背景技術(shù)：
：美國的急性骨髓性白血病(AML)患病率較低，約5萬患者，這被認(rèn)為遠(yuǎn)低于美國對孤兒病20萬患病人數(shù)定義的要求。老年人患急性骨髓性白血病的患病率更高，往往也更難治療。老年患者通常被定義為至少60歲的病人(盡管一些分類要求病人至少65歲甚至70歲)以高比率死于這種疾病。老年急性骨髓性白血病患者的響應(yīng)率和存活率平均為30％～50％，完全緩解的中位無復(fù)發(fā)生存期(RFS)只有9至12個月。很少有老年患者可以活過兩年。老年急性骨髓性白血病患者的治療管理面臨很多挑戰(zhàn)。盡管約百分之七十(70％)的患者在常規(guī)誘導(dǎo)治療下病情到緩解，但由于這種療法的毒性作用以及給老年人帶來的嚴(yán)重不良后果，導(dǎo)致常規(guī)誘導(dǎo)治療通常不適用于老年患者。因此，老年患者的治療方案通常僅僅是臨床試驗治療或姑息治療。不過，可以鑒別可能對常規(guī)誘導(dǎo)治療響應(yīng)的老年患者的亞組。例如，具有良好的細(xì)胞遺傳學(xué)和不伴有高多藥耐藥蛋白(MDR1)表達(dá)的老年患者對誘導(dǎo)治療應(yīng)答良好。但是，延遲鑒別這些患者會延遲誘導(dǎo)治療，例如等待細(xì)胞遺傳學(xué)評估結(jié)果可能得花上一周或者更久，這會對患者的預(yù)后有明顯的負(fù)面影響。響應(yīng)不良的標(biāo)記包括FLT3/ITD基因突變的出現(xiàn)以及CD34抗原表達(dá)。因此，對老年AML患者的有效治療需要快速決策，這反過來需要快速測定選擇適當(dāng)?shù)闹委煛Ｓ行┗颊叩闹委燀憫?yīng)良好，而有些患者每況愈下，飽受治療副作用之苦。AML患者也可分為復(fù)發(fā)/難治性疾病患者以及初診患者。處于復(fù)發(fā)或難治性疾病狀態(tài)的患者不是對治療毫無響應(yīng)，就是疾病已經(jīng)復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)性或難治性狀態(tài)都與不良預(yù)后相關(guān)。不幸的是，許多AML治療取得初步成功后，緊隨的往往是舊病復(fù)發(fā)。此外，還尚不清楚大多數(shù)治療是否對所有患者有效，部分緩解很大程度上對延長生存期無效。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)即使對老年患者而言也是一種可選的療法。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)抑制碳法尼基部分與各種蛋白質(zhì)的C-末端CAAX模序共價結(jié)合。很明顯，相對于常規(guī)誘導(dǎo)治療，老年患者對FTI的耐受性更好。但是，大約僅15％～25％的患者對法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的治療有響應(yīng)。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑例如替吡法尼通過競爭性抑制法尼基部分與信號分子如RAS(與癌癥有著密切關(guān)系)等的結(jié)合來執(zhí)行其功能。這種抑制預(yù)計會阻礙它們的功能。本申請中所關(guān)注的許多FTI在美國專利公開20030050323里描述。替吡法尼，也稱為R115777或其商品名為ZARNESTRATM，是第一種用于臨床試驗的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)，在許多疾病治療上顯示出良好的前景。它在血液系統(tǒng)疾病方面顯現(xiàn)出重要的作用，這些疾病包括AML、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、幼年型粒單細(xì)胞白血病(JMML)、骨髓纖維化與髓樣化生(MMM)和慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)，AML和MDS的完全緩解率高達(dá)15％左右。此外，替吡法尼常與其他治療具有協(xié)同作用。這種協(xié)同作用常使老年患者有其它的選擇，讓他們能夠承受法尼基抑制劑和另一種藥劑的協(xié)同治療。相比單獨用一種藥劑治療，這種治療的副作用是可以接受的，療效更好。值得注意的是，之前的替吡法尼臨床試驗本身并不會顯著增加存活率；與諸如阿糖胞苷(ARA-C)的另一藥劑的協(xié)同治療甚至可能增加死亡率。替吡法尼和依托泊苷的協(xié)同很可能克服這些缺點。優(yōu)選的FTI是替吡法尼，其能抑制多種腫瘤/細(xì)胞株的生長。具體地講，表達(dá)N-ras基因或H-ras基因突變的細(xì)胞株表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖抑制作用。然而，在進(jìn)行測試時，僅約一半的K-ras基因突變細(xì)胞株會被FTIR115777抑制，加大劑量也同樣如此。FTIR115777在抑制腫瘤/細(xì)胞株生長上也表現(xiàn)出和很多藥劑的協(xié)同作用。值得注意的是，某些癌癥和其他增殖性疾病特征在于突變存在于不同類型的ras突變的突變或者對其具有敏感性。因此，包括R115777在內(nèi)的FTI不期望對所有類型的癌癥和增殖性疾病都具有相同的效果。事實上，當(dāng)K-ras起主要作用時，F(xiàn)TI對其不可能與只有N-ras基因或H-ras基因起重要的作用時同樣有效。規(guī)誘導(dǎo)治療的另一可選療法基于鬼臼毒素(Podophyllotoxin)，所述療法在美國專利公開號US20030050323中有描述。鬼臼毒素是從曼德拉草里提取的。它是一種母體化合物，從該化合物中研發(fā)出的兩種糖苷在治療人類腫瘤方面有重大的治療效果，所述腫瘤包括小兒白血病、肺小細(xì)胞癌、睪丸瘤、霍奇金病和大細(xì)胞淋巴瘤等。這些衍生物是依托泊苷(VP-16)，它的化學(xué)名是41-去甲表鬼臼脂素-9-[4，6-0-(R)-亞乙基-β-D-吡喃葡糖苷]和替尼泊苷(VM-26)，化學(xué)名為41-去甲基表鬼臼脂素9-[4，6-0-(R)-亞乙基-β-葡萄糖苷]。這些化合物的作用機(jī)理包括通過與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的相互作用或自由基的形成誘導(dǎo)DNA鏈斷裂。然而，依托泊苷和替尼泊苷都有毒副作用，尤其是骨髓抑制。為了增強抗癌鬼臼毒素衍生物對腫瘤生長的抑制效果，為了找到一種使用低劑量抗癌鬼臼毒素衍生物的方法，本文探討了和其它療法組合的協(xié)同治療。FTI，特別是替吡法尼，能與依托泊苷顯示出協(xié)同作用，使得可以使用毒性小、效果好的劑量，這是老年AML患者重點考慮的因素。替吡法尼協(xié)同一種鬼臼毒素衍生物(如依托泊苷)組合副作用具有更好的可接受性。然而，替吡法尼和依托泊苷的協(xié)同組合的有效率約為15％至25％，不同于年輕AML患者組的有效率通常為百分之七十(70％)。由于并不是所有AML患者都對FTI治療應(yīng)答，如果患者是無應(yīng)答者，這就在實施FTI之前提出了一大挑戰(zhàn)，那么用FTI治療該患者是不可取的。雖然首選的FTI，R115777是有效的聯(lián)合用藥，但是到現(xiàn)在還不能準(zhǔn)確預(yù)測R115777與其它藥劑聯(lián)合用于特定患者的協(xié)同作用，部分原因是法尼基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制程度沒有與臨床變化良好地相關(guān)。例如，RAS基因突變狀態(tài)被當(dāng)作是患者對于FTI治療響應(yīng)的候選生物標(biāo)記。所述原理基于這個臨床前證據(jù)：許多癌癥中，RAS基因特定點的突變會導(dǎo)致RAS途徑的組成性激活。通常認(rèn)為這種嚴(yán)重依賴于一個或兩個途徑激活的腫瘤腫瘤患者會對抑制發(fā)病途徑的藥物有響應(yīng)。然而有時候，多個事件可以激活很多途徑，已發(fā)現(xiàn)在沒有活化的RAS突變的情況下，可以上調(diào)RAS。此外，正如美國專利公開號20070048782中指出的，目前還沒有臨床研究已證明RAS突變與FTI療效之間的關(guān)聯(lián)，所述專利以引用的方式在本發(fā)明中公開。事實上，盡管早期FTI臨床研究多集中在表現(xiàn)RAS基因突變率高的癌癥，但在這些試驗中響應(yīng)率非常低。因此，預(yù)測法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與其它藥劑組合用于特定患者的響應(yīng)問題有待于找到一個合適的診斷方法，能快速、準(zhǔn)確、費用適度地使預(yù)測能力具有臨床用途。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明鑒別能預(yù)測法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與依托泊苷協(xié)同治療應(yīng)答的標(biāo)記。這些標(biāo)記可鑒別低應(yīng)答特征的腫瘤治療，所述低應(yīng)答特征出現(xiàn)在可能應(yīng)答者身上，同時可避免可能無應(yīng)答者受到不期望的不良副作用的影響。優(yōu)選實施例能夠可靠迅速地預(yù)測患者是否會對FTI協(xié)同治療有應(yīng)答，所述治療包括FTI組合依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康，曲妥珠單抗和順鉑中的一個或多個。優(yōu)選的，F(xiàn)TI組合治療由替吡法尼和依托泊苷組成。此外，本公開能符合從眾多可能的治療方法中選取最有效的療法這一需要，并且轉(zhuǎn)到更有效的治療。治療具有多起因、多并發(fā)癥、多治療方法的AML的目標(biāo)之一是及時準(zhǔn)確地預(yù)測對患者特別是老年患者實施的特定療法的有效性。本公開對FTI協(xié)同治療可能的響應(yīng)作了個性化預(yù)測，允許對應(yīng)答者進(jìn)行FTI協(xié)同治療，同時對潛在無應(yīng)答者采取替代療法。優(yōu)選的治療方法包括替吡法尼(可口服)和非肽類法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，所述療法在治療包括老年AML患者在內(nèi)的骨髓惡性腫瘤上表現(xiàn)出的AML和MDS完全緩解率高達(dá)15％，其中所述老年AML患者不是傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物治療的候選。替吡法尼在治療高危骨髓增生異常和骨髓增殖性疾病方面也有效，所述骨髓增殖性疾病包括病因不明的骨髓組織異生和伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病。響應(yīng)速率的改善期望對很可能無應(yīng)答患者避免給服用替吡法尼。本發(fā)明用于鑒別骨髓障礙患者是否可以成為FTI組合治療的候選對象，所述方法包括施用第一測定并給出第一結(jié)果。如果這一結(jié)果或結(jié)果的倒數(shù)小于預(yù)定閾值，該受試者就被標(biāo)記為不能用第一組療法，所述療法需要組合法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和選自下列的一種藥劑：依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠單抗和順鉑。如果受試者沒有被標(biāo)記，那么從治療組里選定療法用于該受試者。選擇預(yù)定閾值優(yōu)選地是這樣：如果從治療組里選定的療法具有有益的較高陰性預(yù)測值，就標(biāo)記受試者，以在盡可能最大群體范圍避免拒絕合理的有效治療。因此，有效的高陰性預(yù)測值需要標(biāo)記最不可能用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和其它藥劑協(xié)同治療的受試者。應(yīng)當(dāng)注意的是，可以把受試者標(biāo)記為積極反應(yīng)-確定受試者可能受益于治療，或消極反應(yīng)-確定受試者不會受益于治療。因此，標(biāo)記應(yīng)理解為對群組進(jìn)行鑒別甚至進(jìn)行定義。可選地，選擇預(yù)定閾值可以這樣：如果從治療組里選定的療法具有較高的陽性預(yù)測值，受試者就會被標(biāo)記，以提高受益于治療的可能性。如果有許多有區(qū)別的相互競爭的療法可用，這種療法通常會受到青睞。此外，受試者被鑒別為可能受益于所述治療組里選定的療法，療法的選取基于相對的陽性預(yù)測值-優(yōu)選相對于治療組的其它療法而言。在一個優(yōu)選的實施例中，骨髓障礙是急性骨髓性白血病。另一方面，也可用本發(fā)明來鑒別下一步是否應(yīng)切換到不同的未來治療，以應(yīng)對受試者對以前治療的應(yīng)答有所下降的情況。不同療法可能包括姑息性治療?？蛇x地，不同療法也可能是由FTI和其它藥物如依托泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、鹽酸托泊替康、曲妥珠單抗和順鉑。基于期望對治療陽性應(yīng)答的部分受試者來確定法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和另一藥劑的組合治療的陽性預(yù)測值，其中所述的陽性應(yīng)答包括完全緩解，所述完全緩解通過以下來定義：在所有細(xì)胞系正常成熟的情況下存在的原粒細(xì)胞小于5％，至少為1000/μL的ANC(中性粒細(xì)胞)和至少100,000/μL的血小板計數(shù)，外周血中沒有原始細(xì)胞，骨髓中沒有可鑒定的白血病細(xì)胞，清除了與疾病有關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，以及清除了先前存在的任何髓外疾病。此外，在優(yōu)選實施例中，陽性應(yīng)答還包括部分緩解，其中所述部分緩解的標(biāo)準(zhǔn)是在骨髓中存在三系造血細(xì)胞存在下，中性粒細(xì)胞絕對值和血小板恢復(fù)到上述規(guī)定水平，骨髓原始細(xì)胞數(shù)在5％和25％之間，骨髓原始細(xì)胞比例比基線至少降低了50％。并且，在另一個優(yōu)選實施例中，陽性應(yīng)答還包括血液系統(tǒng)的改善。血液系統(tǒng)改善被定義為：骨髓原始細(xì)胞中至少有50％的減少，或在任何可測量的髓外疾病中至少有50％的減少，中性粒細(xì)胞絕對值恢復(fù)至500至1000/μL，血小板計數(shù)恢復(fù)至20,000至100,000/μL，或輸血需求改善。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來評估RASGPR1和APTX的基因表達(dá)水平。PCR反應(yīng)可與參照的PCR反應(yīng)在單管中進(jìn)行。用于擴(kuò)增的樣品可以是(i)骨髓樣品；和/或(ii)血液樣品中的一個或多個。RASGRP1和APTX標(biāo)記的表達(dá)水平比率，可用外部歸一化參考來評估。在一個優(yōu)選實施例中，擴(kuò)增子的擴(kuò)增包括：CTGGACGATCTCATTGACAGCTGCATTCAATCTTTTGATGCAGATGGAAACCTGTGTCGAAGTAACCAACTGTTGCAAGSEQNo.1用于RASGRP1和CGCTTCCGATTGGGCTACCACGCCATTCCGAGTATGAGCCATGTACATCTTCATGTGATCAGCCAGGATTTTGATTCTSEQNo.2用于APTX使用下列的引物進(jìn)行(i)5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’SEQNo.3APTX上游引物(ii)5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’SEQNo.4APTX下游引物，(iii)5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’SEQNo.5RASGPR1上游引物，和(iv)5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’SEQNo.6RASGPR1下游引物。兩基因表達(dá)比(RASGRP1：APTX)的性能和實用性在預(yù)測臨床意義上應(yīng)答FTI如R115777，RASGRP1和APTX的鑒定通過：研究源自之前未經(jīng)治療的AML老年患者的骨髓，對N-RASN-RAS高風(fēng)險急性髓性白血病利用全局基因表達(dá)，和/或特定基因的定量PCR(qPCR)。微陣列分析把兩基因的表達(dá)比率(RASGRP1：APTX)作為預(yù)測替吡法尼應(yīng)答的最高精度。這種分類能預(yù)測復(fù)發(fā)或難治性AML患者對替吡法尼的應(yīng)答，其陰性預(yù)測值和陽性預(yù)測值分別為92％和28％(比值比為4.4)。因此，對于新診斷AML患者和復(fù)發(fā)或難治AML患者，這種分類提高總應(yīng)答率約50％，同時保持較高的NPV，且顯著提高了患者的總生存期。兩基因分類的操作可助借定量qPCR，其在一項研究中觀察到的陰性預(yù)測值(NPV)和陽性預(yù)測值(PPV)分別為81％和50％(比值比4.3)。這些數(shù)據(jù)表明，一個簡單的兩基因表達(dá)測定可用來鑒別可能對替吡法尼(R115777)應(yīng)答的AML患者。此外，這兩個基因檢測不僅可用于新診斷的患者，還可用于難治性或復(fù)發(fā)性AML，例如：用于誘導(dǎo)治療之后，和用于提供維持治療。在一個示例性實施例中，按以下步驟快速確定RASGRP1：APTX基因比：收集外周血樣品，從樣品中分離RNA，用上述引物擴(kuò)增擴(kuò)增子，在通用RNA或其他外部參照中在同一組反應(yīng)中使上面所述擴(kuò)增子擴(kuò)增，所述參照包括RASGRP1和APTXRNA株系，測量每個反應(yīng)的Ct值，拒絕Ct是40cycles以上的樣品或反應(yīng)，優(yōu)選拒絕Ct是37cycles以上的樣品或反應(yīng)，更優(yōu)選拒絕Ct是35cycles以上的樣品或反應(yīng)，最優(yōu)選拒絕Ct是30cycles以上的樣品或反應(yīng)。然后，RASGRP1：APTX比率按如下所述計算。RASGRP1：APTX比率＝2^-((A-B)-(C-D))其中A：樣品RasGRP1Ct值B：JY(或通用)RNA(+)RasGRP1Ct值C：樣品APTXCt值D：JY(或通用)RNA(+)APTXCt值把該測定得到的結(jié)果與應(yīng)答比較。為了評估該檢測的表現(xiàn)，曲線下面積(AUC)值優(yōu)選地基于受試者工作特征(ROC)曲線分析計算，例如用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件包。優(yōu)選的方法中，如果該比率超過預(yù)定閾值，那么該患者歸類于可能應(yīng)答者。反之，他就是非應(yīng)答者。優(yōu)選地，預(yù)定閾值被定義為對應(yīng)于所期望檢測表現(xiàn)或其他標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)的AUC，所述其他標(biāo)準(zhǔn)例如靈敏度或特異性或敏感性和特異性的最大化總和。因此，特定的閾值可能不同，例如，由于使用了RNA(Y或通用或其他RNA集)，但在分層患者中閾值的特定期望性能在RTPCR檢測中允許使用不同的RNA參照和其他實驗條件，同時生成可比較的患者分層。本申請允許選取一個閾值，其中所述RASGRP1和APTX的表達(dá)水平比率和該閾值相比較，以鑒別對法尼基抑制劑和其它藥劑組合治療的應(yīng)答者，其中所述另一藥劑選自依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠單抗和順鉑的組或其衍生物。在一個優(yōu)選示例實施例中，閾值的選取包括：處理血樣以生成RASGRP1和APTX的表達(dá)水平比率。選取閾值來提高下列一個或多個測量值：療法的陽性預(yù)測值、鑒別應(yīng)答者的陰性預(yù)測值、ROC分析中的AUC，靈敏度和特異性。在一個優(yōu)選實施例中，RASGRP1或APTX的基因表達(dá)水平用RT-PCR測量，盡管可用其他測量基因表達(dá)的方法替代。應(yīng)當(dāng)指出的是，不失一般性，可用其他外部參照RNA代替通用RNA(來自STRATAGENETM。然而，可能需要調(diào)整RASGRP1：APTX比率的預(yù)定閾值。利用ROC估計預(yù)定閾值以保持曲線下面積(AUC)的恒定。例如，參考JYRNA(從JY細(xì)胞系獲得)確定5.2的閾值。換用可廣泛獲取的標(biāo)準(zhǔn)化的通用RNA，把閾值調(diào)整至7.3以確保曲線下面積(AUC)恒定。在參照RNA的情況下，閾值差異反映了RASGRP1和APTX的相對差異。其它藥劑在閾值計算中可進(jìn)一步造成差別。此外，也可基于所需的靈敏度或特異性要求(若有的話)調(diào)整所述閾值。因此，當(dāng)假定的非應(yīng)答者是替代療法的候選對象時，以下這點是可取的：選擇一個能使適宜于任一療法的患者數(shù)量最大化的閾值，以在大多數(shù)患者中提高抗AML的整體可能性。在這點上，鑒于年輕患者接受誘導(dǎo)治療的能力帶來的緩解率相對較高，可使用不同閾值以用來評估沒進(jìn)行誘導(dǎo)治療的老年患者，還可用來評估只用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑治療或把法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和另一種藥劑協(xié)同治療的年輕患者。選擇這樣的閾值可反映較高的特異性來鑒別對法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如替吡法尼的治療可能應(yīng)答的患者。作為另外一種選擇，協(xié)同法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的誘導(dǎo)治療(即使不知是否是協(xié)同作用的)會向患者提供及時有效的治療，而及時性是對抗AML的一個關(guān)鍵因素。這確?；颊卟粫豢尚械寞煼ㄅ懦?。任選地，在一個示例性實施例中，擴(kuò)增并檢測來自HMBS的RNA以核對樣品的完整性，從而當(dāng)HMBSRNA異常低值時，把該樣品標(biāo)記為可疑樣品。HMBSRNA的優(yōu)選擴(kuò)增子是CCTGCCCACTGTGCTTCCTCCTGGCTTCACCATCGGAGCCATCTGCAAGCGGGAAAACCCTCATGATSeq.No.7，擴(kuò)增使用的引物CCTGCCCACTGTGCTTCCTSEQNo.8HMBS上游引物，和ATCATGAGGGTTTTCCCGCT，SEQNo.9HMBS下游引物。擴(kuò)增子的檢測優(yōu)選使用下列探針：FAM-CATTCAATCTTTTGATGCAGATGGAAACCTG-BHQ1，RASGPR1，Taqman探針，SEQNo.10；Gold540-CACGCCATTCCGAGTATGAGCCATGTAC-BHQ2，APTX，TaqMan探針，SEQNo.11；以及Cy5-GCTTCACCATCGGAGCCATCTGCA-BHQ1，HMBS，TaqMan探針，SEQNo.12。容易注意到，不失一般性，這些探針可以是多種多樣，不僅有序列的選擇，還有探針上面的特定標(biāo)記。本發(fā)明也說明了兩基因比RASGRP1：APTX可通過qPCR迅速檢測，所述qPCR檢測使用標(biāo)準(zhǔn)化試劑在單管中進(jìn)行。所述檢測有預(yù)測實用性，能從包括老年患者在內(nèi)的新診斷AML、復(fù)發(fā)性或難治性AML患者中的鑒別出可能應(yīng)答者。另外，所述檢測可用外周血樣品代替骨髓樣品，相比獲得外周血樣品，獲得骨髓樣品需要進(jìn)行更進(jìn)一步侵入性操作。這兩基因的比率可用于給患骨髓疾病的受試者處方替吡法尼的方法中。一個評估RASGRP1和APTX表達(dá)的方法在例如骨髓或血液樣品中進(jìn)行，其通過用如下列的至少一種引物來擴(kuò)增來自核糖核酸靶標(biāo)的信號：(i)5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’(ii)5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’(iii)5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’和(iv)5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’。接下來，RASGPR1基因表達(dá)水平是相對于APTX、β-肌動蛋白和HMBS表達(dá)水平中的一個或多個評估的，優(yōu)選地以多重形式在單管中進(jìn)行。確定RASGRP1相對于APTX的表達(dá)水平比。若受試者的該比率大于閾值(優(yōu)選約5.1或約5.2)，替吡法尼就可處方給受試者。在一個優(yōu)選的實施方案中，替吡法尼和另一與其協(xié)同的藥劑一起處方。此類藥劑可以是依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、鹽酸托泊替康、曲妥珠單抗和順鉑中的任一種或其衍生物。最優(yōu)選的是給予替吡法尼和依托泊苷。本發(fā)明也涉及對確診患骨髓障礙的患者施用替吡法尼和依托泊苷的方法。如上所述，先確定RASGRP1和APTX的表達(dá)比是否超過約5.1或5.2的閾值。如果所述比值超過該閾值，給予替吡法尼。上述內(nèi)容和其它的細(xì)節(jié)借助下面的附圖進(jìn)行描述，連同其基于的說明書部分以及美國專利7,932,036共享內(nèi)容，其在此通過引用全文并入。附圖說明圖1描述了RASGRP1基因在AML中作為應(yīng)答替吡法尼的預(yù)測的表現(xiàn)。準(zhǔn)確率(A)和在AML初診患者中使用RASGRP1基因分類的Kaplan-Meier生存曲線(B)。圖2描述了RASGRP1：APTX基因?qū)ψ鳛锳ML中對替吡法尼應(yīng)答的預(yù)測。初診AML患者(A)的總生存期和兩種基因分類的復(fù)發(fā)/難治性AML患者(C)的總生存期用Kaplan-Meier生存曲線描繪。示出了初診AML患者(B)和復(fù)發(fā)/難治性AML患者(D)中兩基因分類的準(zhǔn)確率。圖3描述了使用qPCR的RASGRP1：APTX基因分類的表現(xiàn)。(A)歸一化的20位應(yīng)答者和10例進(jìn)行性患者的RASGRP1：APTXCt值。這20個獨立樣品和10個實驗樣品于基因芯片上分別列示。水平軸表示群體均值。(B)示出了30例新診斷的AML患者中RASGRP1基因分類的準(zhǔn)確率，用臨界值0分類患者。(C)C用Kaplan-Meier生存曲線描繪了分類患者的相關(guān)總生存期。圖4描述了RASGRP1基因作為預(yù)測復(fù)發(fā)和難治性AML患者對替吡法尼治療的應(yīng)答的表現(xiàn)。在復(fù)發(fā)和難治性AML患者中用RASGRP1基因分類的準(zhǔn)確性(A)和KaplanMeier生存曲線(B)。圖5描述了非FTI治療的AML患者的總生存期，其中所述患者是用RASGRP1：APTX基因表達(dá)比分類的。RASGRP1和APTX三個cDNA探針存在于可用的數(shù)據(jù)集里。我們首先計算每個基因的平均值，然后計算這些值的RASGRP1：APTX比率。比率高于1的患者被歸類為病情進(jìn)展者；比值低于1的患者被歸類為應(yīng)答者。然后進(jìn)行KaplanMeier分析。圖6示出了Affymetrix和qPCR數(shù)據(jù)的相關(guān)性。通過Affymetrix基因芯片和定量PCR(qPCR)進(jìn)行分析的9個RNA樣品，通過線性回歸分析進(jìn)行比較。Y軸以歸一化的ΔCt形式來繪制相應(yīng)于RASGRP1：APTX比率的qPCR值。應(yīng)該指出的是，嚴(yán)格來說，盡管會交替使用這些術(shù)語，但這個值不是一個比率，而是一個相對于比率的歸一化的Δ-Ct。結(jié)果是，隨著RASGRP1水平上升，相應(yīng)的Ct值會降低，而其它保持不變，ΔCt值會降低。X軸代表從同一樣品的芯片數(shù)據(jù)中獲得的相應(yīng)RASGRP1：APTX比率值，該值隨比率升高而升高。因此，表示歸一化的ΔCt和芯片之間相關(guān)性的線斜率為負(fù)值，其中所述芯片生成RASGRP1：APTX比率。圖7描繪了以多重形式在單管中擴(kuò)增RasGRP1，APTX和HMBSRNA，顯示了密切相關(guān)性、低變異性和高重復(fù)性。圖8和圖13描述了老年AML患者替吡法尼+依托泊苷研究第2階段中改良的qPCR測定的準(zhǔn)確度，采用了最佳臨界值5.2分類的患者的KaplanMeier分析。圖9和圖14描繪了ROC分析，指出：2基因比差值的80％(AUC＝0.80)作為用來預(yù)測完全緩解(CR)患者組的整體應(yīng)答的應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)。圖10和圖15表明在沒有接受FTI治療的患者中2基因比率和臨床應(yīng)答或總生存期之間沒有相關(guān)性。結(jié)合阿糖胞苷、蒽環(huán)霉素和第三種藥劑(夫拉平度、依托泊苷)大劑量誘導(dǎo)化學(xué)療法治療的41例AML患者的總生存期：用高低2基因比的分類。圖11描述了比較和確定優(yōu)選樣品采集問題中的工作流程。圖12A和圖12B顯示了樣品采集操作方案對兩基因檢測結(jié)果的影響。圖12B具體地顯示了每一個病人的散點，所述散點表明樣品采集方案的影響。Y軸顯示了樣品中RASGRP1：APTX對校準(zhǔn)/參考RNA中RASGRP1：APTX的比值，其中校準(zhǔn)/參考RNA在此為JYRNA。因此，Y軸值是用ΔΔCt法得到兩個比率的比率。優(yōu)選的測定中，所用閾值基于所期望的患者分類，所述分類使用定量RASGRP1和APTX水平的ΔΔCt法。具體實施方式本發(fā)明中提及的治療劑包括FTI。它們有多種形式，但是都有干擾或減輕蛋白質(zhì)的法尼基化的基本抑制功能，所述蛋白質(zhì)與癌癥和增殖性疾病相關(guān)。優(yōu)選地，F(xiàn)TI是那些適用于白血病如AML治療的。許多FTI都在本發(fā)明披露的范圍內(nèi)，也包括在以下美國專利描述：5,976,851；5,972,984；5,972,966；5,968,965；5,968,952；6,187,786；6,169,096；6,037,350；6,177,432；5,965,578；5,965,539；5,958,939；5,939,557；5,936,097；5,891,889；5,889,053；5,880,140；5,872,135；5,869,682；5,861,529；5,859,015；5,856,439；5,856,326；5,852,010；5,843,941；5,807,852；5,780,492；5,773,455；5,767,274；5,756,528；5,750,567；5,721,236；5,700,806；5,661,161；5,602,098；5,585,359；5,578,629；5,534,537；5,532,359；5,523,430；5,504,212；5,491,164；5,420,245；5,238,922和美國專利公開20030050323。非肽性酶，即所謂的“小分子”療法，是優(yōu)選的。更優(yōu)選的FTI是喹啉或喹啉衍生物，例如：7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-2，3-二氫-鄰-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮，7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮，8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-c]喹啉-4-酮，和8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-氯酚-基)-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮。最優(yōu)選的FTI的是(B)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。期望對治療的應(yīng)答進(jìn)行分類，便于了解治療效果和對比不同的治療方法。評估治療有很多標(biāo)準(zhǔn)。比如，一些實施例中，一千個中性粒細(xì)胞計數(shù)可足以確定應(yīng)答；而其他實施例可能需要1,400或1,500個中性粒細(xì)胞。同樣，血小板計數(shù)可能會是從10萬到14萬不等。需要一定比例的某一細(xì)胞系的改善，在其它評估中或需要兩種甚至是所有三種細(xì)胞系的改善。此類變化確定的持續(xù)時間是一兩個月甚至更久。在一個優(yōu)選的實施例中，對FTI治療有應(yīng)答的患者在接受FTI治療后骨髓里原始細(xì)胞至少減少了50％。通常情況下，部分緩解所需的改善程度是往往可變的，不同的研究者和/或醫(yī)生之間對以血液改善為代表的改善程度的評估差別極大。本權(quán)利要求范圍內(nèi)涉及到用來評估施用FTI治療的應(yīng)答的可選替代標(biāo)準(zhǔn)，旨在預(yù)測療效，除非明確表明了相反意圖。在一個優(yōu)選的實施方案中，陽性治療應(yīng)答包括完全緩解(CR)、部分緩解(PR)，和血液系統(tǒng)改善(HI)。其它的疾病描述是疾病進(jìn)展(PD)，余下的是被視為疾病穩(wěn)定(SD)的無應(yīng)答者。陽性應(yīng)答的分類在下文中描述。完全緩解(CR)的表現(xiàn)是在所有細(xì)胞系正常成熟的情況下存在的原粒細(xì)胞小于5％，至少為1000/μL的ANC(中性粒細(xì)胞)和至少100,000/μL的血小板計數(shù)，外周血中沒有原始細(xì)胞，骨髓中沒有可鑒定的白血病細(xì)胞，清除了與疾病有關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，以及清除了先前存在的任何髓外疾病。A必須在初次建檔的4-6周確認(rèn)完全緩解(CR)。如果可能的話，應(yīng)至少進(jìn)行一個骨髓活檢確認(rèn)CR。如果是完全緩解(CR)，那么骨髓應(yīng)表現(xiàn)出正常，即不到百分之五的原粒細(xì)胞，正常成熟，沒有發(fā)育不良。在外周血中，血紅蛋白大于11克，中性粒細(xì)胞每平方毫米超過1500，血小板超過10萬，沒有原粒細(xì)胞，沒發(fā)育不良的情況。此外，假設(shè)AML得以治愈，完全緩解(CR)患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險理想上應(yīng)和普通人群患AML的風(fēng)險是相同的。部分緩解(PR)可通過以下表現(xiàn)來鑒別：骨髓中有三系造血細(xì)胞，ANC和血小板恢復(fù)到上述規(guī)定水平，但骨髓原始細(xì)胞數(shù)在5％～25％之間，骨髓原始細(xì)胞比例比基線至少下降50％。必須在初次建檔的4-6周，確認(rèn)部分緩解(PR)。血液系統(tǒng)改善(HI)可通過以下表現(xiàn)來鑒定：骨髓原始細(xì)胞中至少有50％的減少，或在任何可測量的髓外疾病中至少有50％的減少，中性粒細(xì)胞絕對值恢復(fù)至500至1000/μL，血小板計數(shù)恢復(fù)至20,000至100,000/μL，或輸血需求改善。疾病穩(wěn)定(SD)可以通過不符合CR，PR，HI，或PD標(biāo)準(zhǔn)的任何治療應(yīng)答來鑒定。疾病進(jìn)展(PD)可以通過以下任一表現(xiàn)來鑒定：·＞骨髓原始細(xì)胞比率在最好評估的基礎(chǔ)上增長50％以上·＞循環(huán)原始細(xì)胞增長50％·出現(xiàn)新的循環(huán)原始細(xì)胞(至少連續(xù)兩次)·髓外疾病發(fā)育·在骨髓原始細(xì)胞足夠高的患者身上，病情進(jìn)展應(yīng)取決于外周血標(biāo)準(zhǔn)，新的循環(huán)原始細(xì)胞的出現(xiàn)(至少連續(xù)兩次)，和/或髓外疾病的進(jìn)展情況，其中所述高比例骨髓原始細(xì)胞使得無法根據(jù)骨髓原始細(xì)胞大于＞50％確定疾病進(jìn)展。優(yōu)選通過符合CR或PR(不論先記錄哪一個)的時間測量標(biāo)準(zhǔn)來測定應(yīng)答持續(xù)時間，直到客觀記載疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展的第一個日期為止。通過首先符合CR的時間測量標(biāo)準(zhǔn)測定CR的持續(xù)時間，直到客觀記載疾病復(fù)發(fā)的第一個日期為止。測量病情穩(wěn)定患者的病情穩(wěn)定持續(xù)時間，所述測量時間從開始治療起，止于符合病情進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)。無進(jìn)展生存期(PFS)時間從開始研究算起，算到客觀記載疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)的第一天，或者到因任何原因出現(xiàn)死亡的時間為止?？偵嫫跁r間從參與研究算起，到死亡為止。基因組內(nèi)僅僅存在具有表達(dá)蛋白質(zhì)或肽的潛在核酸序列(“基因”)，不能用以證明蛋白質(zhì)或肽是否在特定的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或表現(xiàn)。特定的基因是否能表達(dá)蛋白質(zhì)或肽或者在何種程度上會發(fā)生這樣的表達(dá)，如果有的話，將取決于各種復(fù)雜的因素。不論在理解和評估這些因素上有多大困難，測定基因的表達(dá)可提供有關(guān)細(xì)胞對給定的特定刺激反應(yīng)的有用信息，所述刺激比如藥物或其它治療劑的引入誘導(dǎo)刺激。對于基因活性或非活性程度的相對指示可見于基因表達(dá)譜?；虮磉_(dá)譜可用來鑒別和治療可能受益于一個特定治療的患者，也可用來排除對一個特定治療的患者進(jìn)行治療，該患者可能從藥物或治療中受益很少或者根本不受益。用于建立基因表達(dá)譜(包括那些用于得到相關(guān)生物途徑的)的優(yōu)選方法包括確定產(chǎn)生的可以編碼蛋白質(zhì)或肽的RNA的量。這可以通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、競爭性逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Northern雜交分析和其他相關(guān)的測試來完成。當(dāng)可以用單個PCR反應(yīng)引導(dǎo)這些技術(shù)時，最好擴(kuò)增拷貝DNA(cDNA)或者復(fù)制產(chǎn)自mRNA的RNA(cRNA)。確定基因表達(dá)的一些方法可見于美國專利6,271,002；6,218,122；6,218,114；和6,004,755中。一個優(yōu)選的方法涉及計算出RASGRP1：APTX兩基因的比，以確定一個人是否可能對施用一種FTI的治療產(chǎn)生應(yīng)答。用于基因表達(dá)值的術(shù)語“比”或“RASGRP1：APTX兩基因比”在本專利中有一系列的技術(shù)解釋，很容易從上下文中看出。基本的層面上，雖然形式可能會有所不同，但意義是一樣的。比如，使用qPCR技術(shù)時，對應(yīng)兩個目的基因的比率的ΔCt值很容易得到，這是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員眾所周知的。該值可以這樣產(chǎn)生：用每個基因表達(dá)水平的歸一化Ct值，減去那個基因的平均Ct值，并除以該基因的Ct值中的標(biāo)準(zhǔn)偏差。兩個基因歸一化的Ct值之間的差異，即ΔCt值，對應(yīng)該基因表達(dá)比，當(dāng)表達(dá)比增大，ΔCt值減小，反之亦然。歸一化ΔCt值的例子可在圖6中用于RASGRP1和APTX的Y-軸找到。本文中，這樣的ΔCt值，甚至是歸一化ΔCt值可被看作RASGRP1：APTX兩基因的比。圖3A例子中，顯示了根據(jù)Y軸上的ΔCt值，閾值為0，以致應(yīng)答者都位于閾值下。例如分布在圖6X軸上的數(shù)據(jù)，當(dāng)兩基因比RASGRP1：APTX用陣列數(shù)據(jù)表達(dá)時，0的閾值對應(yīng)1的閾值。圖6僅說明從一種確定RASGRP1：APTX比值的方法到另一種方法是很容易實現(xiàn)的。作為另外一種選擇，基于把各種樣品和標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)/參考RNA比較的ΔΔCt值，該比值可以表達(dá)為一個正數(shù)。使用這樣常見的校準(zhǔn)器可使檢測更加便攜可靠，因為閾值根據(jù)實驗條件能夠且事實會發(fā)生改變，因為閾值主要是通過其對測試環(huán)境中患者的分類表現(xiàn)來定義的。在一個使用RT-PCR的優(yōu)選實施例中，正如本技術(shù)說明中其它地方描述的，兩基因比RASGRP1：APTX可根據(jù)ΔΔCt值表示為一個正數(shù)，用于對替吡法尼應(yīng)答者和對替吡法尼無應(yīng)答者進(jìn)行分類的比值為一個5.2的值。RASGRP1：APTX兩基因的比值，根據(jù)ΔΔCt值可表達(dá)為一個正數(shù)，這樣的例子可見于圖12B的Y軸，這個基因比也被做為上下文明確了應(yīng)該如何解釋RASGRP1：APTX兩基因比。嚴(yán)格地說，一個本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員會了解到，一個閾值或RASGRP1：APTX兩基因比值根據(jù)一個或者更多ΔΔCt值可表達(dá)為一個值，以陣列數(shù)據(jù)的形式可表達(dá)為ΔCt值，在沒有額外信息輔助作圖而可比性不能讓他們找到已有的相互可兌換性時，這僅能表達(dá)為ΔΔCt值。應(yīng)按照以上內(nèi)容去理解本權(quán)利要求書和說明書。為清楚起見，這兩基因的比率RASGRP1：APTX被表示為ΔΔCt比率RASGRP1：APTX或ΔCt比率RASGRP1：APTX或ΔΔCt閾值或ΔCt閾值，當(dāng)沒有提供這樣的解釋，可從上下文輕易得到正確解釋。確立一個閾值來區(qū)分應(yīng)答者和無應(yīng)答者之后，在介質(zhì)上確定兩基因的比例，例如如下所述的計算機(jī)可讀介質(zhì)。獲得包含病變細(xì)胞(如AML病例中造血原始細(xì)胞)的患者樣品。在一個優(yōu)選的實施例中，獲得RNA樣品，從病變的患者細(xì)胞擴(kuò)增，所述擴(kuò)增采用RT-PCR技術(shù)，兩基因比的計算借助外部歸一化參照。然后，在一個優(yōu)選的實施例中，如果兩個基因的比例大于預(yù)定閾值時，這個患者被歸類為可能應(yīng)答者，否則為非應(yīng)答者。同樣，可以用兩基因的比率監(jiān)測整個FTI治療過程中各個時期的治療應(yīng)答。如果兩基因的比率與應(yīng)答者是一致的，那么病人的治療繼續(xù)。如果不是，改變病人的治療。在檢測出臨床標(biāo)記或出現(xiàn)其它模糊的臨床征象之前，這種分析允許干預(yù)和調(diào)整治療。優(yōu)選的實施例可包括用于治療、診斷、預(yù)測、腫瘤分期和評估疾病的基因表達(dá)譜的表示，這些病被還原為可自動讀取的介質(zhì)，如計算機(jī)可讀介質(zhì)(磁和光等)。優(yōu)選的實施例還可包括此類介質(zhì)中評估基因表達(dá)譜的說明。例如，優(yōu)選的實施例可以包括一個內(nèi)含計算機(jī)指令的CD-ROM，指導(dǎo)對上述基因組的基因表達(dá)譜的比較。優(yōu)選的實施例中還可以數(shù)字化地記錄基因表達(dá)譜，使之可以與患者樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)對比。作為另外一種選擇，基因表達(dá)譜可以不同的表示格式進(jìn)行記錄。圖像記錄是一種此類格式。比如包含在“OMNIVIZ”和“樹視圖”計算機(jī)程序里面的聚類算法可以更好地幫助數(shù)據(jù)實現(xiàn)可視化。一種藥物的生物效應(yīng)可受藥物載體變化的影響，這種影響指一個或多個種類RNA的轉(zhuǎn)錄或降解速度上的變化、一種或多種多肽翻譯或翻譯后處理速度或程度變化、一種或多種蛋白質(zhì)降解速度或程度變化、一種或多種蛋白質(zhì)機(jī)能或活性的抑制或刺激等等。除了優(yōu)選FTI，優(yōu)選的藥物還包括那些調(diào)控MAPK/ERK信號通路、TGF-β、WNT或者凋亡途徑的。這些包括但不限于酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、P13K激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、細(xì)胞凋亡調(diào)控子和及其組合。在這些示例性藥物當(dāng)中，最優(yōu)選的是諾華制藥的“GLEEVEC”酪氨酸激酶抑制劑、U-0126MAP激酶抑制劑、PD-098059MAP激酶抑制劑、SB-203580MAP激酶抑制劑、反義基因、核酶和DNAzymeBcl-XL抗凋亡劑。其它有效藥物的例子包括但不限于美國專利6,306,897的calanolides；美國專利6,284,764中的取代雙環(huán)化合物；美國專利6,133,305中的二氫吲哚化合物；美國專利6,271,210中的反義寡核苷酸。有用的藥物組合物包括由本文所描述的藥物可由根據(jù)已知的方法配制，例如混合藥學(xué)上可接受的載體。這類制劑的載體和方法的實例可在《Remington′sPharmaceuticalSciences》上找到。為了形成適用有效給藥的藥學(xué)上可接受的組合物，這種組合物將含有有效量的藥物。有效量的藥物視個體的病情、體重、性別和年齡等的各種因素而定。其他因素包括給藥方式。藥物組合物可通過皮下、局部、口服和肌注等各種途徑提供給個體。本發(fā)明所述藥物包括基礎(chǔ)藥物分子的化學(xué)衍生物。也就是說，它們可能包含通常不屬于基礎(chǔ)分子部分的其它化學(xué)部分。這些部分可能改善基礎(chǔ)分子的溶解度、半衰期、吸收等。另外，這些部分可能減弱基礎(chǔ)分子的不良副作用，或減少基礎(chǔ)分子的毒性。這些部分的例子可見于各種文獻(xiàn)當(dāng)中，比如《Remington′sPharmaceuticalSciences》。根據(jù)本發(fā)明鑒別出的化合物可按適當(dāng)劑量單獨使用來獲得最佳的抑制或活性，同時最大限度地減少任何潛在毒性，其中所述劑量由常規(guī)測試確定。此外，其他藥物的共同給藥或順序給藥也是可取的。本文所述藥物可在常規(guī)器皿里按多種劑型給藥。例如，藥物可采用諸如片劑、膠囊劑(每個包括定時釋放和緩釋制劑)、丸劑、粉劑、粒劑、酏劑、酊劑、溶液、懸浮液、糖漿和乳劑的形式，或通過注射方式給藥。同樣地，可采用諸如靜脈內(nèi)給藥(注射和輸液)、腹腔內(nèi)、皮下、局部閉塞或局部不閉塞、肌肉注射等所有被藥物領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的形式。有效且無毒劑量的化合物可作為調(diào)節(jié)劑。在不止采用一種活性劑的組合治療中可同時施用活性劑，其中活性劑是按單獨劑量配給的，或它們的每一種可在分別錯開的時間給藥。給藥方案利用本發(fā)明中所述的化合物或調(diào)控劑，根據(jù)下列一系列因素選擇：類型、物種、年齡、體重、性別和患者的醫(yī)療狀況；待治療的病情的嚴(yán)重程度；給藥途徑；患者的腎和肝功能；所用的特定藥物。熟練的醫(yī)生或獸醫(yī)可輕易地確定并開出有效量的藥物以滿足預(yù)防、對抗、控制健康狀況進(jìn)展。在產(chǎn)生療效且無毒性的范圍內(nèi)實現(xiàn)藥物濃度的最佳精度，這要求給藥方案要基于藥物能到達(dá)靶位點的動力學(xué)。這就涉及到藥物分布、藥物平衡、藥物消除等考慮。本文描述的藥物組成活性成分，通常與合適的藥用稀釋劑、賦形劑或栽體(本文中統(tǒng)稱為“載體”)混合給藥，根據(jù)預(yù)期的給藥形式和常規(guī)的藥物實踐合理選擇賦形劑或載體，其中所述給藥形式指口服片劑、膠囊劑、酏劑、糖漿劑等。例如，對于以片劑或膠囊劑形式口服來說，可以將活性藥物組分與口服、無毒性的藥用惰性載體(例如乙醇、甘油、水等)組合。此外，在希望或必要時，也可以將合適的粘結(jié)劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入混合物中。合適的粘合劑包括但不限于淀粉，明膠，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜味劑，天然的和合成的樹膠例如阿拉伯膠，西黃蓍膠或藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙二醇，蠟等。在這些劑型中使用的潤滑劑包括但不限于油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯甲酸鈉，乙酸鈉，氯化鈉等。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。對于液體形式的活性藥物成分，可以結(jié)合有適當(dāng)風(fēng)味的懸浮劑或分散劑，比如合成的和天然的樹膠，比如黃蓍膠、阿拉伯膠、甲基纖維素等。其它可用的分散劑還可包括甘油等。對于腸胃外給藥，無菌混懸劑和溶液劑是期望的。當(dāng)需要靜脈內(nèi)給藥時，采用等滲制劑，其通常包含合適的防腐劑?；衔锘蛘{(diào)控劑可通過注射由溶解在惰性液體載體中的活性成分構(gòu)成的劑型，作為非腸道給藥的替代。所述注射可以是肌內(nèi)、管腔內(nèi)、氣管內(nèi)、或皮下注射?？勺⑸涞膭┬陀苫旌狭诉m當(dāng)惰性液體載體的活性成分組成?？山邮艿囊后w載體包括植物油，如花生油、棉子油、芝麻油等，以及有機(jī)溶劑，如丙酮縮甘油、環(huán)亞甲基甘油醚等。作為一種替代方法，也可以使用含水腸道制劑。植物油是優(yōu)選的液體載體。通過將活性成分溶解或懸浮在液體載體中制備該劑型，使得在最終劑型含有0.005％至10重量％的活性成分。本發(fā)明的所有引用在此并入本文作為參考。此外，也通過引用并入的先前提交的美國專利申請：2001年10月30日提交的60/340,938、2001年10月30日提交的60/338,997、2001年10月30日提交的60/340,081、2001年10月30日提交的60/341,012、2002年10月30日提交的10/283,975、2006年10月30日提交的11/589,660，包括所有引用的參考文獻(xiàn)。本發(fā)明公開了下列非限制性實施例作進(jìn)一步的說明。實例1材料和方法臨床評估在一個示例里，從開放標(biāo)簽、多中心、不對照的第2階段研究里收集骨髓樣品，該研究對過去未經(jīng)治療的高風(fēng)險AML老年患者采用替吡法尼(R115777，)和法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制治療的療效和安全性進(jìn)行研究。樣品采集與處理經(jīng)患者同意后，可在替吡法尼治療前收集骨髓標(biāo)本，隨后在現(xiàn)場對單核細(xì)胞進(jìn)行加工處理。用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋骨髓抽取物，用ficoll-diatrizoate(1.077g/ml)離心分離。用PBS洗滌富氧白血病血細(xì)胞兩次，于含有10％DMSO的PBS中重懸，并立即在-70℃至-80℃冷凍。利用Trizol試劑盒(Qiagen，SantaClarita，CA)從細(xì)胞樣品中提取總RNA。通過評估安捷倫生物分析儀上核糖體的存在來確定RNA質(zhì)量。質(zhì)量好的樣品采用基因芯片分析進(jìn)一步處理。根據(jù)生產(chǎn)商(Qiagen，SantaClarita，CA)的操作說明，從經(jīng)過Trizol處理的同一骨髓樣品中分離DNA。檢測樣品的全局基因表達(dá)、N-RAS突變，和/或特異性基因的定量PCR(如圖1)。N-RAS基因突變狀態(tài)如前面所述，用PCR和RFLP分析確定N-RAS中的激活突變分析。End等人(2001)。N-RAS基因的外顯子1和2在單個多重反應(yīng)中同時擴(kuò)增，將等分試樣用于第二輪PCR。第二輪擴(kuò)增中，自然或引物誘導(dǎo)的限制性內(nèi)切酶位點的抗裂解表明了突變的存在，所屬突變在被分析的基因座破壞了上述位點。用于分析的限制性內(nèi)切酶的特異位點是BslI(N-ras密碼子12和13)，MscI(N-ras密碼子61，位置1和2)，和BfaI(N-ras密碼子61，位置3)。反應(yīng)過夜消化，在安捷倫生物分析儀上對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。基因芯片分析根據(jù)Affymetrix(SantaClara，CA)的規(guī)程合成cDNA和cRNA。由于許多樣品的產(chǎn)量低，按照前面所述的美國專利公開號20070048782，進(jìn)行兩輪線性擴(kuò)增。為了雜交，在40mMTris-乙酸鹽、pH值為8.1、100mM的醋酸鉀和30mM的醋酸鎂中，11微克的cRNA在94℃的環(huán)境中孵育35分鐘來實現(xiàn)隨機(jī)片段化。片段化的cRNA放在設(shè)定在每分鐘60轉(zhuǎn)的45℃的搖床中16h，使之雜交U133A陣列。雜交后，洗滌陣列(用6xSSPE和含有TritonX-100(0.005％)的0.5xSSPE)，并用鏈霉親和素-藻紅蛋白(SAPE；MolecularProbes，Eugene，OR)染色。使用AgilentG2500AGeneArray(AgilentTechnologies，PaloAlto，CA)的掃描儀，對結(jié)合有標(biāo)記物的探針進(jìn)行量化。每個陣列的總熒光強度被調(diào)整到600的均值。通過計算信號對噪聲比(原始的平均信號/噪聲)，使芯片的性能定量化。如果它們的信噪比為小于20，或目前尋呼(presentcalls)在芯片上小于30％，那么從下一步分析中移除芯片。如果它們的目前尋呼存在至少10％的芯片上，進(jìn)一步分析只包含基因。約12,000Affymetrix公司探針組保持遵循這個臨界值。基因表達(dá)數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)一步通過受基于主成分分析的離群數(shù)據(jù)辨識以及基因強度的正態(tài)分布分析控制(PartekProV5.1)。微陣列數(shù)據(jù)已經(jīng)存放在NCBIs基因表達(dá)匯編里(GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。應(yīng)答定義當(dāng)患者有完全緩解(CR)、部分緩解(PR)，以及血液改善(HI)時，就可以定義為對替吡法尼應(yīng)答。簡單地說，把HI定義為所有骨髓原始細(xì)胞計數(shù)不到5％或骨髓原始細(xì)胞至少減少一半。把疾病進(jìn)展(PD)定義為骨髓原始細(xì)胞或骨髓原始循環(huán)細(xì)胞比基線增加＞50％，或出現(xiàn)新的循環(huán)原始細(xì)胞(至少連續(xù)2次)。疾病穩(wěn)定(SD)定義為任何不符合CR、PR、HI、或PD標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)答。把統(tǒng)計分析用ROC分析測試單個基因和/或多個基因分類的整體預(yù)測值。用以下基因篩選標(biāo)準(zhǔn)對響應(yīng)者和疾病進(jìn)展患者中的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選：鑒別應(yīng)答者的特異性為100％為敏感性＞＝40％，T-檢驗p值(log2異方差轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù))＜0.05，倍數(shù)變化＞2。通過這些標(biāo)準(zhǔn)的基因用AUC(ROC曲線下面的區(qū)域)分級。建立一個分類，用應(yīng)答評分計算每位患者對替吡法尼治療應(yīng)答的可能性。所述應(yīng)答評分被定義為加權(quán)表達(dá)信號和作為權(quán)重的t-統(tǒng)計量之間的線性組合。閾值由試驗組的ROC曲線確定，以確保敏感性為100％和特異性達(dá)到最高。用為了確定預(yù)測所需的基因數(shù)量，使用留一交叉驗證法(LOOCV)?；诨虻牟煌瑪?shù)量，記錄“l(fā)eft-out”樣品的應(yīng)答評分。對于基因數(shù)量不一的預(yù)測表現(xiàn)，根據(jù)以下因素來評估預(yù)測的表現(xiàn)：誤分率、靈敏度、特異性、測量兩個預(yù)測組的Kaplan-Meier曲線分離的p值。相應(yīng)地選出最好的預(yù)測。TopScoringPair(TSP)算法最早是由Geman等提出的(2004)。本質(zhì)上，該算法是根據(jù)事件頻率的絕對差值(Dii)排列所有基因?qū)?基因i和j)，其中在C1和C2類的樣品中，基因i的表達(dá)值比基因j的要高。如果有多個得分高的對(共享同一個Dij)，選擇排名次要的最高對，在所選的基因基因?qū)?nèi)基因表達(dá)水平倒置在每級都會出現(xiàn)。在所有樣品中，選擇頻率最高的得分高的對為候選對，其中所述最高頻率指絕對Dij＞大于2倍變化的。然后在一獨立的測試數(shù)據(jù)集中評估候選對。在試驗數(shù)據(jù)集中使用缺一交叉驗證法(LOOCV)以評估該算法如何執(zhí)行。根據(jù)最大的誤分率，評估預(yù)測的表現(xiàn)。所有統(tǒng)計分析都使用R(RDevelopmentCoreTeam，2006)。實時定量RT-PCR根據(jù)銷售商的說明，對于每個樣品，1μg總RNA(以O(shè)D260評估)的逆轉(zhuǎn)錄使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)。然后將樣品放在25℃下10分鐘，然后37℃下30分鐘以獲得最佳的RNA轉(zhuǎn)換。QPCR分析使用ABIPrism7900HT序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)所有樣品重復(fù)測定三次。每個反應(yīng)包含5μlUniversalPCR預(yù)混液，其中包含UNG(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)，4.5μlcDNA模版和0.5μl20x測定所需的基因表達(dá)檢測預(yù)混液或9pmol的正向和反向引物，和2.5pmol探針(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)，總反應(yīng)體積為10μl。所有引物、探針組的選擇都依據(jù)所使用的小擴(kuò)增子大小(小于100個核苷酸)和FAM熒光探針。使用的探針和引物為APTX(產(chǎn)品編號4331182AppliedBiosystems)和RASGRP1(產(chǎn)品編號4351372AppliedBiosystems)。RASGRP1：APTX表達(dá)比的計算為：通過減去樣品集里平均Ct歸一化Ct值，除以標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后算出各基因(APTX-RASGRP1)歸一化的Ct值的差值。結(jié)果本研究旨在探討過去未經(jīng)治療的高風(fēng)險急性髓性白血病老年患者在法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑替吡法尼的2期臨床試驗中的基因表達(dá)譜。Lancet等人(2006)。在用替吡法尼治療前采集67例患者的骨髓樣品，用Ficoll-密度離心法富集白血病骨髓細(xì)胞(表1)。把來自13位應(yīng)答者(9CR，4HI)、8位病情穩(wěn)定患者以及13位疾病進(jìn)展患者的高質(zhì)量的總RNA擴(kuò)增、標(biāo)記、和AffymetrixU133A基因芯片雜交。用qPCR評估總30個樣品以驗證具體基因，并評估32個樣品的N-RAS突變狀態(tài)。表1：特征患者比較。CR＝完全應(yīng)答；PR＝部分應(yīng)答；HI＝血液學(xué)改善，SD＝疾病穩(wěn)定，PD＝疾病進(jìn)展，NE＝無法評估；PGx＝藥物基因組Ras突變狀態(tài)和病人結(jié)果。篩選來自32AML患者骨髓的DNA以進(jìn)行N-Ras激活突變(密碼子12，13，61)。34％的患者(11/32)表現(xiàn)出N-Ras基因突變，一位患者在多個密碼子突變(表2)。N-RAS基因突變狀態(tài)和對替吡法尼的應(yīng)答或總生存期之間沒有統(tǒng)計上的顯著相關(guān)性。表2：ND＝尚未確定；WT＝野生型；CR＝完全應(yīng)答；PR＝部分應(yīng)答；HI＝血液學(xué)改善，SD＝疾病穩(wěn)定，PD＝疾病進(jìn)展，OS＝總生存期。來自新診斷AML隊列的預(yù)測基因的鑒定下個目標(biāo)是對新診斷AML病人能預(yù)測對替吡法尼應(yīng)答的基因進(jìn)行鑒定。為此，在13例應(yīng)答者(9CR和4HI)和13例疾病進(jìn)程患者身上進(jìn)行探索性實驗。病情穩(wěn)定的患者不列入這項分析中，因為不能清楚地鑒別他們是應(yīng)答者還是無應(yīng)答者。可用同樣的方法來鑒定復(fù)發(fā)和難治性AML(20070048782)的標(biāo)記，確定了45組能預(yù)測響應(yīng)的探針組(相應(yīng)于38個獨特的基因)(表3)。旨在鑒別可以預(yù)測應(yīng)答者的基因選擇標(biāo)準(zhǔn)：高靈敏度(約100％)、特異性閾值40％和平均基因表達(dá)差異至少2倍?；谇€下面積(AUC)對基因進(jìn)行排序，其中所述曲線下面積(AUC)是根據(jù)試驗組的受試者工作特征(ROC)分析定義的。此值表示基因的整體預(yù)測值，AUC為1.0時表示完全分類。首先用LOOCV方法對試驗組里的每個基因進(jìn)行初步測試。最上方的基因，RAS鳥苷釋放蛋白1(RASGRP1)顯示0.95的AUC。表3：新診斷AML患者中預(yù)測應(yīng)答替吡法尼的45探針組Spec＝特異性，F(xiàn)C＝倍數(shù)的變化，AUC＝受試者工作特征分析的曲線下面積，t統(tǒng)計量為負(fù)值表明應(yīng)答者的基因應(yīng)答。對增加分類中基因數(shù)量是否能夠提高其預(yù)測值，也進(jìn)行了檢驗。檢驗采用留一交叉檢驗法，并作圖表示每個分類的靈敏度、特異度及整體誤差率，發(fā)現(xiàn)僅頂部基因提供了最佳預(yù)測值(數(shù)據(jù)沒有顯示)。以線性方式增加分類中的基因并未提高其預(yù)測值。采用高靈敏度的臨界值，LOOCV表明RASGRP1基因表達(dá)允許：NPV88.9％，PPV70.6％，總體預(yù)測精度76.9％(圖1A)。此外，KaplanMeier分析顯示應(yīng)答者(386天)和疾病進(jìn)展應(yīng)答者(68天)在中位總生存期上存在顯著差異(圖1B)。因此，單基因的過度表達(dá)以高陰性預(yù)測值預(yù)測了初診AML患者對替吡法尼的應(yīng)答，其中所述患者具有。TopScoringPair分類的鑒定RASGRP1預(yù)測值無法通過線性增加所述分類的基因數(shù)提高。用另一種基因選擇算法篩選可單獨提高RASGRP1預(yù)測值的基因。為了這個目的，最高得分對算法(TSP)被用來鑒別具有最高預(yù)測精度的最佳基因?qū)Αeman等人(2004)。用所述方法獲取兩個基因表達(dá)的最大差異，所述方法也在研究基于定量聚合酶鏈反應(yīng)的診斷方法中發(fā)揮作用。測試集里的最高分對是RASGRP1和aprataxin(APTX)。RASGRP1和APTX在應(yīng)答者中分別被表達(dá)過度和表達(dá)不足。健全的LOOCV顯示：在整體誤差率僅為8％(圖2A)的樣品測試集中，最高分配對(TSP)提供85.7％的NPV和91.7％的PPV。預(yù)測的應(yīng)答者和無應(yīng)答者的總生存期相差357天(圖2B)。這些數(shù)據(jù)表明建模算法的具有低的相關(guān)預(yù)測誤差率。在獨立的復(fù)發(fā)性或難治性AML中驗證RASGRP1：APTX分類對最高分對(TSP)分類的外部檢驗是在基因芯片數(shù)據(jù)集里進(jìn)行，所述數(shù)據(jù)集包含54位復(fù)發(fā)性AML或難治性AML患者的樣品。因為盡可能捕獲更多的潛在應(yīng)答者十分重要，所以診斷測定應(yīng)具有高度的靈敏度(以及高度的陰性預(yù)測值)，所述診斷測定能預(yù)測對癌癥治療的可能應(yīng)答。因此，為了確定一個能測試TSP分類的合適臨界值，除了保持特異性的水平可接受，還需取得一個能預(yù)測應(yīng)答者的高靈敏度。在測試集中，得到的特異性水平約為30％到100％，而相應(yīng)的敏感性水平在100％到80％之間。為確保分類能夠預(yù)測盡可能多的應(yīng)答者，在測試集中，利用可提供約60％特異性的保守臨界值進(jìn)行檢測。該臨界值應(yīng)用于復(fù)發(fā)性及難治性AML獨立檢測組中，RASGRP1：APTX基因分類用92％NPV和27.6％PPV(相比較18.5％患病率)對應(yīng)答者分類(圖3C)。應(yīng)答者的相關(guān)比值比是4.38。雖然與單獨RASGRP1的預(yù)測精度相似，但TSP分類的應(yīng)用顯示了更好的NPV，和改善的預(yù)測應(yīng)答者和進(jìn)展者之間在98天的總生存期上的差異(圖3A)，相比之下，RASGRP1的相應(yīng)數(shù)值為56天(圖4)。QPCR驗證RASGRP1：APTX表達(dá)比率兩個基因的表達(dá)比率可以用與臨床更加相關(guān)的QPCR檢測系統(tǒng)。三十個樣品(20PD，6CR，3HI和1PR)為qPCR提供了足量的總RNA。因此，在來自初診AML臨床研究的30個樣品(10個應(yīng)答者，20個疾病進(jìn)展)中，作為替吡法尼應(yīng)答預(yù)測的RASGRP1：APTX基因表達(dá)比率利用qPCR評估。在基因芯片平臺上檢測其中的九個樣品，而另外21個樣品因RNA質(zhì)量問題沒有被采用。因此，該實驗集的三分之二由完全獨立的樣品組成。九個樣品的評估顯示兩個平臺的RASGRP1：APTX基因表達(dá)比率呈正相關(guān)(r＝0.74)(圖6)。通過使用臨界值0，兩基因分類以PPV和NPV分別為50％和81％準(zhǔn)確預(yù)測了三十位患者中的二十位的治療效果(圖3B)。預(yù)測耐藥患者的中位總生存期為82天，而歸類為應(yīng)答者的患者的中位總生存期為295天(圖3C)。RASGRP1：APTX分類在沒有FTI治療時無預(yù)測實用性在獨立的基因芯片數(shù)據(jù)組中，測試兩個基因表達(dá)比率，所述基因芯片數(shù)據(jù)組由116位接受化療方案的AML患者組成。RASGRP1：APTX分類用于這組患者，采用與接受tipifanib療法人群相似的臨界值，二者的總生存期上并未出現(xiàn)顯著差別(圖5)。當(dāng)使用其他范圍的臨界值時，也觀察到顯著的生存期差異(表4)。這表明RASGRP1：APTX分類特異性地用于對接受過替吡法尼治療的患者分類，與非-FTI不相關(guān)。另一方面，當(dāng)預(yù)測標(biāo)記應(yīng)用到復(fù)發(fā)和難治的AML患者，在總生存期方面有很明顯的分層。表4：OS＝總生存期實例2該實施例描述了一個改良RT-PCR測定，適于將兩基因測定應(yīng)用到FTI聯(lián)合治療中。在分析檢測中為以下3標(biāo)記設(shè)計Taqman檢測：RASGRP1(激活RAS的鳥苷酸交換因子)，APTX(參與DNA切除修復(fù)的Aprataxin)和HMBS(作內(nèi)部參考)。HMBS作為內(nèi)部參照用于一個實施例，但在其它實施例中省略。本申請的摘要部分和序列部分列出了Taqman引物探針組及其擴(kuò)增子。即，對APTX-SEQ#3-4和2，RASGRP1引物探針組SEQ#56和1；和HMBS-SEQ#7-9。在單管多重形式下利用ABI-7500平臺以評估2基因比率表現(xiàn)，其中所述評估利用FAM-標(biāo)記的RASGRP1，Gold540-APTX和Cy5-HMBS，從而發(fā)展并優(yōu)化定量RT-PCR檢測。JY細(xì)胞RNA和通用RNA(Stratagene)用作外部歸一化。RASGRP1：APTX比率＝2^-((A-B)-(C-D))其中A：樣品RASGRP1Ct值B：JY(或通用)RNA(+)RasGRP1Ct值C：樣品APTXCt值D：JY(或通用)RNA(+)APTXCt值如果提供其他來源的細(xì)胞RNA用于檢測，用于外部歸一化的個別細(xì)胞RNA對測定分析參數(shù)(特別是是閥值)重新計算。用于外部歸一化的參照RNA優(yōu)選自在給定條件下生長的細(xì)胞系，其中所述參照RNA對FTI相對不應(yīng)答。不受理論的限制束縛，一個合適的參照RNA可能源自對FTI有中性應(yīng)答的細(xì)胞系。除了對FTI治療無應(yīng)答的患者，這樣的細(xì)胞系參考也可源自基于兩個基因測定在閾值區(qū)域的測試患者。因此，不受理論的約束，這樣的患者會成為完善改良參照RNA的可能來源用于兩個基因比率測試。當(dāng)細(xì)胞系在兩個基因測定中用作外部參考時，完善和估測細(xì)胞系的可行方法之一是選擇一個趨向提高閾值的細(xì)胞系。這個標(biāo)準(zhǔn)是合理的，因為這樣的細(xì)胞系把測定的兩個基因比率降低(由于兩個被測基因應(yīng)答之間可能的相關(guān)性)到最小。此外，考慮到絕對定量的影響，也可使用給定的APTX和RASGRP1RNA組合來選擇外部參考，通過用AUC使應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間的區(qū)別最大化。外部參考的選擇并非是兩個基因測定中閾值變化的唯一來源。完善兩個RT-PCR形式，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析評估它們的表現(xiàn)。無論是利用3個標(biāo)記的原始Cts，還是利用源自它們的2基因比率值(R2＝1-0.93，P＜0.000；表5)，這兩種形式在高Pearson相關(guān)性時顯示等同表現(xiàn)。表5：RUO和GMPRT-PCR檢測中Pearson相關(guān)性RUO使用由(Cat.No.4392938)商售獲取的RNA-to-CtOneStepRT-PCR試劑盒。根據(jù)制造商的說明書，放入50ng的總RNA，這個形式的反應(yīng)體積是20μl。根據(jù)制造商的說明，這種形式反應(yīng)體積20μl，50ng總RNA。GMP形式基于BLNRT-PCR試劑盒組分(BreastLymphNode(BLN)TestKit，IVD，Cat#2900004)及BLNEnzymeMix，IVD，P/N7700040和BLNBaseMasterMix，P/N7700031用于RT-PCR預(yù)混。利用下述優(yōu)化的RT步驟，該GMP形式具有50ngRNA輸入的25μl反應(yīng)。GMP形式中RT-PCR多重規(guī)程在三重qRT-PCR檢測中，用總RNA中的50ng作為目標(biāo)輸入，其中所述三重qRT-PCR檢測在AppliedBiosystemsPrism7500序列檢測系統(tǒng)上操作，反應(yīng)體積是25μL。把RNA樣品(包括歸一化參考RNAs)在冰上解凍，并將其稀釋至10ng/μl。該qRT-PCR操作需要來自BLNRT-PCRKit(BreastLymphNode(BLN)TestKit，IVD，Cat#2900004)的試劑：BLNEnzymeMix，IVD，P/N7700040和BLNBaseMasterMix，P/N7700031。25X探針-引物混合液制備包括：400nMSEQNo.1和2，分別地，和200nMFAM-標(biāo)記的RasGRP1(SEQNo.10)；400nMSEQNo.3和4，以及200nMGold540-APTX(SEQNo.11)，和400nMSEQNo.8和9a，以及200nMCy5-HMBS(SEQNo.12)，如表6所示。表6：25X探針/引物混合液3plex-1(25X)序列Add/rxn原液500最終濃度.標(biāo)記在25μL中RASGRP1RASGRP1SEQNo.10.1050.000.4μMRASGRP1SEQNo.20.1050.000.4μMRASGRP1(Fam)SEQNo.100.0525.000.2μMAPTXAPTXSEQNo.30.1050.000.4μMAPTXSEQNo.40.1050.000.4μMAPTXSEQNo.11(Gold)0.0525.000.2μMHMBSHMBSSEQNo.80.1050.000.4μMHMBSSEQNo.90.1050.000.4μMHMBSSEQNo.120.0525.000.2μMidTe0.25125.00總計1.00500.00每個反應(yīng)包含9μL的BLNBase預(yù)混液、10μL的2.5XBLN酶混合液和1μl25X的引物/探針混合液。引物/探針混合液中，正向和反向引物的最終濃度為400nM，每個指標(biāo)的熒光探針的最終濃度為200nM。把來自患者樣品或歸一化參照的5μl總RNA加到20μl的RT-PCR預(yù)混液里?；谟米魍獠繗w一化參照的JY細(xì)胞RNA，確定閾值/監(jiān)界值為5.2。qRT-PCR按照如下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行：在95℃下1分鐘以變性；在58℃30分鐘(RT反應(yīng))；5％比率升至70℃，以及孵育2分鐘，接下來40個循環(huán)的95℃15秒(變性)和60℃下1分鐘(退火/延伸)。在一個單管多重裝置GMPRT-PCR形式中，優(yōu)化的探針引物濃度，得到一個對來自骨髓和外周血樣品的RNA靶標(biāo)的高強高敏感的檢測，檢測在0.6ng水平下的Ct值約31，即在Ct值的低變異性和高度再現(xiàn)性的范圍中(圖3)?；贕MP級試劑配制和用于FDA許可的BLN試劑盒(例如Tth聚合酶(酶混合液)和基礎(chǔ)預(yù)混液)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，該反應(yīng)形式適用于商業(yè)測試。表7中提供了一些基于規(guī)程的預(yù)混液細(xì)節(jié)。表7：基于規(guī)程的預(yù)混液數(shù)據(jù)分析1.采用標(biāo)準(zhǔn)獲取自ABI7500數(shù)據(jù)輸出文件的循環(huán)閾值(CT)用于數(shù)據(jù)分析。如下選擇每個標(biāo)記“未檢測到”的Ct限值：HMBS(內(nèi)部對照標(biāo)記)Ct值不應(yīng)大于30；RASGRP1Ct-不大于35并且APTXCt-不大于35。如果一個樣品具備RASGRP1或APTX兩個標(biāo)記中任何一個超過Ct臨界值的話，則被視為“未檢出(NoTest)”(從數(shù)據(jù)分析中排除)。表8中列出的結(jié)果顯示了單重和三重(單管)形式下RT-PCR在比較斜率和PCR效率時的等效。表9顯示延伸RT步驟至30min時的進(jìn)一步改進(jìn)。利用RT-PCRGMP格式，通用RNA(來自AGILENTTM)和JYRNA對照(源自室內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞系)與第2階段T+E研究的37個患者樣品運行RT-PCR。該分析隨后用40個患者樣品重復(fù)?；诮Y(jié)果的POC曲線分析，列于表10的兩種分析結(jié)果表明，使用JY或通用RNA參照就利用調(diào)整閾值的原始Ct歸一化而言，測定的表現(xiàn)等同。通用RNA作為外部參照時的閾值為7.3，而JYRNA作為外部參照時的閾值為5.2。在這些閾值測定中，計算處理的CR作為應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)，處理的所有其他的應(yīng)答類型被視為非應(yīng)答。雖然在2基因檢測中的閾值是無量綱的(即為RASGRP1與APTX比率)，不受理論的約束，據(jù)信該閾值可依賴于標(biāo)準(zhǔn)條件和所用的試劑。因此，相對于基于標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)的指定閾值是優(yōu)選的，例如基于標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線。因此，可以調(diào)整閾值/臨界值以滿足其他要求，如外部參照變化時保持AUC值恒定。在這種情況下，使用通用RNA代替JYRNA作為外部參照導(dǎo)致較高的閾值/臨界值7.3，而AUC不變。實例3這個例子顯示了兩基因檢測在新診斷的AML患者中是有效的。2基因應(yīng)答預(yù)測分析測試首先在一組84位初診AML患者的白血病細(xì)胞中進(jìn)行，所述患者參加了替吡法尼和依托泊苷的第1階段劑量研究，其采用在Blood2008，111：2589中描述的RT-PCR技術(shù)方案。第一階段試驗的臨床計劃描述于Blood2009，113：4841。簡而言之，對來自該研究的51個未公布評估的患者樣品進(jìn)行了分析，以對2基因檢測的性能表現(xiàn)初步評估。表11匯總了閾值為5的，RR代表表現(xiàn)CR或PR應(yīng)答者的應(yīng)答速度，PPV為陽性預(yù)測值，NPV為陰性預(yù)測值。51例患者中的13個應(yīng)答的RR值為約0.25。在兩基因檢測那些超過閾值5的人中，一半(18中的9個)應(yīng)答為約0.5的PPV。在不超過閾值的患者中，33人中有29個不應(yīng)答，導(dǎo)致NPV為0.88。比較RUO和GMPRT-PCR形式使用RUO和優(yōu)化的GMPRT-PCR形式基因表達(dá)圖譜，對來自初診AML患者的33份骨髓標(biāo)本的臨床應(yīng)答評估進(jìn)行了分析。數(shù)據(jù)組的一個患者樣品不滿足分析納入標(biāo)準(zhǔn)，因此被排除出兩個數(shù)據(jù)組。最好應(yīng)答表現(xiàn)的病人注釋列于表12。在隨后的數(shù)據(jù)對應(yīng)中，對33名患者再次進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有7個完全緩解(CR)，4HI，3PR，7PD和11SD病例(表13)。當(dāng)使用CR作為應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)時，7例患者被列為應(yīng)答者且25個列為非應(yīng)答者，而當(dāng)使用CR/PR/HI作為應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)時，12例患者被列為應(yīng)答者且20例患者列為無應(yīng)答。對測試結(jié)果進(jìn)行初步統(tǒng)計分析以評估分離“正常”(應(yīng)答者，R)與“不正常(非應(yīng)答，NR)可能的臨界值，應(yīng)答患者表現(xiàn)出CR，PR或HI，兩種RT-PCR形式的ROC曲線分析表明幾乎等同的檢測性能，而2基因的AUC值比率等于71％(表14)?；赗OC曲線分析算法，當(dāng)使用JYRNA作為歸一化參照時，RUO方案的臨界值被確定為4.7，GMP形式的臨界值為5.2。不受理論的約束，基于采用的形式基礎(chǔ)上的閾值和其他參數(shù)的差異被認(rèn)為是，在某種程度上，由于RT-PCR程序和統(tǒng)計誤差的特異性或效率。表14：RUO和GMP形式比較對于表12和表13列出的數(shù)據(jù)，在后期的數(shù)據(jù)分析中，視應(yīng)答者為僅表現(xiàn)出完全緩解(CR)的患者，PR和HI患者被納入非應(yīng)答者組(見表15中結(jié)果)，其相應(yīng)于RUO方案的閾值為5.1，而基于ROC曲線分析算法的GMP格式相應(yīng)的閾值為5.2。當(dāng)GMPRT-PCR數(shù)據(jù)組使用臨界值5.2時，總應(yīng)答率(患者表現(xiàn)出CR或PR或HI)從38％(ORR)增加至86％(PPV)，而使用JYRNA時陰性預(yù)測值為76％(表16)。換言之，兩基因檢測實際應(yīng)答中86％的病人被列為應(yīng)答者，這是一種改進(jìn)。這一結(jié)果可與年輕患者誘導(dǎo)治療的70％應(yīng)答相媲美。換言之，在GMP的RT-PCR形式檢測中表現(xiàn)出2基因比率值大于5.2的那些患者中有86％(6/7患者)對替吡法尼和依托泊苷的組合治療有應(yīng)答(對應(yīng)于PPV為86％)。與此相反，2基因比率值小于或等于5.2的患者中僅有24％(6/25患者)對替吡法尼和依托泊苷的組合治療有應(yīng)答，但在2基因檢測中未檢測到。應(yīng)當(dāng)指出的是，可以調(diào)整閾值/臨界值以滿足其他要求，如外部參照變化時保持AUC值恒定。在這種情況下，使用通用RNA代替JYRNA作為外部參照導(dǎo)致在一個約8的較高閾值/臨界值(從約5)。對僅表現(xiàn)出完全恢復(fù)的應(yīng)答者的隨后分析列于表17，顯示了優(yōu)異的NPV值和更高的靈敏度和相媲關(guān)的特異性。Kaplan-Meier曲線分析中危險比(HR)為2.3表示了正向的趨勢，在老年初診AML患者中與替吡法尼和依托泊苷組合相比較有利于2基因檢測在R和NR預(yù)測應(yīng)答中的有效性(圖8和圖13，二者在用于鑒定應(yīng)答者的定義中不同)。基于檢測性能特性的等效性，GMP形式期望被進(jìn)一步發(fā)展為伴侶診斷分析。進(jìn)一步的GMPRT-PCR形式測試隨后，通過向現(xiàn)有的一組33個骨髓樣品增加4個評估全血樣品，在37例患者中用進(jìn)一步改進(jìn)的單管多重RT-PCR檢測法進(jìn)行了測試。就三個標(biāo)記而言由于骨髓和全血樣品均源自相同的原始Ct值，它們被合并在一個單一的數(shù)據(jù)組，歸納于表18。接收器-操縱子特征(ROC)分析表明2基因比率的差值為80％(AUC＝0.80)在完全緩解(CR)患者組中用于預(yù)測整體應(yīng)答的應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)，相應(yīng)的整體應(yīng)答ORR(24％)計算為CR(9)/總患者N(37)。示于圖9和圖14。在2基因比率臨界值為5.2時檢測靈敏度為67％，特異性為93％。在表18的應(yīng)答者定義范圍內(nèi)，表18中擴(kuò)展的患者組整體檢測表現(xiàn)在表19中描述。實例4該實施例表明，與先前的實施例一致，兩基因檢測法對于包含F(xiàn)TI的治療是特異性的。另一藥劑的協(xié)同存在沒有明顯降低FTI對于兩基因檢測有效性的需求。然而簡單地，在一組通過2基因檢測鑒定患有AML的患者中，對這種患者利用包含F(xiàn)TI(如Zarnestra)的組合治療可能是有效的，但是可以預(yù)期的是，當(dāng)組合治療中不存在一種FTI時，2基因檢測法將不會有幫助的。為了實驗性評估2基因檢測的特異性，測試了來自沒有被FTIZarnestra治療過的AML患者中的41個樣品，以確認(rèn)應(yīng)答是否與與2基因檢測結(jié)果相關(guān)。這些患者均采用ARA-C，蒽環(huán)類和VP16(AcDVP16，N＝23)和FLAM(n＝18)組成的傳統(tǒng)化療方案治療。圖10表明2基因比率和臨床應(yīng)答或總生存期之間沒有顯著關(guān)聯(lián)性。因此，這些結(jié)果進(jìn)一步證實了2基因比率檢測法不能在非FTI-治療的AML患者中預(yù)測治療應(yīng)答。ROCAUC測定為為0.5，表明了在預(yù)測不包括FTI的化療方案的臨床應(yīng)答中沒有顯著價值。此外，當(dāng)受試者基于2基因比的中位數(shù)(0.959)被列為或高或低比率，即第25分位數(shù)(0.561)，第75分位數(shù)(1.248)，總生存期沒有表現(xiàn)出有益效果。生存分析如下：1)所有患者，2)僅VP16和3)僅FLAM。結(jié)果(圖10和15，所有患者)顯示，在中值比率分層的兩組之間以及治療方案分層的兩亞組之間總生存期(天數(shù))沒有顯著差異。使用在第25和75分位數(shù)(數(shù)據(jù)未示出)的切點時也發(fā)現(xiàn)了這一點。實例5本實施例說明并非所有的樣品采集技術(shù)是等效的。依賴于樣品收集方案的過度RNA降解和其他來源的變異可以影響兩基因檢測。樣品收集方案通常需要在兩基因檢測的實施之前使用骨髓樣品。對于AML患者這不僅是相當(dāng)侵?jǐn)_性的，也是痛苦的。新的方案允許使用全血，如本例中所述。為檢測等效性確定一個優(yōu)選的樣品采集方案(樣品類型)，試驗研究在兩種類型的樣品(骨髓與全血)中進(jìn)行，分別使用三(3)個收集方案(Paxgene系統(tǒng)與一個在肝素和EDTA管中的標(biāo)準(zhǔn)收集方法，以及通過Ficoll-Paque離心法)。對約翰·霍普金斯大學(xué)SidneyKimmelComprehensiveCancerCenter提供的11例AML患者進(jìn)行了測試。根據(jù)在圖11中所示的工作流，對兩個樣品類型的每一個均用三種采集方法，從每個患者抽取大約11毫升的血液和8-10mL的骨髓。依據(jù)實驗設(shè)計測試了以下六項方案，如圖11所示：方案1：PAXgeneTM骨髓系統(tǒng)目錄No.764114(PreAnalytix，AQIAGEN/BDCOMPANY)。收集2毫升容積的BMA于PAXgeneTM骨髓管，并在冷凍冷藏包上環(huán)境溫度下24小時內(nèi)轉(zhuǎn)運到VRX。收到樣品時使用PAXgene骨髓RNA試劑盒分離RNA(Cat.No.764133)。方案2：在肝素鈉管(2mL樣品量)收集BMA，并在冷凍冷藏包上環(huán)境溫度下24小時內(nèi)運到VRX。Ficoll-Hypaque密度梯度離心步驟與細(xì)胞沉淀在-80C直接冷凍和用QiagenBloodMid試劑盒提取RNA在Veridex中進(jìn)行。方案3：在EDTA管(2mL樣品量)收集BMA，并在冷凍冷藏包上環(huán)境溫度下24小時內(nèi)運到VRX。Ficoll-Hypaque密度梯度離心步驟與細(xì)胞沉淀在-80C直接冷凍和用BloodMidi試劑盒提取RNA在中進(jìn)行。方案4：PAXgeneTM血液系統(tǒng)。在PAXgeneTM血液試管中采集2.5mL血液(Cat.no.762165，PreAnalytix，AQIAGEN/BDCOMPANY)并在冷凍冷藏包上環(huán)境溫度下24小時內(nèi)運到VRX。使用PAXgeneBloodRNA試劑盒(Cat.no.762164)在Veridex內(nèi)分離RNA。方案5：在肝素鈉管(4mL血液)收集全血，并在冷凍冷藏包上環(huán)境溫度下24小時內(nèi)運到VRX。將3mL血液轉(zhuǎn)移到4毫升CPT管，隨后Ficoll分離單核細(xì)胞和在-80C直接凍結(jié)細(xì)胞沉淀在Veridex中進(jìn)行。使用QiagenBloodMidi試劑盒提取RNA。方案6：在EDTA管收集全血(4mL血液)，并在冷凍冷藏包上環(huán)境溫度下24小時內(nèi)運到VRX。將3mL血液轉(zhuǎn)移到4毫升CPT管，隨后Ficoll分離單核細(xì)胞和在-80C直接凍結(jié)細(xì)胞沉淀在Veridex中進(jìn)行。使用QiagenBloodMidi試劑盒提取RNA?；贏gilentBioAnalyzerQC得出的結(jié)果，相對于最常用于臨床實驗室設(shè)置的肝素和EDTA方案，對所有11例患者的骨髓和血液樣品使用PAXGene系統(tǒng)均得出質(zhì)量良好的RNA。RNA完整性評估(RNAQC)的直接方法是在AgilentBioAnalyzer上運行RNA和計算RIN值(RNA完整性數(shù)目)。按照Qiagen公司的PAXgene系統(tǒng)建議，RNA具有RIN7及以上(至10)被認(rèn)為是質(zhì)量良好的目標(biāo)。請參閱表17中用于11例患者樣品的穩(wěn)定性研究的用RIN值列出的附加數(shù)據(jù)。突出顯示為黃色的RIN值對應(yīng)于質(zhì)量差的RNA樣品(來自肝素和EDTA管)?；诳稍u估的基礎(chǔ)上獲取樣品，相比其他2種類型的收集管，PAXgene系統(tǒng)生成的只有良好質(zhì)量的RNA。在表20中，NE代表沒有評估；NA表示無法獲??；約2至5的RIN值表示降解的RNA；為約5至7的RIN值表示勉強合格RNA。由于樣品制備步驟后樣品量不足，樣品標(biāo)記NE為沒有分析。圖12(板A和B)示出了骨髓樣品數(shù)3和6展示了肝素的管中大量RNA降解，該降解升高了2基因比率值。原始Cts與RIN值呈負(fù)相關(guān)：對于低RIN值高Cts均產(chǎn)生在肝素和EDTA方案的所有3個通道。如圖12A和12B所示，兩基因檢測中沒有樣品超過閾值5。由于采集方案的變化導(dǎo)致的兩基因檢測中的散點見圖12B。肝素和Paxgene骨髓采集方案為這些患者定義了兩種極端的邊界，患者3和6有最分散的散點。表20中的數(shù)據(jù)檢查顯示，全血采集方案很好地與彼此關(guān)聯(lián)，而對于骨髓采集方案卻不能說具有相同情形。事實上，基于表20和圖12A和12B，可以認(rèn)為兩基因檢測優(yōu)選使用全血進(jìn)行。為確保一致性，PAXgenePB方案是優(yōu)選的。不受理論的約束，據(jù)信RNA降解在骨髓樣品比全血中可能會更迅速地發(fā)生，因此EDTA(肝素)管和PAXgene系統(tǒng)之間顯示了低水平的相關(guān)性。此外，肝素管收集骨髓樣品看起來比其他方法更不可靠，值得注意的細(xì)節(jié)是整體提高樣品的采集方法用于檢測而不是提高本發(fā)明批露的兩基因檢測。圖11中的六(6)種收集/處理方案與Pearson相關(guān)系數(shù)(R2)和骨髓(BM)和血液樣品p值(PB)均列于表21。對于從肝素，EDTA和PAXgene管的血液樣品(以紅色突出顯示的值)中獲得的RNA樣品，其兩基因比率之間可觀察到良好的相關(guān)性。然而，PAXGene骨髓樣品和其他收集方法之間的相關(guān)性可觀察到較差。這個觀察與當(dāng)骨髓樣品在處理前24小時內(nèi)在環(huán)境條件下被存儲(轉(zhuǎn)移)時肝素管缺乏穩(wěn)定導(dǎo)致RNA模板不穩(wěn)定是一致的。根據(jù)這些樣品中觀察到的RNA的完整性和2基因比值的可靠性，這些觀測也支持PAXGene全血系統(tǒng)作為優(yōu)選的收集/處理方案。實例6基于前面實施例3部分描述的患者，該實施例示出了替吡法尼劑量調(diào)整以平衡毒性與用兩基因檢測協(xié)助的直接FTI聯(lián)合治療患者的治療有效性。以后的分析在確定更好的替吡法尼和依托泊苷劑量策略的背景下進(jìn)行分析，還通過視CR為應(yīng)答，其余為無應(yīng)答者改進(jìn)了關(guān)于RUO和GMPRT-PCR形式的分析。這種后續(xù)分析的結(jié)果已列于前面所描述的實施例。討論在癌癥病人的臨床管理中，對患者群分類以預(yù)測治療應(yīng)答變得越來越有價值。例如，為了提供優(yōu)質(zhì)治療需要伴隨診斷以對那些作為針對性治療例如用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的曲妥珠單抗(Herceptin，Genentech)和用于大腸癌的西妥昔單抗(Erbitux，Merck)治療候選者的患者分類。預(yù)測生物標(biāo)志物也用于治療胃腸道間質(zhì)瘤的伊馬替尼(格列衛(wèi)，諾華藥廠)，治療肺癌的厄洛替尼(Tarceva，OSIPharmaceuticals)和吉非替尼(Iressa，Astra-Zeneca)。目前還沒有可利用的方法以預(yù)測包含F(xiàn)TI的組合療法的應(yīng)答。RASGRP1在僅用一種FTI處理的交叉驗證組中以總體預(yù)測精度77％被認(rèn)定為最強的單預(yù)測基因表達(dá)標(biāo)記。RASGRP1是一種特異性激活RAS的鳥嘌呤核苷酸交換因子。RASGRP1的表達(dá)已在腦細(xì)胞，T-細(xì)胞，單核細(xì)胞譜系的細(xì)胞和原始的造血前體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了作為應(yīng)答FTI組合治療的強力預(yù)測因子的RASGRP1和APTX表達(dá)比值。在新診斷組的AML中上述兩基因分類表現(xiàn)了預(yù)測實用性。本發(fā)明所公開的簡單qPCR為基礎(chǔ)的診斷方法比基因表達(dá)法在臨床上具有更廣泛的實用，這是由于它能夠檢測低質(zhì)量的臨床樣品，而這些臨床樣品通過目前的微陣列技術(shù)可能無法成型。另外，該測定可以檢測到全血樣品中的信號，而不再需要骨髓細(xì)胞樣品?；跇悠?、外部參照和僅RASGRP1以及APTX的簡單比率計算從而選擇某種外部參照的方法使得兩基因檢測法對患者尤其是老年患者在確定FTI組合療法是否能幫助他們對抗AML時帶來可能。本發(fā)明公開的在當(dāng)前替吡法尼+依托泊苷試驗背景下收集的骨髓提取物回溯性分析驗證了2基因簽名對替吡法尼應(yīng)答可作為重復(fù)性的預(yù)測。分析還表明了對那些很可能應(yīng)答替吡法尼與那些不應(yīng)答替吡法尼的AML患者進(jìn)行事先判斷是可能的。數(shù)據(jù)證實了這樣一種觀念，即2基因簽名對替吡法尼(或法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)是相對特異性的，因為在RASGRP1：APTXmRNA比率和兩個密集研究化療方案(其中每個包括ara-C和一種蒽環(huán)類與一種第三藥劑(flavopiridol或etoposide))之間沒有出現(xiàn)預(yù)測性關(guān)聯(lián)。在替吡法尼+依托泊苷II期臨床試驗的背景下雖然陽性預(yù)測值為78％，但測試的陰性預(yù)測值(NPV)略低(87％)于替吡法尼單藥治療研究報道的NPV(其在約95％的范圍內(nèi))。這種單一和聯(lián)合療法之間NPV明顯的差異，在某種程度上與對依托泊苷應(yīng)答相關(guān)。概括地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明在不偏離其教導(dǎo)或精神的情況下可以多種變化和替代來實現(xiàn)。例如，使用兩基因比的一個代數(shù)或數(shù)學(xué)的變量可用于實施該發(fā)明。下面所附權(quán)利要求的范圍包含多種此類修改。另外，每個參考文獻(xiàn)和引用在此通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。序列RASGRP1擴(kuò)增子SEQNo.1ctggacgatctcattgacagctgcattcaatcttttgatgcagatggaaacctgtgtcgaagtaaccaactgttgcaagAPTX擴(kuò)增子SEQNo.2cgcttccgattgggctaccacgccattccgagtatgagccatgtacatcttcattgtgatcagccaggattttgattctAPTXUPPER引物SEQNo.3cgcttccgattgggctacAPTXLOWER引物SEQNo.4agaatcaaaatcctggctgatcRASGRP1UPPER引物SEQNo.5ctggacgatctcattgacagctgcattcaatcttttgatgcagatggaaacctgtgtcgaagtaaccaactgttgcaagRASGRP1LOWER引物SEQNo.6cttgcaacagttggttacttcg，HMBS擴(kuò)增子SEQNo.7ccttgcccactgtgcttcctccctggcttcaccatcggagccatctgcaagcgggaaaaccctcatgatHMBSUPPER引物SEQNo.8cctgcccactgtgcttcctHMBSLOWER引物SEQNo.9atcatgagggttttcccgctRASGRP1TAQMAN探針SEQNo.10FAM-cattcaatcttttgatgcagatggaaacctg-BHQ1APTXTAQMAN探針SEQNo.11Gold540-cacgccattccgagtatgagccatgtac-BHQ2HMBSTaqMan探針SEQNo.12Cy5-gcttcaccatcggagccatctgca-BHQ1，參考文獻(xiàn)Ahel等人(2006)TheneurodegenerativediseaseproteinaprataxinresolvesabortiveDNAligationintermediatesNature443：713-716Baylin等人inNatureClinicalPractice(2005)2：Sl-S3Bivona等人(2003)PhospholipaseCgammaactivatesRasontheGolgiapparatusbymeansofRasGRP1Nature424：694-698Bos(1989)rasoncogenesinhumancancer：areviewCancerRes49：4682-4689Bullinger等人(2004)Useofgene-expressionprofilingtoidentifyprognosticsubclassesinadultacutemyeloidleukemiaNEnglJMed350：1605-1616Burger等人(2005)Activatingmutationsinc-KITandPDGFRalphaareexclusivelyfoundingastrointestinalstromaltumorsandnotinothertumorsoverexpressingtheseimatinibmesylatetargetgenesCancerBiolTher4：1270-1274Chang等人(2003)GeneexpressionprofilingforthepredictionoftherapeuticresponsetodocetaxelinpatientswithbreastcancerLancet362：362-369Chen等人(2005)FLT3/ITDmutationsignalingincludessuppressionofSHP-1JBiolChem280：5361-5369Cox等人(2002)Farnesyltransferaseinhibitors：promisesandrealitiesCurrOpinPharmacol2：388-393Ebinu等人(1998)RasGRP，aRasguanylnucleotide-releasingproteinwithcalcium-anddiacylglycerol-bindingmotifsScience280：1082-1086Ehmann等人(2006)DetectionofN-RASandK-RASintheiractiveGTP-boundforminacutemyeloidleukemiawithoutactivatingRASmutationsLeukLymphoma47：1387-1391End等人(2001)CharacterizationoftheantitumoreffectsoftheselectivefarnesylproteintransferaseinhibitorR115777invivoandinvitroCancerRes61：131-137Feldkamp等人(2001)Isotype-specificRasGTP-levelspredicttheefficacyoffarnesyltransferaseinhibitorsagainsthumanastrocytomasregardlessofRasmutationalstatusCancerRes61：4425-4431Geman等人(2004)ClassifyinggeneexpressionprofilesfrompairwisemRNAcomparisonsStatApplGenetMolBiol3：30Holleman等人(2004)Gene-expressionpatternsindrug-resistantacutelymphoblasticleukemiacellsandresponsetotreatmentNEnglJMed351：533-542Illmer等人(2005)ActivationoftheRASpathwayispredictiveforachemosensitivephenotypeofacutemyelogenousleukemiablastsClinCancerRes11：3217-322Jansen等人(2005)Molecularclassificationoftamoxifen-resistantbreastcarcinomasbygeneexpressionprofilingJClinOncol23：732-740Karp等人(2001)ClinicalandbiologicactivityofthefarnesyltransferaseinhibitorR115777inadultswithrefractoryandrelapsedacuteleukemias：aphase1clinical-laboratorycorrelativetrialBlood97：3361-3369Karp，KarenFlatten，EricJ.Feldman，JacquelineM.Greer等人Activeoralregimenforelderlyadultswithnewlydiagnosedacutemyelogenousleukemia：apreclinicalandphase1trialofthefarnesyltransferaseinhibitortipifarnib(R115777，Zarnestra)combinedwithetoposide.Blood2009，113：4841-4852.Kawasaki等人(1998)ARapguaninenucleotideexchangefactorenrichedhighlyinthebasalgangliaProcNatlAcadSci95：13278-13283Lancet等人(2006)AphaseIIstudyofthefarnesyltransferaseinhibitortipifarnibinpoor-riskandelderlypatientswithpreviouslyuntreatedacutemyelogenousleukemiaBlood2：2Leith等人AcuteMyeloidLeukemiaintheElderly：AssessmentofMultidrugResistance(MDR1)andCytogeneticsDistinguishesBiologicSubgroupsWithRemarkablyDistinctResponsestoStandardChemotherapy.ASouthwestOncologyGroupStudy.Blood，Vol.89，1997：pp.3323-3329.Lossos等人(2004)Predictionofsurvivalindiffuselarge-B-celllymphomabasedontheexpressionofsixgenesNEnglJMed350：1828-1837Lubet等人(2006)EffectsofthefarnesyltransferaseinhibitorR115777(Zarnestra)onmammarycarcinogenesis：prevention，therapy，androleofHaRasmutationsMolCancerTher5：1073-1078Lynch等人(2004)Activatingmutationsintheepidermalgrowthfactorreceptorunderlyingresponsivenessofnon-small-celllungcancertogefitinibNEnglJMed350：2129-2139Ma等人(2004)Atwo-geneexpressionratiopredictsclinicaloutcomeinbreastcancerpatientstreatedwithtamoxifenCancerCell5：607-616Mesa等人(2006)Tipifarnib：farnesyltransferaseinhibitionatacrossroadsExpertRevAnticancerTher6：313-319Moroni等人(2005)Genecopynumberforepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)andclinicalresponsetoantiEGFRtreatmentincolorectalcancer：acohortstudyLancetOncol6：279-286PerezdeCastro等人(2004)ARasactivationinJurkatTcellsfollowinglow-gradestimulationoftheT-cellreceptorisspecifictoN-RasandoccursonlyontheGolgiapparatusMolCellBiol24：3485-3496Potti等人(2006)GenomicsignaturestoguidetheuseofchemotherapeuticsNatMed12：1294-1300RaponiM，WangY，andHongtaoF.WO2008112749A1.Methodsofdeterminingacutemyeloidleukemiaresponsetotreatmentwithfarnesyltransferase.RaponiM，HarousseauJL，LancetJE，等人Identificationofmolecularpredictorsofresponseinastudyoftipifannibtreatmentinrelapsedandrefractoryachtemyelogenousleukemia.ClinCancerRes.2007；13：2254-2260.Raponi，JeffreyE.Lancet，HongtaoFan，LesleyDossey，GraceLee，IvanaGojo，EricJ.Feldman，JasonGotlib，LawrenceE.Morris，PeterL.Greenberg，JohnJ.Wright，Jean-LucHarousseau，BobLowenberg，RichardM.Stone，PeterDePorre，YixinWang，andJudithE.Karp.A2-geneclassifierforpredictingresponsetothefamesyltransferaseinhibitortipifarnibinacutemyeloidleukemia.Blood2008，111：2589-2596.Rao等人(2004)PhaseIIIDouble-BlindPlacebo-ControlledStudyofFarnesylTransferaseInhibitorR115777inPatientsWithRefractoryAdvancedColorectalCancerJClinOncol22：3950-3957Reuter等人(2000)TargetingtheRassignalingpathway：arational，mechanism-basedtreatmentforhematologicmalignancies？Blood96：1655-1669Reuther等人(2001)Leukemia-associatedRhoguaninenucleotideexchangefactor，aDblfamilyproteinfoundmutatedinleukemia，causestransformationbyactivationofRhoAJBiolChem276：27145-27151Reuther等人(2002)RasGRP4isanovelRasactivatorisolatedfromacutemyeloidleukemiaJBiolChem277：30508-30514Rosenwald等人(2002)Theuseofmolecularprofilingtopredictsurvivalafterchemotherapyfordiffuselarge-B-celllymphomaNEnglJMed346：1937-1947Rowinsky等人(1999)Rasproteinfarnesyltransferase：AstrategictargetforanticancertherapeuticdevelopmentJClinOncol17：3631-3652Sahai等人(2002)RHO-GTPasesandcancerNatRevCancer2：133-142Seidman等人(2001)WeeklytrastuzumabandpaclitaxeltherapyformetastaticbreastcancerwithanalysisofefficaeybyHER2immunophenotypeandgeneamplificationJClinOncol19：2587-2595Ship等人(2002)DifffuselargeB-celllymphomaoutcomepredictionbygene-expressionprofilingandsupervisedmachinelearningNatMed8：68-74Solit等人(2006)BRAFmutationpredictssensitivitytoMEKinhibitionNature439：358-362Sterpetti等人(1999)ActivationoftheLbcRhoexchangefactorproto-oncogenebytruncationofanextendedCterminusthatregulatestransformationandtargetingMolCellBiol19：1334-1345Stone(2006)RegulationofRasinlymphocytes：getaGRPBiochemSocTrans34：858-861Tognon等人(1998)RegulationofRasGRPviaaphorbolester-responsiveC1domainMolCellBiol18：6995-7008Tsao等人(2005)Erlotinibinlungcancer-molecularandclinicalpredictorsofoutcomeNEnglJMed353：133-144VanCutsem等人(2004)PhaseIIItrialofgemcitabineplustipifarnibcomparedwithgemcitabineplusplaceboinadvancedpancreaticcancerJClinOncol22：1430-1438Waters等人(2006)DevelopinggeneexpressionsignatutesofpathwayderegulationintumorsMolCancerTher5：2444-2449Weinstein等人(2006)Mechanismsofdisease：Oncogeneaddiction--arationaleformoleculartargetingincancertherapyNatClinPractOncol3：448-457White等人(1997)K-andN-RasaregeranylgeranylatedincellstreatedwithfarnesylproteintransferaseinhibitorsJBiolChem272：14459-14464Yeoh等人(2002)Classification，subtypediscovery，andpredictionofoutcomeinpediatricachtelymphoblasticleukemiabygeneexpressionprofilingCancerCell1：133-143當(dāng)前第1頁1 2 3