亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒、應(yīng)用及其制備方法

文檔序號(hào):9858710閱讀:1534來(lái)源:國(guó)知局
凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒、應(yīng)用及其制備方法
【專利說(shuō)明】凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒、應(yīng)用及其制備方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種利用表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(S1-ATRP)在上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面修飾親水聚合物,制備新型親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒,并在聚合物層中固定凝集素,應(yīng)用于體外、體內(nèi)細(xì)胞表面膜糖的原位標(biāo)記、成像及糖型分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]規(guī)模化的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。在糖基化、磷酸化、甲基化和泛素化等眾多的翻譯后修飾中,糖基化修飾作為一種重要的修飾方式在細(xì)胞的增值、分化、代謝和免疫應(yīng)答等方面起著重要的作用。美國(guó)FDA通過(guò)的生物標(biāo)志物中25%是糖蛋白,目前臨床上許多腫瘤診斷分子標(biāo)志物如CA19-9 (消化道腫瘤)、AFP (肝癌)、CA125(卵巢癌)等均是糖蛋白。在目前已知的糖蛋白中,細(xì)胞表面的膜糖蛋白在細(xì)胞間的識(shí)別、粘附、遷移及癌癥轉(zhuǎn)移等過(guò)程中都扮演著非常重要的角色。某些關(guān)鍵膜糖蛋白糖基化位點(diǎn)或寡糖鏈糖型的改變都與一系列重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)膜糖蛋白及其糖鏈結(jié)構(gòu)與功能的研究,許多糖蛋白或糖鏈已經(jīng)成為新藥開發(fā)的靶點(diǎn),如目前唯一用于禽流感治療的藥物Tamiflu (達(dá)非,羅氏公司產(chǎn)品)就是一種阻止病毒感染宿主細(xì)胞膜糖蛋白唾液酸的糖苷酶抑制劑。鑒于膜糖蛋白的糖基化修飾在生理、病理研究中的重要的作用,發(fā)展快速、高效的糖蛋白糖型分析技術(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型細(xì)胞膜糖蛋白糖型的實(shí)時(shí)、原位、動(dòng)態(tài)分析是十分必要的。然而目前的糖基化修飾研究技術(shù)如凝集素芯片、流式細(xì)胞儀、生物質(zhì)譜等均無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)、原位的細(xì)胞膜糖糖型分析?;谝陨显蛭覀兝帽砻嬉l(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)(Surface Initial Atom Transfer Radical polymerizat1n,S1-ATRP)在上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面修飾親水聚合物并固定凝集素,制備出新型凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒,應(yīng)用于細(xì)胞表面膜糖糖型的標(biāo)記、成像及差異分析。分子成像技術(shù)作為一種靈敏度高、可靠性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段,被廣泛應(yīng)用于原位、動(dòng)態(tài)、非侵入性的觀察體內(nèi)生物分子或生理過(guò)程。上轉(zhuǎn)換(up-convers1n, UC)熒光本質(zhì)上是一種反斯托克斯發(fā)光現(xiàn)象,它是一種發(fā)光團(tuán)通過(guò)連續(xù)吸收多個(gè)低能量光子后激發(fā)到電子激發(fā)態(tài),繼而弛豫發(fā)光過(guò)程,因此UC材料可以被近紅外光(長(zhǎng)波長(zhǎng)光,通常在1000 nm)激發(fā),發(fā)射出可見光(短波長(zhǎng))。這樣的光學(xué)性質(zhì)使其具有強(qiáng)大的組織穿透能力,較低的背景熒光,同時(shí)對(duì)生物樣本損傷小,非常適合低豐度生物分子的超靈敏檢測(cè)。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)是Matyjaszewki K.教授小組于1995年首次提出的一種可控自由基聚合方法。十余年以來(lái)得到了國(guó)際學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注。表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(S1-ATRP)是將ATRP引發(fā)劑固定于材料表面后原位引發(fā)聚合物生長(zhǎng)的一種方法,具有可控性好、分子量分布窄、適用單體范圍廣、反應(yīng)條件要求適中等特點(diǎn),特別適合制備結(jié)構(gòu)規(guī)整的聚合物包裹的核殼型納米顆粒。經(jīng)S1-ATRP法修飾后,上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面被帶有大量功能化位點(diǎn)的親水聚合物所包裹,在顯著提高顆粒生物相容性的同時(shí),可實(shí)現(xiàn)三維立體的凝集素固定,有效提高了凝集素的固載量,增強(qiáng)了其對(duì)寡聚糖的親和力和識(shí)別特異性,適用于體外、體內(nèi)不同類型細(xì)胞表面膜糖糖型的原位成像和差異分析,為研究糖蛋白糖鏈改變與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供了新的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處,本發(fā)明的目的就是提供一種凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒及其制備方法,以及在體外、體內(nèi)不同類型細(xì)胞表面膜糖的原位標(biāo)記、成像及糖型識(shí)別方法的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的制備方法,包括下述步驟:
1)制備油酸包裹的稀土金屬摻雜上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒;
2)使用一端為羧基,另一端為ATRP引發(fā)劑的S1-ATRP引發(fā)劑,利用其羧基與油酸的臂交換反應(yīng)將S1-ATRP引發(fā)劑固定在上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面;
3)在單體和催化劑體系存在下,于步驟2)中得到的固定了S1-ATRP引發(fā)劑的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng),在其表面原位生成親水聚合物外殼,其中,所述單體為能用于原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的單體,且在所述單體中含有能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)或在所述單體中含有經(jīng)化學(xué)修飾后能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán);
4)分為下述a)或b);
a)步驟3)中所述單體中含有能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán),使步驟3)中所述聚合物鏈上的官能團(tuán)與待固定的凝集素反應(yīng),將凝集素連接到所述親水聚合物側(cè)鏈上,再將所述親水聚合物側(cè)鏈上未與凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)封閉,得到所述凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒;
b)步驟3)中所述單體中含有經(jīng)化學(xué)修飾后能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán),將步驟3)中所述聚合物鏈上的官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾,使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟芘c待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán),然后再與待固定的凝集素反應(yīng),將凝集素連接到所述親水聚合物鏈上,再將所述親水聚合物鏈上未與凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)封閉,得到所述凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒。
[0006]進(jìn)一步,步驟2)中所述的S1-ATRP引發(fā)劑是通過(guò)羧基的臂交換反應(yīng)固定在上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面。
[0007]進(jìn)一步,步驟3)中所述單體為親水、低毒、非特異性吸附小的單體,為寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(0EGMA)、或其他多羥基化合物、丙烯酸類單體、丁烯酸類單體或戊烯酸類單體。
[0008]進(jìn)一步,所述步驟4)的b)為將步驟3)中所述聚合物鏈上的羥基氧化生成醛基,然后與待固定的凝集素反應(yīng),將凝集素連接到所述聚合物鏈上,再將所述聚合物鏈上剩余的醛基用牛血清白蛋白封閉。
[0009]進(jìn)一步,步驟3)中所述催化劑體系由催化劑和配體組成;所述催化劑選自下述任意一種金屬的齒化物:Cu、Mo ( IV )、Ru、Rh、Fe、Re、N1、Pd和pb,優(yōu)選氯化亞銅;
所述配體選自下述任意一種:1,1,4,7,7-五甲基二亞乙基三胺、聯(lián)吡啶、四甲基乙二胺、1,1,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺和三(N,N—二甲基氨基乙基)胺;所述單體、催化劑、配體的摩爾比為200: (0.5-5): (0.75-7.5)。
[0010]進(jìn)一步,所述凝集素具體為刀豆素A (ConA)、麥胚素(WGA)、大豆凝集素(SBA)或花生凝集素(PNA)。
[0011]所述制備方法制備得到的凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒。
[0012]所述的凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒在不同類型細(xì)胞表面膜糖的原位標(biāo)記、成像及糖型識(shí)別方法的應(yīng)用。
[0013]所述的細(xì)胞表面膜糖原位標(biāo)記、成像及糖型識(shí)別方法,體外標(biāo)記及成像包括下述步驟:將凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒加入到培養(yǎng)有不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)移至37° C的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)I h后棄去培養(yǎng)基,PBS清洗3次后即可完成膜糖的標(biāo)記,使用雙光子激光共聚焦顯微鏡對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行觀察。
[0014]所述的細(xì)胞表面膜糖原位標(biāo)記、成像及糖型識(shí)別方法,體內(nèi)標(biāo)記及成像包括下述步驟:準(zhǔn)備帶有HCCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤的裸鼠,對(duì)裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤注射ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒后,在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)裸鼠使用加裝波長(zhǎng)980 nm激光系統(tǒng)的小動(dòng)物成像箱進(jìn)行觀測(cè)。
[0015]本發(fā)明所提供的凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆??捎糜隗w外、體內(nèi)細(xì)胞表面膜糖的原位標(biāo)記、成像以及糖型分析。以正常肝細(xì)胞系(Chang Liver, CL)與具有高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系HCCLM3為例,在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中:將40 μδ/πι1的ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒加入培養(yǎng)有不同類型的肝細(xì)胞的培養(yǎng)皿中,在C02培養(yǎng)箱中37°C孵育I h即完成膜糖標(biāo)記,使用PBS緩沖液清洗非特異性吸附的熒光納米顆粒后,使用雙光子激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像分析及膜糖糖型差異檢測(cè)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中:選取背部接種HCCLM3細(xì)胞生成轉(zhuǎn)移瘤的裸鼠作為實(shí)驗(yàn)體,使用注射器向瘤內(nèi)注射40l^g/ml的ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換突光納米顆粒50 μ?,對(duì)照組注射相同濃度的未連接ConA的親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒。采用小動(dòng)物成像箱對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行成像分析和轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)細(xì)胞表面膜糖糖型的識(shí)別。
[0016]以O(shè)EGMA為聚合單體,刀豆素A (ConA)為凝集素,采用S1-ATRP法制備凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光
當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4 
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1