本發(fā)明涉及一種功能納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種兩親性聚合物、以及由其形成的磁性膠束納米載體和其用途。

背景技術(shù)：

納米材料藥物載體傳遞體系中，靶向腫瘤作用是非常關(guān)鍵的，它可以將載藥后的載體靶向輸送到特定部位實(shí)現(xiàn)藥物控制釋放，提高藥物載體的靶向聚集能力，從而達(dá)到提高該藥物生物利用率、減少對(duì)正常組織殺傷等毒副作用的目的。目前，常用的納米藥物載體靶向修飾主要有兩類：一類是連接靶向配體的生物靶向修飾，利用相應(yīng)配體對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別功能將載藥納米材料膠束在腫瘤位點(diǎn)累積，并釋放藥物。因這類靶向的納米載體可以靶向特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，針對(duì)腫瘤的微環(huán)境進(jìn)行靶向，所以被稱作是主動(dòng)靶向。另一類是通過使用物理方法輔助進(jìn)行靶向作用的物理靶向。它主要包括腫瘤的切除手術(shù)、射頻消融、微波凝固、氬氦刀、放射療法以及化療藥物磁性靶向修飾等。化療藥物磁性靶向修飾是將磁性納米顆粒(SPIO)和抗癌藥物同時(shí)裝載，利用外加磁場的引導(dǎo)將載藥納米膠束牽引到腫瘤組織。

磁性納米材料載藥系統(tǒng)作為一種新型靶向給藥方式，近些年來研究者們對(duì)其探索比較廣泛，載體體系中磁性納米顆粒除了可以輔助藥物載體在外加磁場引導(dǎo)作用下將藥物靶向傳遞到特定腫瘤組織并釋放藥物達(dá)到化療的目的外，還可以在外加交變磁場作用下產(chǎn)生磁致熱效應(yīng)達(dá)到對(duì)腫瘤組織施加熱療作用，并且由于含有鐵磁性物質(zhì)，使得其本身可以用作成像系統(tǒng)的造影劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向位點(diǎn)的組織核磁共振成像(NMR-imaging)，從而將腫瘤的診斷、治療、監(jiān)察結(jié)合起來。超順磁性鐵氧化物納米顆粒(SPION)因其特有的小粒徑尺度、生物安全性以及較好的超順磁性等諸多優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前科學(xué)家研究磁性納米載藥系統(tǒng)的熱門磁性材料之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種兩親性聚合物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種磁性膠束納米載體及其用途。

本發(fā)明提供的兩親性聚合物，其由聚乙二醇單丙烯酸酯、胱胺雙丙烯酰胺(cystamine bisacrylamide，CBA)或雙硫二醇雙丙烯酸酯(DTDA)、以及十二烷胺反應(yīng)制得。

優(yōu)選地，本發(fā)明的兩親性聚合物由聚乙二醇單丙烯酸酯、雙硫二醇雙丙烯酸酯以及十二烷胺反應(yīng)制得，其結(jié)構(gòu)如式(Ι)所示：

其中，m表示2～20的整數(shù)，n表示45～450的整數(shù)。

其中，所述兩親性聚合物的數(shù)均分子量為5～30kDa。

其中，所述反應(yīng)在DMSO中于60～100℃下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后使用乙醚沉淀即得所述聚合物。

本發(fā)明提供的磁性膠束納米載體由以上技術(shù)方案任一項(xiàng)所述的兩親性聚合物包覆改性或未改性的超順磁性鐵氧化物納米顆粒形成。

其中，所述改性的超順磁性鐵氧化物納米顆粒為包覆有油酸的超順磁性鐵氧化物納米顆粒。

其中，所述超順磁性鐵氧化物納米顆粒為超順磁性四氧化三鐵(Fe₃O₄)納米顆粒。

本發(fā)明還提供了所述磁性膠束納米載體作為藥物載體的用途。

其中，所述藥物為抗腫瘤藥物。

優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物為疏水性抗腫瘤藥物。包括但不限于阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、姜黃素、喜樹堿、羥基喜樹堿等。

更優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物為阿霉素。

本發(fā)明的聚合物具有兩親性，包含二硫鍵，使得聚合物還具備有還原敏感特性，而且制備方法簡便、反應(yīng)條件溫和。

本發(fā)明的聚合物用于制備磁性膠束納米載體，可負(fù)載藥物傳輸，可以對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境發(fā)生響應(yīng)，使得該納米載體的腫瘤靶向性能更優(yōu)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例制備的MPEG-rPAE的核磁圖譜；

圖2A、2B分別為油酸包覆的超順磁性四氧化三鐵納米顆粒、實(shí)施例制備的rMM的透射電鏡(TEM)照片；

圖3為實(shí)施例制備的rMM的粒徑分布圖；

圖4為實(shí)施例制備的rMM的動(dòng)態(tài)光散射圖；

圖5為實(shí)施例制備的rMM的MRI橫截面圖像以及T2加權(quán)像；

圖6為實(shí)施例制備的rMM的磁滯回線測試；

圖7A、7B、8A、8B、9A、9B分別為測試?yán)?不同條件下的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，以使本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)更清楚。但應(yīng)該指出，實(shí)施例用于理解本發(fā)明的構(gòu)思，本發(fā)明的范圍并不僅僅局限于本文中所列出的實(shí)施例。

如沒有特別說明，實(shí)施例所使用的原料均為市售產(chǎn)品、所使用的操作均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作。

實(shí)施例

1、雙硫二醇雙丙烯酸酯(2,2’-Dithiodiethanol Diacrylate，DTDA)的制備

雙硫基二乙二醇(2,2’-Dithiodiethanol)(7.7克，50毫摩爾)和三乙胺(Triethylamine，TEA)(18.75毫升，150毫摩爾)溶解于200毫升的無水四氫呋喃(THF)中，并置于500毫升圓底燒瓶。將圓底燒瓶放置于冰浴中，緩慢滴加丙烯酰氯(27.15克，300毫摩爾)的50毫升無水四氫呋喃溶液，逐滴加入超過2小時(shí)。滴加完畢后，該反應(yīng)在室溫下繼續(xù)反應(yīng)過夜。反應(yīng)完畢后，過濾去除三乙胺的鹽酸鹽顆粒固體沉渣，溶液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法純化。將得到的產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(dichloromethane)中，并用碳酸鈉水溶液洗5次以上，用無水硫酸鎂除水干燥。過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶劑揮發(fā)完畢的干燥狀態(tài)得到棕色粘稠液體。

2、MPEG-rPAE的制備

將MPEG(5000)-丙烯酸酯(0.1mmol)、DTDA(1mmol)、十二烷胺(DD,1mmol)添加到雙頸瓶中，加入10ml DMSO溶解。在80℃氬氣保護(hù)下下混合攪拌5天?；旌衔锢鋮s，使用大量過剩的乙醚沉淀2次，轉(zhuǎn)移到提前稱重的樣品瓶內(nèi)，使用油泵抽氣裝置連接干燥器，持續(xù)抽真空狀態(tài)10小時(shí)使樣品真空干燥，得到干燥的聚合物。其核磁圖譜如圖1所示。GPC測定(THF,1.0mL/min,30℃,polystyrene standards)Mn＝9.2kDa,PDI＝2.1。反應(yīng)式如下：

3、油酸包覆的超順磁性鐵氧化物納米顆粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles coated with Olic Acid，OA@SPIONs)的制備、篩選及純化

將試劑級(jí)FeCl₃(0.08摩爾)及FeCl₂(0.04摩爾)用50毫升蒸餾水溶解配制成混合溶液置于三口球形燒瓶中。之后在鐵架臺(tái)上構(gòu)建好反應(yīng)裝置：三口燒瓶中垂直口深入強(qiáng)力攪拌轉(zhuǎn)頭，旁邊口分別用作試劑添加口和保護(hù)氣體通入口。保護(hù)氣體選擇高純度氬氣(99.999％)，保護(hù)氣流于反應(yīng)前10min持續(xù)穩(wěn)速通入，于液面形成惰性氣體保護(hù)層避免后續(xù)加熱過程中的氧化。

劇烈攪動(dòng)至液面波動(dòng)趨于穩(wěn)定，同時(shí)將50毫升氫氧化銨(25％)溶液滴加到上述混合溶液，生成磁鐵礦泥漿沉淀。于溫控?cái)嚢杵魃?，甲基硅油介?dǎo)加熱該混合物，加熱到95攝氏度，后續(xù)補(bǔ)充加入55毫升的10％油酸/煤油。在這個(gè)過程中，磁鐵礦納米晶體被涂上一層親水性油酸銨分子，并且油酸銨在溫度升至78攝氏度時(shí)開始分解并釋放出大量氣體。在連續(xù)加熱的環(huán)境下，氨氣的蒸發(fā)改變磁鐵礦納米晶體涂層與疏水性油酸的排列關(guān)系，從而在鐵磁納米粒子表面形成疏水性油酸包裹層。

靜置之后，不同液相之間出現(xiàn)分離，上部的有機(jī)液相中，油酸包覆的磁鐵礦納米晶體穩(wěn)定分散，有別于底部的水相。使用吸管吸取大部分的水相棄去，加熱直到殘留的水相完全消失。降溫至常溫后，將裝置恢復(fù)至攪拌狀態(tài)，加入100毫升的丙酮使得該油酸包覆的磁鐵礦納米晶體產(chǎn)生絮凝，永久磁鐵(1.4特斯拉)用于收集這磁絮凝，上清液棄去。得到這種絮凝然后用80毫升的丙酮清洗，消除未能參與反應(yīng)的油酸，設(shè)定800G轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心。在此減壓條件(50毫米汞柱)下，丙酮從產(chǎn)生的沉淀物中除去，沉淀物靜置等待丙酮揮發(fā)完全。準(zhǔn)確稱量20毫克干燥磁鐵礦納米晶體溶于10毫升三氯甲烷中，得到分散性良好的鐵磁溶液，成分是用油酸包覆的超順磁性鐵氧化物納米顆粒，以備接下來的表征和后續(xù)修飾等一系列實(shí)驗(yàn)。

4、還原響應(yīng)性磁性納米膠束的制備

定量用油酸包覆的超順磁性鐵氧化物納米顆粒(OA@SPIONs)(1毫克)和MPEG-rPAE(10毫克)溶解于氯仿溶液(終體積1毫升)中。然后，將上述溶解好的有機(jī)溶液強(qiáng)有力地探入式超聲，與此同時(shí)，將10毫升蒸餾水逐滴滴加到上述有機(jī)相中，由此產(chǎn)生的膠體性混合物，強(qiáng)力攪拌24h使原有機(jī)溶劑氯仿充分揮發(fā)。之后，離心該膠質(zhì)與水相分離得納米膠束(rMM)。

5、rMM載阿霉素(DOX-rMM)的制備

將阿霉素(1mg)溶解在1毫升氯仿溶液攪拌，加入1.5當(dāng)量的三乙胺，加入OA@SPIONs(1毫克)和MPEG-rPAE(10毫克)溶解于氯仿溶液，共同攪動(dòng)60分鐘。10毫升蒸餾水在劇烈攪拌下逐滴補(bǔ)充進(jìn)上述反應(yīng)體系。為了分散載藥DOX以后的聚合物膠束，采用透析24h(截留分子量＝7000)去除沒有包進(jìn)納米材料的自由阿霉素小分子和其他副產(chǎn)物。期間換水3次以保證透析的效果。

6、Rh-MPEG-rPAE的制備

將MPEG(5000)-丙烯酸酯(0.1mmol)、DTDA(1mmol)、十二烷胺(DD,1mmol)添加到雙頸瓶中，加入10ml DMSO溶解。在80℃氬氣保護(hù)下下混合攪拌5天。后加入1mmol的乙二胺用來將反應(yīng)掉末端剩余的丙烯酸酯鍵，得到末端伯氨基的聚酯胺。使用大量過剩的乙醚沉淀2次，得到干燥的聚合物。將過量的Rhodamine-ITC與上述的伯氨基封端的MPEG-rPAE進(jìn)行反應(yīng)，得到Rh-MPEG-rPAE。

反應(yīng)式如下：

7、Rh-rMM的制備

將MPEG-rPAE替換為Rh-MPEG-rPAE，其余同前。

8、Rh-rMM載阿霉素的制備

將rMM替換為Rh-rMM，其余同前。

測試?yán)?

透射電子顯微鏡(TEM)觀測

制樣過程：將制備的油酸包裹的超順磁性鐵氧化物納米顆粒(OA@SPION)溶液、rMM溶液滴于透射電鏡專用超薄銅網(wǎng)上，用濾紙從邊緣輕輕吸去多余的液體，潔凈空間內(nèi)靜置等待自然晾干，必要時(shí)滴加磷鎢酸(phosphotungstic acid)負(fù)染，檢測其形態(tài)與大小。

如圖2A所示，超順磁性鐵氧化物納米顆粒呈現(xiàn)出了比較好的球形表面。如圖2B所示，rMM顯示為團(tuán)簇的納米顆粒和形成的核殼結(jié)構(gòu)的納米組裝體。

測試?yán)?

粒徑分析儀檢測rMM的粒徑大小

使用馬爾文激光粒徑分析儀(馬爾文公司Zetasizer Nano-S)檢測粒徑大小及分布，如圖3所示，粒徑分布比較均勻，多集中在100nm左右。

向rMM中加入10mM二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，簡稱為DTT)后，經(jīng)過預(yù)定時(shí)間后，采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)對(duì)納米膠束的尺寸變化過程進(jìn)行檢測。如圖4所示，圖中可以看出納米顆粒的尺寸在加入DTT后出現(xiàn)明顯變化，并且這種變化的程度隨著時(shí)間增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出納米rMM離解后產(chǎn)生的小尺寸的顆粒以及大尺寸的聚集體。因此，說明該納米顆粒顯示出了還原環(huán)境敏感的特性。

測試?yán)?

通過低場核磁共振技術(shù)獲得造影劑的弛豫率及體外T2加權(quán)成像

配制rMM納米顆粒(1mg/mL)的水溶液，測試樣品分別為原液稀釋的8、16、32、64、128倍。使用MesoMR23-060H-I中尺寸核磁共振分析與成像系統(tǒng)(上海紐邁電子科技有限公司)，共振頻率為23.315MHz,磁體強(qiáng)度為0.55T，線圈直徑為60mm，磁體溫度為32℃。

rMM納米顆粒測試樣品超聲10分鐘后放入儀器中檢測，采集樣品MRI橫截面圖像，完成T2加權(quán)像。如圖5所示，說明：1、造影劑T2弛豫效率與濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系：造影劑弛豫率與濃度之間的線性度R2＝0.9982。2、T2加權(quán)體外成像抑制了長弛豫的信號(hào)，突出短弛豫的信號(hào)，成像規(guī)律明顯。表明制得的rMM納米顆粒中包含有超順磁Fe₃O₄納米顆粒。

測試?yán)?

rMM納米顆粒的磁性性質(zhì)是在室溫(300K)下測定磁滯曲線來評(píng)估的，由高精度振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)記錄。典型操作過程為：稱取10mg干燥磁性納米粒子，加入高精度振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)記錄磁滯回線。

如圖6所示，磁性納米載藥載體的磁滯曲線顯示其仍具有Fe₃O₄納米粒子的超順磁性行為，具有超順磁性的納米粒子可以在外界磁場的引導(dǎo)下將載體系統(tǒng)靶向傳遞到特定部位，且圖中可以顯示在室溫下載體的磁滯曲線表現(xiàn)為零剩余磁化強(qiáng)度和零矯頑力，此時(shí)載體的飽和磁化強(qiáng)度(Ms)約為7.50emu/g，與裸露的Fe₃O₄納米粒子磁化飽和程度相比(裸露的Fe₃O₄納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為58.6emu/g)，它的磁化飽和程度要小一些，分析原因?yàn)榭赡苁荈e₃O₄納米粒子處于膠束的疏水性內(nèi)核，外層由于共聚物膠束的包覆，使得其磁性飽和度減小，但其滿足生物醫(yī)學(xué)上對(duì)其磁性應(yīng)用的要求。

測試?yán)?

共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)檢測阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的分布

長勢良好的人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)加入單體阿霉素、DOX-rMM，以15分鐘、2小時(shí)為時(shí)間梯度進(jìn)行細(xì)胞孵育。

首先，蓋玻片進(jìn)行消毒滅菌，酒精浸泡，置入規(guī)格相適應(yīng)的六孔板或培養(yǎng)皿內(nèi)。MCF-7細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上，細(xì)胞密度為2×10⁵個(gè)/孔(直徑＝10厘米)，培養(yǎng)24小時(shí)，然后將細(xì)胞暴露于單體阿霉素與DOX-rMM下。

預(yù)定的孵化時(shí)間(分別為15分鐘、2小時(shí))后，蓋玻片用預(yù)熱的PBS洗滌三次，然后用4％的多聚甲醛室溫固定15分鐘。

固定后，細(xì)胞用含0.1％Triton x–100的PBS固化處理10分鐘，然后用PBS沖洗三次。

細(xì)胞用10nM的鬼筆環(huán)肽(phalloidine)/1％(w/v)BSA溶液處理20分鐘，然后用PBS沖洗三次。然后細(xì)胞覆蓋10μM的DAPI染液20分鐘，用PBS沖洗三次。

自然風(fēng)干后進(jìn)行封片：在載玻片適當(dāng)位置滴加10μl抗淬滅的封片劑，將蓋玻片有細(xì)胞的一面封進(jìn)封片劑內(nèi)，輕輕蓋到載玻片上，使封片劑充分浸潤載玻片和蓋玻片之間的縫隙，用鑷子輕輕壓實(shí)蓋玻片，可存放于4℃長期保存。在共聚焦激光掃描顯微鏡下檢查樣品形貌。

為了觀察納米顆粒與細(xì)胞中各亞細(xì)胞器(內(nèi)涵體、線粒體)的共定位情況，將MCF-7細(xì)胞種在培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上，細(xì)胞密度為2×10⁵個(gè)/孔(直徑＝10厘米)，培養(yǎng)24小時(shí)，然后將細(xì)胞暴露于Rh-rMM的納米顆粒下。預(yù)定的孵化時(shí)間(分別為15分鐘，2小時(shí))后，將培養(yǎng)基更換成不含有血清的DMEM預(yù)熱培養(yǎng)基。為了防止內(nèi)涵體向溶酶體的轉(zhuǎn)變，在加入納米顆粒之前，加入50×10^-9M的巴弗洛霉素A1進(jìn)行處理30分鐘。而后加入50×10^-9M LysoTracker Green or MitoTracker Green(Life Technologies)培育30分鐘，隨后PBS清洗，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基。在共聚焦激光掃描顯微鏡下檢查樣品形貌。

圖7A、圖7B展示的是Rh-rMM納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)15分鐘和2小時(shí)后，Rh-rMM納米顆粒與細(xì)胞內(nèi)部亞細(xì)胞器-內(nèi)涵體的共定位情況。如圖所示，可見隨著細(xì)胞孵育時(shí)間的增加，通過內(nèi)涵體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的Rh-rMM納米顆粒逐漸增多，與內(nèi)涵體的共定位數(shù)目上也明顯增加。

說明：1、rMM納米顆?？山?jīng)由胞吞的形式進(jìn)入細(xì)胞。2、能夠有效地突破內(nèi)涵體的生理屏障，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，這與組成納米顆粒的聚合物的陽離子特性有著直接的關(guān)系，該聚合物結(jié)構(gòu)中的胺基基團(tuán)在內(nèi)涵體的酸性條件作用下，快速質(zhì)子化，產(chǎn)生質(zhì)子海綿效應(yīng)，突破內(nèi)涵體。3、在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高效率的聚集而不被排出，為藥物的細(xì)胞內(nèi)靶向藥物輸送提供了重要條件。

圖8A、圖8B展示的是DOX-rMM納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)15分鐘和2小時(shí)后，DOX-rMM納米顆粒與細(xì)胞內(nèi)部亞細(xì)胞器-線粒體的共定位情況。如圖8A及8B所示，可見隨著細(xì)胞孵育時(shí)間的增加，在細(xì)胞質(zhì)中的DOX-rMM納米顆粒明顯增加，但是很少與線粒體發(fā)生共定位。

圖9A、圖9B展示的是DOX-rMM納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)15分鐘和2小時(shí)后，DOX-rMM納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)釋放阿霉素的情況以及阿霉素的細(xì)胞內(nèi)分布。如圖9A及9B所示，細(xì)胞內(nèi)紅色的DOX的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)，而且隨著時(shí)間增加，在細(xì)胞核中的紅色熒光顯著增加，說明DOX進(jìn)入了細(xì)胞核中。

說明：1、組成納米顆粒的聚合物的降解行為，尤其是針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部高的還原環(huán)境的降解行為，能夠提供有效的藥物緩釋。2、經(jīng)由納米顆粒輸送的阿霉素在細(xì)胞內(nèi)高濃度存在，并且能夠有效到達(dá)作用靶點(diǎn)。3、避免了耐藥性的產(chǎn)生。

除非特別限定，本發(fā)明所用術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。

本發(fā)明所描述的實(shí)施方式僅出于示例性目的，并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出各種其他替換、改變和改進(jìn)，因而，本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，而僅由權(quán)利要求限定。