專利名稱：鮮澤漆汁在制備抗單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鮮澤漆汁的新用途，具體是涉及鮮澤漆汁用于制備治療單純皰疹病毒疾病藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著社會人口老齡化、器官移植、免疫抑制劑應(yīng)用及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的增加，導(dǎo)致患者機體免疫功能下降。其中，HIV感染導(dǎo)致的機體免疫功能低下是單純皰疹病毒感染和復(fù)發(fā)的主要原因，而單純皰疹病毒又作為輔助因子增加HIV傳播的可能性，促進艾滋病發(fā)病并影響預(yù)后，臨床調(diào)查顯示皰疹病毒的復(fù)發(fā)感染是免疫功能受損者的主要死亡原因。HSV-I感染能引起唇皰疹、皰疹性甲溝炎和其他皮疹如外傷性皰疹、皰疹性濕疹，皰疹性角膜炎，嚴(yán)重非季節(jié)性局灶性腦炎等；HSV-2能引起生殖器皰疹、皰疹性直腸 炎、新生兒皰疹等，臨床表現(xiàn)變化多樣，常不典型或無癥狀，且可造成潛伏感染，易被人們忽視，同時也是HSV水平和垂直傳播的重要因素。HSV感染的嚴(yán)重程度與宿主的免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)，宿主免疫功能受損程度越重，病毒就越容易被激活，病毒激活后疾病會越嚴(yán)重。因此，積極防治艾滋病患者的皰疹病毒感染和復(fù)發(fā)非常重要。目前，艾滋病合并皰疹病毒感染的治療，主要使用的抗病毒藥物包括(I)核苷類藥物一代為阿昔洛韋(ACV，治療HSV和VZV感染)，二代為更昔洛韋(治療CMV感染)、伐昔洛韋，三代為泛昔洛韋(治療VZV感染)；(2)非核苷類藥物膦甲酸鈉、索立夫定(治療HSV感染);(3)生物抗病毒藥物干擾素及干擾素誘生劑。但是，這些藥物嚴(yán)重的副作用和病毒抗藥株的出現(xiàn)，使研制新的低毒、高效抗病毒藥物刻不容緩。天然藥物具有來源廣泛、不良反應(yīng)較少的特點，其抗病毒作用日益受到重視。澤漆為大戟科植物澤漆的全草，別名五朵云、貓兒眼草、奶漿草。據(jù)《本草綱目》記載，它具有利水消腫、消痰退熱等功效，為民間常用草藥。澤漆分布廣泛，資源豐富，因此很有必要開發(fā)新的抗皰疹病毒的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過大量實驗篩選，研究開發(fā)出鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒疾病藥物的應(yīng)用。作為優(yōu)選方案，以上所述的鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，所述的單純皰疹病毒為單純皰疹病毒I型或2型。本發(fā)明提供的鮮澤漆汁和藥學(xué)上可接受的載體如稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合齊U、濕潤劑、崩解齊U、吸收促進齊U、表面活性齊U、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味齊U、甜味劑等制備成治療單純皰疹病毒藥物。本發(fā)明所述的藥物可按藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)方法制備成注射液、片劑、粉針劑、顆粒劑、膠囊、口服液、凝膠劑、乳劑、膏劑、霜劑等多種劑型。本發(fā)明提供的鮮澤漆汁制成片劑時把鮮澤漆汁和載體乳糖或玉米淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。
本發(fā)明提供的鮮澤漆汁制成膠囊劑時把鮮澤漆汁和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。本發(fā)明提供的鮮澤漆汁制成顆粒劑時，把鮮澤漆汁和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。本發(fā)明提供的鮮澤漆汁制成注射液時，取鮮澤漆汁加入生理鹽水溶解然后加入活性碳，攪拌均勻，80°C加熱30分鐘，過濾，調(diào)節(jié)PH值，用垂熔玻璃漏斗或其它濾器過濾至澄明，灌裝，在100至115°C滅菌30分鐘制成注射液。本發(fā)明所述的鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，所述的鮮澤漆汁的制備方法為取新鮮澤漆，除去根，洗凈，將新鮮莖葉花搗碎，紗布過濾擠壓汁液，得到含新鮮生藥18g/ml的新鮮汁液，過濾除菌后-20°C保存，用于制備治療單純皰疹病毒藥物。本發(fā)明以體外單純皰疹病毒感染VERO細胞作為研究對象，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有·以下優(yōu)點
1、澤漆資源廣泛，易得，成本較低，可持續(xù)開發(fā)，應(yīng)用前景廣泛，實驗結(jié)果表明抗單純皰疹病毒活性強，并且經(jīng)毒性實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的有效劑量較小，毒性小，不良反應(yīng)低，使用更安全；
2、澤漆能和不同的賦形劑制備成不同的藥物劑型，能方便臨床應(yīng)用。
具體實施例方式 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。實施例I
鮮澤漆汁的制備取新鮮澤漆，除去根，洗凈，將新鮮莖葉花搗碎，紗布過濾擠壓汁液，得到含新鮮生藥18g/ml的新鮮汁液，過濾除菌后_20°C保存，備用。實施例2藥理實驗 I材料
1.1細胞株Veix)細胞(非洲綠猴腎細胞)，購自中國科學(xué)院上海細胞庫，本實驗室傳代、保存。I. 2藥物。本發(fā)明實施例I制備得到的鮮澤漆汁，澤漆水煎劑(制備方法為取干燥的澤漆，加入10倍量的蒸餾水于100°C煎煮至一半體積，過濾得到濾液，濃縮至浸膏，使得含生藥量20mg/ml，4°C保存);陽性對照藥物為無環(huán)鳥苷(ACV)，湖北潛江制藥股份有限公司，批號為20040802。1.3 主要試劑青霉素(山東魯抗)，硫酸鏈霉素(Amresco)，MTT (噻唑鹽，Genebase)，胰蛋白酶(南京生興)，EDTA(Sigma)，RPMI-1640 培養(yǎng)基(GIBC0)，碘化丙啶(PI，Sigma，美國)，RPMI-1640 (GIBC0),新生小牛血清(蘭州民海，Hyclone合資)，96孔培養(yǎng)板(Corning 產(chǎn)品)。1.4儀器超凈工作臺(蘇凈公司，SW-CJ-1F)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)，倒置顯微鏡(Olympus，X41)，酶標(biāo)儀(Bio-Teck，P0WERWAVE340)。I. I. 2 病毒
人類單純皰疹病毒I (HSV-I)和II型(HSV-2)，本實驗室增殖，保存。
2 方法
2.I病毒毒力測定將vero細胞按IX IO5的濃度，接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔0. 2ml, 18^24h長成單層細胞，棄去上清，備用。將HSV-I和HSV-2兩種病毒稀釋成不同濃度(10 —1UO +2、10 —3、10 —4、10 —5、10 —6、10 —7、10 —8、10 —9)，加入 20iiL 病毒液，每個濃度4個復(fù)孔，吸附lh，棄去未吸附的病毒，加入細胞培養(yǎng)液0. 2ml，37°C 5%0)2培養(yǎng)7211。根據(jù)出現(xiàn)細胞病變(CPE)情況，計算病毒的半數(shù)組織感染量(TCID5tlX2. 2藥物處理
取本發(fā)明實施例I制備得到的鮮澤漆汁和澤漆水煎劑(制備方法為取干燥的澤漆，力口A 10倍量的蒸餾水于10(TC煎煮至一半體積，過濾得到濾液，濃縮至浸膏，使得含生藥量20mg/ml, 4°C保存)，用10%血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋分別得到終濃度含澤漆生藥lg/ml。2.3藥物對細胞的毒性作用
取長成單層細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，棄去上清，將含不同濃度本發(fā)明實施例I制備得到的鮮澤漆汁和澤漆水煎劑(制備方法為取干燥的澤漆，加入10倍量的蒸餾水于100°C煎煮至一半體積，過濾得到濾液，濃縮至浸膏，使得含生藥量20mg/ml，4°C保存)的細胞維持液
0.2ml加入細胞，不含藥物的正常細胞對照，4個復(fù)孔，370C 5% CO2培養(yǎng)72h，倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞病變情況。每孔加入20 ii L 5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，力口A 0. 2mL DMSO充分溶解，酶標(biāo)儀570_630nm雙波長法測0. D值，計算藥物半數(shù)細胞毒性濃度(TC50)。以最大無毒濃度為起始濃度，2倍倍比稀釋幾個濃度，進行體外抗病毒實驗。2. 4藥物抑制單純皰疹病毒致細胞病變作用
將Vero細胞接種至96孔培養(yǎng)板，18 24h細胞長成單層，棄去培養(yǎng)上清，設(shè)藥物組包括本發(fā)明實施例I制備得到的鮮澤漆汁和澤漆水煎劑(制備方法為取干燥的澤漆，加入10倍量的蒸餾水于100°C煎煮至一半體積，過濾得到濾液，濃縮至浸膏，使得含生藥量20mg/ml，4°C保存)、陽性對照組、病毒對照組和細胞對照組。將單純皰疹病毒(HSV)病毒液用PBS稀釋成iooxtcid5Q (hsv-i稀釋io4倍，hsv-2稀釋io倍)，每孔接種20ml稀釋的病毒液，每板均留4孔作正常細胞對照，病毒吸附Ih后，棄上清液。將含實施例I制備得到的不同濃度鮮澤漆汁和不同濃度澤漆水煎劑(制備方法為取干燥的澤漆，加入io倍量的蒸餾水于100°c煎煮至一半體積，過濾得到濾液，濃縮至浸膏，使得含生藥量20mg/ml，4°C保存)的10%血清RPMI-1640培養(yǎng)基分別加入接種病毒的細胞培養(yǎng)板上，含0. 2mg/mL阿昔洛韋的10%血清RPMI-1640培養(yǎng)基作為陽性對照，病毒對照組和細胞對照組為10%血清RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔200ML，設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)板密封后置入37°C、5%C02恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h，每24h在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(yīng)(CPE)，記錄CPE程度。72h后，每孔加入20 ii L 5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，加入0. 2mL DMSO充分溶解，酶標(biāo)儀570_630nm雙波長法測0. D值，計算50%病毒抑制率，公式如下
權(quán)利要求
1.鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的單純皰疹病毒為單純皰疹病毒I型或2型。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于將澤漆提取物和藥學(xué)上可接受的載體制備成注射液、片劑、粉針劑、顆粒劑、膠囊、凝膠劑、乳劑、膏劑、霜劑或口服液劑型的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的鮮澤漆汁的制備方法為取新鮮澤漆，除去根，洗凈，將新鮮莖葉花搗碎，紗布過濾擠壓汁液，得到含新鮮生藥18g/ml的新鮮汁液，過濾除菌后，_20°C保存，備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鮮澤漆汁在制備治療單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明通過大量實驗篩選，實驗結(jié)果表明鮮澤漆汁體外對單純皰疹病毒致細胞病變效應(yīng)具有明顯的抑制作用，并且毒性低，不良反應(yīng)小，且澤漆資源廣泛，易得，成本較低，可持續(xù)開發(fā)，應(yīng)用前景廣泛，有望開發(fā)成新的抗單純皰疹病毒藥物。
文檔編號A61K36/47GK102716177SQ20121023561
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者何立巍, 孟玉芬, 張軍峰, 董偉, 詹瑧, 馬宏躍, 馬肖兵 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)