法可采用中國發(fā)明專利CN102220292A(
公開日:2011年10月19日)中公開的方法。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。以下實(shí)施例選用I型單純皰疹病毒毒株常用標(biāo)準(zhǔn)毒株:17+株(GenebankJN555585.1),為從英國HPA(Health Protection Agency)公司購買。17+株全基因序列已知。如無特別說明，所用酶及質(zhì)粒均為購買所得。實(shí)施例1本實(shí)施例為將野生型單純皰疹病毒17+毒株的基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp，請參閱圖1，步驟為:(I)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒 pICP4del_hTERTp_ICP4 和 pICP4del_eGFP:a.用BHK(地鼠腎)細(xì)胞(購自ATCC)培養(yǎng)該野生型單純皰疹病毒17+毒株，并純化其基因組DNA。b.擴(kuò)增ICP4基因上游側(cè)翼序列:以步驟a中所得17+病毒基因組DNA為模板，用ICP4USf (正向引物:CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG)和 ICP4USr(反向引物:AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA)擴(kuò)增出 ICP4 基因上游側(cè)翼序列；擴(kuò)增ICP4基因下游側(cè)翼序列:以步驟a中所得17+病毒基因組DNA為模板，用ICP4DSf (正向引物:AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGC)和 ICP4DSr (反向引物:AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT)擴(kuò)增出 ICP4 基因下游側(cè)翼序列；將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP73質(zhì)粒(從Promega公司購得)上,構(gòu)建pICP4del及pICP4del-eGFP質(zhì)粒:將SalI酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的上游側(cè)翼序列及SalI/HindIII雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的下游側(cè)翼序列混合并連接到pSP73的EcoRV/HindIII位點(diǎn)，得到pICP4del。序列分析證實(shí)該pICP4del質(zhì)粒無突變。用EcoRI/XhoI從pcDNA3.Ι-eGFP (從YRGENE購得，北京)切下CMV啟動子(巨細(xì)胞病毒早期啟動子)控制的eGFP表達(dá)盒，經(jīng) T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pICP4del的EcoRV位點(diǎn)，得到pICP4del-eGFP ；表I
正向引物 Primerl TTTTTTGAATTC 147105
ICP4-lst__ATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCC 147129
__反向弓 I 物 Primer2 148279 TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGT 148255
,正向引物 Primer3 148205 CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTG148229
ICP4-2--
__反向引物 Primer4 149739 CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCG149715
正向引物 Primer5 149675 CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTG 149699ICP4-3rd 反向引物 Primer6 TTTTTTCTCGAG 151001__TTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC 150977_c.分三次PCR擴(kuò)增出ICP4基因中三段序列:首先，使用表I所示的引物，以步驟a中所得17+病毒基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出三段基因片段ICP4_lst、ICP4_2nd和ICP4-3rd，而后分別將該三段基因片段插入pSP73的EcoRV位點(diǎn)構(gòu)建出以下三種質(zhì)粒:pSP73-1CP4-lst、pSP73-1CP4-2nd、pSP73-1CP4-3rd0在證實(shí)序列無突變后，從該三種質(zhì)粒中用 EcoRI 和 BsrGI 剪切出 ICP4_lst、用 BsrGI 和 PvuI 剪切出 ICP4_2nd 及用 PvuI 和 XhoI 剪切出ICPjlrd待用；
d.從含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp的質(zhì)粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代從pcDNA3_NHN(pcDNA3從Invitrogen公司購得，在pcDNA3的NheI位點(diǎn)插入Nhe1-Hap1-NheI酶切位點(diǎn)序列，構(gòu)建成pcDNA3_NHN)上用NruI和HindIII切除的CMV啟動子，得到質(zhì)粒 pcDNA3-NHN-hTERTp ；e.將步驟c中的該ICP4_lst、ICP4_2nd和ICP4_3ri混合并連接到步驟d中的該pcDNA3-NHN-hTERTp 的 EcoRI 及 XhoI 位點(diǎn)，得到質(zhì)粒 pcDNA3-NHN_hTERTp_ICP4 ；f.用SalI酶切含ICP4基因上下游側(cè)翼序列的質(zhì)粒pICP4del，并補(bǔ)平末端待用，用PmeI和HpaI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3_NHN_hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表達(dá)盒片段，并將其與該酶切后待用的pICP4del載體連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4。g.構(gòu)建BHK-1CP4輔助細(xì)胞:用EcoRI和XhoI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV啟動的下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)，得到pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒；將該pcDNA3-CMV_ICP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒DNA可重組到BHK細(xì)胞基因組中，使有些BHK重組細(xì)胞獲得對新霉素(neomycin)的抗性和表達(dá)ICP4。用抗菌素G418殺死未重組的BHK細(xì)胞。經(jīng)過幾輪的亞克隆篩選，用RT-PCR方法篩選到表達(dá)ICP4的BHK-1CP4輔助細(xì)胞。(2)剔除基因組中ICP4基因啟動子并插入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp啟動子:A.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該野生型單純皰疹病毒17+，并提取病毒基因組DNA ；B.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟(l)b中該質(zhì)粒pICP4del_eGFP共轉(zhuǎn)入步驟(I) g中該BHK-1CP4輔助細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pICP4del-eGFP中綠色熒光蛋白表達(dá)盒置換了該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV的ICP4基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色突光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色`突光毒斑，就能純化出重組病毒oHSVl-d4GFP ；C、培養(yǎng)步驟B中該oHSVl-d4GFP病毒，并提取基因組DNA ；D、將步驟C該重組病毒oHSVl-d4GFP的基因組DNA和步驟f該質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4 的 DNA 共轉(zhuǎn)入 BHK-1CP4 輔助細(xì)胞，經(jīng)同源重組，hTERTp_ICP4 表達(dá)盒置換了該重組病毒oHSVl-d4GFP的綠色熒光蛋白表達(dá)盒GFP，使新重組病毒的毒斑不發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選無熒光毒斑，就能純化出該重組單純皰疹病毒oHSVl-hTERTp_ICP40所有質(zhì)粒均經(jīng)序列分析證實(shí)無突變。圖2為實(shí)施例1制備的該重組單純皰疹病毒oHSVl_hTERTp_ICP4與野生型單純皰疹病毒(17+)感染正常細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)的對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在相同感染條件下(用I個病毒感染I個細(xì)胞，即MOI = 1，感染24或48小時)，通過該兩種病毒對正常細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)殺傷作用的比較可知，野生型單純皰疹病毒17+引起了嚴(yán)重的細(xì)胞病變并殺死正常細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)，而該重組單純皰疹病毒oHSVl-hTERTp_ICP4則對正常細(xì)胞無影響。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1相似，不同之處為本實(shí)施例是將剔除了 ICP47基因與ICP34.5基因的野生型單純皰疹病毒的基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp，具體步驟如下:(I)提取17+病毒的基因組DNA:用BHK(地鼠腎)細(xì)胞培養(yǎng)17+病毒并提取基因組 DNA。(2)剔除ICP47基因，構(gòu)建重組病毒oHSVl_d47a.擴(kuò)增ICP47基因上游側(cè)翼序列:以步驟⑴中所得17+病毒基因組DNA為模板，用 ICP47USf (正向引物:AAAAGAATTCGATTGGGTTCGATTGGCAATGTTGTCTC)和 ICP47USr(反向引物:AAAAACTAGTGATGTCCCGGGTACGACCATCACCCGAG)擴(kuò)增出 ICP47 US FLR。b.擴(kuò)增出ICP47基因下游FLR:以步驟⑴中所得17+病毒基因組DNA為模板，用ICP47DSf (正向引物:AAAAAAGCTTCACGACATGCTCCCCCCCGACGAGC)和 ICP47DSr(反向引物:AAAACAGCTGACGCGGAACTAGCGCGGACCGGTCG)擴(kuò)增出 ICP47 DS FLR。

c.將上下游側(cè)翼序列克隆到pBSK (從Stratagene公司購買)質(zhì)粒上，構(gòu)建pdICP47及pdICP47-eGFP質(zhì)粒:將EcoRI/Spel雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP47基因的上游側(cè)翼序列、Hindlll/Sall雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP47基因的下游側(cè)翼序列及互補(bǔ)的具有Spel/Hindlll 雙酶切位點(diǎn)的連接序列(Linkerl CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA ；Linker 2 AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA)進(jìn)行混合并連接到 pBSK 的 EcoRI/Sall 位點(diǎn)，得到 pdICP47。用 EcoRI/XhoI 從 pcDNA3.1-EGFP (從YRGENE購得，北京)切下CMV啟動子控制的eGFP表達(dá)盒，經(jīng)T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到 pdICP47 的 EcoRV 位點(diǎn)，得到 pdICP47_eGFP。d.將步驟(I)中所得17+病毒的基因組DNA與pdICP47_eGFP共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。同源重組后，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，就能得到純的重組病毒oHSVl-d47-GFP。以同樣的方法用pdICP47剔除oHSVl-d47_GFP中GFP表達(dá)盒，得到oHSVl-d470(3)剔除 ICP34.5 基因，構(gòu)建重組病毒 oHSVl_d34.5_d47A.提取17+病毒的基因組DNA:用BHK細(xì)胞培養(yǎng)oHSVl_d47病毒并提取基因組DNA。B.擴(kuò)增ICP34.5基因上游側(cè)翼序列:以步驟⑴所得17+病毒基因組DNA為模板，用 ICP34.5USf (正向引物:CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG)和 ICP34.5USr (反向引物:GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGCTCCTGACCGCGGG)擴(kuò)增出 ICP34.5US FLR。C.擴(kuò)增ICP34.5基因下游側(cè)翼序列:以步驟(I)所得17+病毒基因組DNA為模板，用 ICP34.5DSf (正向引物:GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGG CGGGGCCCGGCCAACCA)和ICP34.0TSr (反向引物:TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA)擴(kuò)增出 ICP34.5 下游側(cè)翼序列。D.將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP72(從Promega購得)質(zhì)粒上，構(gòu)建pdICP34.5及pdICP34.5-eGFP質(zhì)粒:用重疊聚合酶鏈反應(yīng)(overlapping PCR)連接ICP34.5上下游側(cè)翼序列，并與用BamHI/Xhol雙切并補(bǔ)平的pSP72載體連接，得到pdICP34.5。用EcoRI/XhoI從pcDNA3.1-eGFP切下eGFP表達(dá)盒，經(jīng)T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pdICP34.5的AfeI位點(diǎn)，得到 pdICP34.5-eGFP。E.將步驟(2)所得oHSVl-d47基因組DNA與步驟D所得pdICP34.5-eGFP共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。同源重組后，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，就能得到純的重組病毒oHSVl-d47-d34.5-GFP。以同樣的方法用 pdICP34.5 剔除 oHSVl-d47_d34.5-GFP 中 GFP 表達(dá)盒，得到 oHSVl-d34.5-d47。之后采用實(shí)施例1的方法，用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp取代前述得到的oHSVl-d34.5-d47的ICP4基因啟動子，構(gòu)建重組單純皰疹病毒oHSVl_d34.5-d47_hTERTp_ICP4。當(dāng)然，在本實(shí)施例中，也可采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法對ICP47基因和ICP34.5基因進(jìn)行剔除。本實(shí)施例中，所有質(zhì)粒均經(jīng)序列分析證實(shí)無突變。在另一實(shí)施例中，也可在實(shí)施例1所得該重組單純皰疹病毒oHSVl_hTERTp_ICP4后，再對其ICP47基因和ICP34.5基因進(jìn)行剔除。剔除ICP47基因和ICP34.5基因的方法可為實(shí)施例2中方法，也可采用現(xiàn)有技術(shù)中的其它方法。圖3為實(shí)施例2制備的該重組單純皰疹病毒oHSVl-d34.5-d47_hTERTp_ICP4與現(xiàn)有技術(shù)中只剔除了野生型單純皰疹病毒基因組的ICP34.5基因和ICP47基因的病毒(oHSVl-d34.5-d47)感染正常人白細(xì)胞的對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在相同感染條件下(用I個病毒感染I個細(xì)胞，即MOI = 1，感染24小時)，流式檢測發(fā)現(xiàn)oHSVl-d34.5_d47能感染白細(xì)胞(檢測值為0.8% )，而該重組單純皰疹病毒oHSVl-d34.5-d47-hTERTp_ICP4則不感染白細(xì)胞(檢測值為0.0% )，由此說明后者臨床使用更安全。圖4A-圖4F為該重組單純皰疹病毒oHSVl_hTERTp_ICP4對肝癌、肺癌、頭頸鱗癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和前列腺癌的殺傷作用試驗(yàn)結(jié)果(Μ0Ι = I)，其中對照組為野生型單純皰疹病毒。由該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的重組單純皰疹病毒oHSVl-hTERTp_ICP4能夠殺傷多種腫瘤細(xì)胞，具有廣譜的抗腫瘤作用。雖然前述兩個實(shí)施例是以I型單純皰疹病毒毒株17+株為例，但本發(fā)明不局限于17+株，同樣也適用于I型單純皰疫病毒毒株F株、KOS株、JSl株和BLI株等,另外，同樣適用于II型單純皰疹病毒，如HG52 株，即適用于含有ICP4基因的任一單純皰疹病毒。需要說明的是，雖然前述實(shí)施例是將單純皰疹病毒的基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp，但本發(fā)明的范圍不局限于人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp，其可將含有ICP4基因的單純皰疹病毒基因組的ICP4啟動子替換為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的其它腫瘤特異性啟動子，如:存活素(survivin)啟動子、前列腺特異性抗原(PSA)啟動子、肝癌細(xì)胞特有的甲胎球蛋白(AFP)啟動子、上皮細(xì)胞腫瘤的癌胚抗原(CEA)啟動子等。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種重組單純皰疹病毒，其特征在于將含有ICP4基因的單純皰疹病毒基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp或其它腫瘤特異性啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組單純皰疹病毒，其特征在于其微生物保藏號為CGMCCN0.6397。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組單純皰疹病毒，其特征在于該單純皰疹病毒剔除了ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種。
4.一種制備如權(quán)利要求1或2所述重組單純皰疹病毒的方法，其特征在于其包括以下步驟: 用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp取代含有ICP4基因的單純皰疹病毒中的ICP4基因啟動子，構(gòu)建該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4:(I)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒 pICP4del-hTERTp_ICP4 和 pICP4del_eGFP: a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并純化其基因組DNA； b.擴(kuò)增ICP4基因上游側(cè)翼序列:以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物: ICP4USf 正向引物:CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG ICP4USr 反向引物:AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTG AGATTGGCGGCACTGAGGTA 擴(kuò)增出ICP4基因上游側(cè)翼序列； 擴(kuò)增ICP4基因下游側(cè)翼序列:以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物: ICP4DSf 正向引物:AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAA CGGGCAGGGGGC ICP4DSr 反向引物:AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCC AGACGGGCT 擴(kuò)增出ICP4基因下游側(cè)翼序列； 將上下游側(cè)翼序列克隆到PSP73質(zhì)粒上，構(gòu)建pICP4del及pICP4del-eGFP質(zhì)粒:將Sal I酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的上游側(cè)翼序列及Sal I/Hindi 11雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的下游側(cè)翼序列混合并連接到pSP73的EcoRV/Hindlll位點(diǎn)，得到pICP4del ；用EcoRI/XhoI從pcDNA3.Ι-eGFP切下CMV啟動子控制的eGFP表達(dá)盒，經(jīng)T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pICP4del的EcoRV位點(diǎn)，得到pICP4del_eGFP ； c.分三次PCR擴(kuò)增出ICP4基因中三段序列:首先，使用以下引物: ICP4-lst 正向引物:TITITTGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCC ICP4-lst 反向引物:TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGT ICP4-2nd 正向引物:CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTG ICP4-2nd 反向引物:CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCG ICP4-3rd 正向引物:CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTG ICP4-3rd 反向引物:TTTTTTCTCGAGTTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC 以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出三段基因片段ICP4-lst、ICP4_2nd 和ICP4-3rd，而后分別將該三段基因片段插入pSP73質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)構(gòu)建出以下三種質(zhì)粒 -pSPTS-1CPA-l'pSPTS-1CPAj'pSPTS-1CPA-S^1，從該三種質(zhì)粒中用 EcoRI 和 BsrGI 剪切出ICP4-lst、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4_2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP_3rd待用； d.從含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp的質(zhì)粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代從pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV啟動子，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3_NHN 是在 pcDNA3 的 NheI 位點(diǎn)插入 Nhe1-Hap1-NheI 酶切位點(diǎn)序列所得； e.將步驟c中的該ICP4-lst、ICP4-2nd和ICPfSlrd混合并連接到步驟d中的該pcDNA3-NHN-hTERTp 的 EcoRI 及 XhoI 位點(diǎn)，得到質(zhì)粒 pcDNA3-NHN_hTERTp_ICP4 ； f.用SalI酶切步驟b中含ICP4基因上下游側(cè)翼序列的質(zhì)粒pICP4del，并補(bǔ)平末端待用，用PmeI和HpaI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3_NHN_hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表達(dá)盒片段，并將其與該酶切后待用的pICP4del質(zhì)粒連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4 ； g.構(gòu)建BHK-1CP4輔助細(xì)胞:用EcoRI和XhoI從步驟e獲得的該質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV啟動子的下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)，得到pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒；將該pcDNA3-CMV_ICP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該pcDNA3-CMV-1CP4質(zhì)粒DNA可重組到BHK細(xì)胞基因組中，使有些BHK重組細(xì)胞獲得對新霉素的抗性和表達(dá)ICP4，用抗菌素G418殺死未重組的BHK細(xì)胞，經(jīng)過幾輪的亞克隆篩選，用RT-PCR方法篩選出表達(dá)ICP4的BHK-1CP4輔助細(xì)胞； (2)剔除基因組中ICP4基因啟動子并插入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp啟動子: A.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV，并提取病毒基因組DNA； B.將步驟A中該病毒基因組DNA 與步驟(l)b中該質(zhì)粒pICP4del-eGFP共轉(zhuǎn)入步驟(I)g中該BHK-1CP4輔助細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pICP4del-eGFP中綠色熒光蛋白表達(dá)盒GFP置換了該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV的ICP4基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，就能純化出重組病毒HSV-d4GFP ； C、培養(yǎng)步驟B中該HSV-d4GFP病毒，并提取基因組DNA； D、將步驟C該重組病毒HSV-d4GFP的基因組DNA和步驟(I)f該質(zhì)粒pICP4del_hTERTp_ICP4的DNA共轉(zhuǎn)入該BHK-1CP4輔助細(xì)胞，經(jīng)同源重組，hTERTp_ICP4表達(dá)盒置換了該重組病毒HSV-d4GFP的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒，使新重組病毒的毒斑不發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選無熒光毒斑，就能純化出該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其特征在于先剔除該含有ICP4基因的單純皰疹病毒的ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種，再以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp替換ICP4基因啟動子，或在以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp替換ICP4基因啟動子得到該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4后，再剔除該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4的ICP34.5基因和ICP47基因中的一種或兩種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其特征在于以其它腫瘤特異性啟動子替代該人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其特征在于該方法還包括對所有涉及的質(zhì)粒進(jìn)行測序以證實(shí)無突變發(fā)生的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組單純皰疹病毒的制備方法，其特征在于該綠色熒光蛋白表達(dá)盒可由青色熒光蛋白表達(dá)盒、紅色熒光蛋白表達(dá)盒、黃色熒光蛋白表達(dá)盒或其它指示蛋白表達(dá)盒所替換。
9.一種藥物組合物，其特征在于該藥物組合物包含權(quán)利要求1或2所述的重組單純皰疹病毒，以及藥物可接受的載體或賦形劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體以及權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求所述的重組單純皰疹病毒，每暈升所述注射液中含有IO2 101°個該重組單純皰疫病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于該藥學(xué)上可接受的載體為pH值為.4.0 9.0的磷酸緩沖液。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于該注射液還含有保護(hù)劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑；以該注射液為基準(zhǔn)，所述保護(hù)劑的含量為0.01 30% (重量)，所述保護(hù)劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或一種以上；每千克該注射液含有200 700毫克所述滲透壓調(diào)節(jié)劑，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。
13.權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求所述的重組單純皰疹病毒，或9至12任一權(quán)利要求所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
14.一種重組單純皰疹病毒，其特征在于在如權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求所述的重組單純皰疹病毒基因組中插入熒光蛋白表達(dá)盒或其它指示蛋白表達(dá)盒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組單純皰疹病毒，其特征在于該熒光蛋白表達(dá)盒為綠色熒光蛋白表達(dá)盒、青色熒光蛋白表達(dá)盒、紅色熒光蛋白表達(dá)盒、黃色熒光蛋白表達(dá)盒及其它指示蛋白表達(dá)盒中任一種。
16.權(quán)利要求14或15所述的重組單純皰疹病毒在制備診斷腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
17.一種腫瘤診斷試劑盒，其特征在于該腫瘤診斷試劑盒包含如權(quán)利要求14或15所述的重組單純皰疹病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的腫瘤診斷試劑盒，其特征在于該腫瘤診斷試劑盒檢測的樣品選自受試者全血、血漿、淋巴細(xì)胞懸浮液、骨髓、胸腔積液或腹腔積液。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的腫瘤診斷試劑盒，其特征在于該腫瘤診斷試劑盒還包括: RPM1-1640培養(yǎng)基、pH為7的紅細(xì)胞裂解液和pH為7.2 7.4的磷酸緩沖液，其中，所述紅細(xì)胞裂解液包含0.15M氯化銨、IOnM碳酸氫鉀和InM乙二胺四乙酸；或 RPM1-1640培養(yǎng)基、比重為1.077 0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺和pH為7.2 .7.4的磷酸緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種重組單純皰疹病毒及其制備方法，其是將含有ICP4基因的單純皰疹病毒基因組中的ICP4基因啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp或其它腫瘤特異性啟動子，本發(fā)明還提供了該重組單純皰疹病毒在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明還提供了另一種重組單純皰疹病毒，其是在前述重組單純皰疹病毒基因組中插入熒光蛋白表達(dá)盒；前一種重組單純皰疹病毒相對于現(xiàn)有的單純皰疹病毒，能更有效地選擇性地在人腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，而不在人正常細(xì)胞中繁殖，從而更有效地殺傷癌細(xì)胞，保護(hù)正常細(xì)胞；本發(fā)明的另一種重組單純皰疹病毒，其能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)光，可更快速、準(zhǔn)確、靈敏并廣譜地實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷以及腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷。
文檔編號C12N7/01GK103205399SQ20121033762
公開日2013年7月17日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者劉濱磊, 葛科立, 張叔人, 張文, 李潔, 張郁, 董英 申請人:劉濱磊