納米顆粒，以及細(xì)胞膜糖原位標(biāo)記、成像為例，對(duì)本發(fā)明方法的原理進(jìn)行如下說明:
首先以稀土無機(jī)酸鹽為前驅(qū)體，油酸和十八烯為穩(wěn)定劑制備稀土金屬摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒。之后將S1-ATRP引發(fā)劑2-溴代異丁酸利用其羧基與油酸的臂交換反應(yīng)固定于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面。以O(shè)EGMA為單體，氯化亞銅為催化劑，1,1,4,7,7-五甲基二亞乙基三胺為配體(按照200:1:1.5的摩爾比)，與固定了引發(fā)劑的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒混合均勻，引發(fā)S1-ATRP反應(yīng)，在上轉(zhuǎn)化熒光納米顆粒的表面原位生成親水聚合物層。之后將聚合物側(cè)鏈羥基通過氯鉻酸吡啶(PCC)氧化轉(zhuǎn)化為醛基，并利用西弗堿反應(yīng)將所引入的醛基與ConA的N-端或側(cè)鏈氨基反應(yīng)，將其固定于親水聚合物側(cè)鏈上。
[0017]使用時(shí)，直接將與S1-ATRP反應(yīng)制備的ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒加入到不同類型的細(xì)胞及培養(yǎng)基中，C02培養(yǎng)箱中37°C孵育1-2 h，即可完成細(xì)胞膜糖的原位標(biāo)記。之后使用PBS清洗細(xì)胞表面非特異性吸附的熒光納米顆粒后，將標(biāo)記的細(xì)胞與培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至雙光子激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行成像及糖型分析。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面由S1-ATRP法制備的致密的親水聚合物所包裹，具有良好的親水性和生物相容性。
[0019]2、通過S1-ATRP法在上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面修飾親水聚合物，不破壞熒光納米顆粒的原始晶型，從而使其量子效率不受影響。
[0020]3、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面的親水聚合物側(cè)鏈在氧化后帶有大量醛基官能團(tuán)，而且非交聯(lián)的親水聚合物鏈還可支持三維立體化、多層凝集素固定。因此，與傳統(tǒng)的單層凝集素固定方式相比，基于S1-ATRP反應(yīng)生成的聚合物鏈的凝集素固定方法，可顯著提高凝集素的固載量，有利于提高固定的凝集素與寡聚糖鏈間的接觸幾率和親和力。
[0021]4、與其它寡聚糖檢測(cè)技術(shù)相比，本方法可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面膜糖的實(shí)時(shí)、原位標(biāo)記，以及高靈敏度的膜糖成像和糖型分析，簡(jiǎn)化了糖型分析的操作步驟，同時(shí)也降低了樣本處理時(shí)引入的假陽(yáng)性的可能。
【附圖說明】
[0022]圖1:為上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒經(jīng)S1-ATRP反應(yīng)修飾前、后的透射電鏡照片。(a，b)為S1-ATRP反應(yīng)前的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒，(c，d)為S1-ATRP反應(yīng)后，親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒；(e，f)為傅里葉變換后的透射電鏡照片，(e)S1-ATRP反應(yīng)前，(f)S1-ATRP反應(yīng)后的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒。
[0023]圖2:為使用不同S1-ATRP聚合時(shí)間的親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的透射電鏡照片。
[0024]圖3:(a)為親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的熱重分析曲線；(b)未經(jīng)S1-ATRP反應(yīng)處理，油酸包裹的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的熱重分析曲線。
[0025]圖4:為不同利用上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒溶液的熒光發(fā)射光譜譜圖。OA-UCNPs (A):油酸包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒，BMPA-UCNPs (B):2-溴代異丁酸修飾上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒，BMPA-UCNPs (C):ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒。
[0026]圖5:為使用MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度的ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒對(duì)a) Chang Liver細(xì)胞，b) HCCLM3細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)。
[0027]圖6:為ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒對(duì)(a) HCCLM3 (細(xì)胞膜糖甘露糖表達(dá)陽(yáng)性)或(b) Chang Liver (甘露糖表達(dá)陰性)細(xì)胞的體外標(biāo)記后的激光共聚焦顯微鏡照片。Brighfield為明場(chǎng)顯微鏡照片，Hoechst33342為激發(fā)波長(zhǎng)346nm,發(fā)射波長(zhǎng)460nm的熒光顯微鏡照片，UCL為上轉(zhuǎn)換熒光顯微鏡照片(激發(fā)波長(zhǎng)980 nm,發(fā)射波長(zhǎng)545nm)。Merge為Hoechst33342和UCL合并后的突光顯微鏡照片。
[0028]圖7:為不同濃度的ConA功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒對(duì)HCCLM3細(xì)胞標(biāo)記后的激光共聚焦顯微鏡照片。(a)為10 μδ/πι?顆粒，(b)為20 μδ/πι?顆粒，(C)為50 Pg/ml顆粒。Brighfield為明場(chǎng)顯微鏡照片,Hoechst33342為激發(fā)波長(zhǎng)346nm,發(fā)射波長(zhǎng)460nm的熒光顯微鏡照片，UCL為上轉(zhuǎn)換熒光顯微鏡照片(激發(fā)波長(zhǎng)980 nm,發(fā)射波長(zhǎng)545 nm)。Merge為Hoechst33342和UCL合并后的熒光顯微鏡照片。
[0029]圖8: (a)為未固定ConA的親水聚合物修飾上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒，(b)在α -甲基甘露糖存在時(shí)ConA功能化親水聚合物修飾上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒對(duì)HCCLM3細(xì)胞標(biāo)記后的激光共聚焦顯微鏡照片。Hoechst33342為激發(fā)波長(zhǎng)346nm,發(fā)射波長(zhǎng)460nm的突光顯微鏡照片，UCL為上轉(zhuǎn)換突光顯微鏡照片(激發(fā)波長(zhǎng)980 nm,發(fā)射波長(zhǎng)545 nm)。Merge為Hoechst33342和UCL合并后的熒光顯微鏡照片。
[0030]圖9:對(duì)裸鼠體內(nèi)HCCLM3轉(zhuǎn)移瘤注射親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒后的數(shù)碼相機(jī)或小動(dòng)物成像箱照片。(a)為日光條件下的數(shù)碼相機(jī)照片，(b)為980 nm激光照射下的數(shù)碼相機(jī)照片，(c)為使用小動(dòng)物成像箱對(duì)注射ConA功能化上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒后O小時(shí)，3小時(shí)和3天的裸鼠的成像照片，(d)為同樣實(shí)驗(yàn)條件下注射未經(jīng)ConA功能化的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的裸鼠的成像照片。
【具體實(shí)施方式】
[0031 ] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0032]一種凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的制備方法，包括下述步驟:
O以稀土無機(jī)酸鹽為前驅(qū)體，油酸和十八烯為穩(wěn)定劑制備稀土金屬摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒；所使用稀土無機(jī)酸鹽可為￥(:133^13、￥13(:13，或￥&?3、6(^33沖13等；
2)使用一端帶有羧基另一端為ATRP引發(fā)劑的S1-ATRP引發(fā)劑，利用該分子的羧基與上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面油酸分子進(jìn)行臂交換反應(yīng)，從而將S1-ATRP引發(fā)劑固定于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面；
3)在單體和催化劑體系存在下，于步驟2)得到的引發(fā)劑固定的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，在其表面原位生成線性親水聚合物鏈。其中，所述單體為能用于原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的單體，且在所述單體中含有能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)或在所述單體中含有經(jīng)化學(xué)修飾后能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)；
4)分為下述a)或b)；
a)步驟3)中所述單體中含有能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)，使步驟3)中所述親水聚合物鏈上的官能團(tuán)與待固定的凝集素反應(yīng)，將凝集素連接到所述親水聚合物鏈上，再將所述聚合物鏈上未與凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)封閉，得到所述的凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒；
b)步驟3)中所述單體中含有經(jīng)化學(xué)修飾后能與待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)，將步驟3)中所述聚合物鏈上的官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟芘c待固定的凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)，然后再與待固定的凝集素反應(yīng)，將凝集素固定到所述聚合物鏈上，再將所述聚合物鏈上未與凝集素反應(yīng)的官能團(tuán)封閉，得到所述的凝集素功能化親水聚合物包裹上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒。
[0033]其中，步驟2)中所述S1-ATRP引發(fā)劑具體可為2_溴代異丁酸，并通過其羧基與包裹了油酸的上轉(zhuǎn)換熒光納米發(fā)生臂交換反應(yīng)，從而將S1-ATRP引發(fā)劑固定到上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面；
步驟3)中所述的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒具體為Yb/Er摻雜的NaYF4晶體，其粒徑約為30 nm,經(jīng)S1-ATRP修飾后形成核殼結(jié)構(gòu)，粒徑可達(dá)到50 nm ； 步驟4)中所述單體優(yōu)選為親水、低毒、非特異性吸附小的單體，具體可為:各種分子量的寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(OEGMA)、或其他多羥基化合物。當(dāng)采用OEGMA單體制備聚合物鏈時(shí)，制備完成后需將親水聚合物側(cè)鏈上的醇羥基氧化為醛基，然后與待固定的凝集素偶聯(lián)(當(dāng)連接的凝集素為刀豆素A時(shí)，是利用醛基與刀豆素A的N-端和側(cè)鏈氨基反應(yīng))，將凝集素固定到所述聚合物鏈上，再將聚合物鏈上剩余的醛基用牛血清白蛋白封閉。最后之后將其保存在4° C冰箱中備用。
[0034]步驟3)中所述催化劑體系由催化劑和配體組成。所述催化劑選自下述任意一種金屬的齒化物:Cu、Mo ( IV )、Ru、Rh、Fe、Re、N1、Pd和Pb ;優(yōu)選氯化亞銅。
[0035]所述配體選自下述任意一種:1，1，4，7，7-五甲基二亞乙基三胺、聯(lián)吡啶、四甲基乙二胺、1，1，4，7，1