本發(fā)明涉及一種用于檢測支原體的引物組、試劑盒及檢測支原體污染的方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

支原體(Mycoplasma)污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的污染之一，特別是在哺乳動物細胞的培養(yǎng)過程中，支原體污染問題尤其令人頭疼，主要原因有以下三點：1)支原體體積非常小，直徑為0.1μm，一般過濾除菌無法去除，光學顯微鏡下難以看清它的形態(tài)結構；2)支原體生命力頑強，能在偏堿條件(pH 7.6～8.0)下生存，且對青霉素有抗藥性；3)細胞受支原體污染初期，部分敏感細胞可見細胞生長增增殖變慢、形態(tài)變圓。但多數細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產生交叉污染。支原體最終會導致細胞死亡，不過更常見的情況是，支原體與細胞共存。在這過程當中，支原體慢慢增殖，直至對細胞產生明顯的影響，如干擾細胞遷移、信號轉導、淋巴細胞活化和細胞因子表達。對于相關科研工作者來說，最可怕的是支原體污染在不知不覺中改變許多參數，使研究成果的可信度大打折扣。

常用的支原體檢測手段包括傳統的培養(yǎng)法、ELISA法、PCR法等，目前PCR法是主流的支原體檢測方法，然而目前已有的PCR支原體檢測手段仍存在諸多問題，例如，廣譜性不夠、靈敏度不夠或特異性不夠等。

技術實現要素：

鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明一方面提供了一種用于檢測支原體的引物組，其包括：正向引物，其序列如SEQ ID No.1所示；以及反向引物，其序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明另一方面提供了一種用于檢測支原體的試劑盒，其包括上述的用于檢測支原體的引物組。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括：支原體裂解緩沖液，聚合酶鏈式反應試劑；以及陽性對照。

更優(yōu)選的，所述陽性對照包含支原體16S rDNA保守序列的陽性質粒。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照。

本發(fā)明再一方面提供了上述試劑盒用于檢測支原體污染的用途。

優(yōu)選的，所述試劑盒用于檢測以下支原體中的任意一種或幾種：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma。

本發(fā)明還一方面提供了一種采用上述的試劑盒檢測支原體污染的方法，該方法包括以下步驟：步驟1)支原體裂解：采用所述試劑盒中的支原體裂解緩沖液；處理待檢測樣品獲得裂解液；步驟2)PCR擴增：將步驟1)所獲得的裂解液與所述聚合酶鏈式反應試劑和所述引物組混合，進行PCR擴增反應；步驟3)電泳：將步驟2)所得的PCR擴增產物上電泳，根據電泳條帶結果判斷是否存在支原體污染。

優(yōu)選的，所述步驟2)的PCR擴增的條件如下：首先進行步驟a：94℃，10分鐘；隨后，步驟b：94℃，30秒；步驟c：60℃，30秒；步驟d：72℃，30秒；上述步驟b至步驟d共30個循環(huán)；最后進行步驟e：72℃，10分鐘。

優(yōu)選的，所述步驟1)包括：對待檢測的樣品進行去除細胞碎片的處理，之后離心以沉淀支原體，該支原體沉淀物重新混懸于所述支原體裂解緩沖液中，并在90～95℃下加熱3～5分鐘。

本發(fā)明的檢測支原體的引物組，其試劑盒以及采用該試劑盒檢測支原體污染的方法，具有以下優(yōu)點：1)操作簡便；2)判讀容易：支原體檢測的PCR反應產物單一，檢測信息容易判斷；3)廣譜性好且特異性強：本發(fā)明特定的引物組專一地擴增支原體16S rDNA保守序列，不僅特異性強，并且能夠能夠適用于檢測多種類型的支原體，廣譜性好；4)靈敏度高；因此，本發(fā)明的試劑盒能夠快速檢測支原體污染情況，應用前景很廣泛。

附圖說明

圖1為采用本發(fā)明實施例1的引物組擴增15種物種的體細胞DNA和支原體DNA陽性樣品后的擴增產物的電泳結果；

圖2為采用本發(fā)明實施例1的引物組擴增14種支原體DNA樣品后的擴增產物的電泳結果；

圖3為本發(fā)明實施例2的試劑盒的靈敏度試驗的結果；

圖4為本發(fā)明實施例3中三個檢測樣品的電泳結果。

具體實施方式

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種用于檢測支原體的引物組，其包括正向引物和反向引物；正向引物的序列為5'-CGA GTC GGC ATC TAA TAC TAT-3'(參見序列表中的SEQ ID No.1)；反向引物的序列為5'-AAA ACG ACA TTT CTG CCG C-3'(參見序列表中的SEQ ID No.2)。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種用于檢測支原體的試劑盒，其采用上述的引物組。

本發(fā)明的試劑盒是采用高靈敏度的PCR技術進行支原體檢測。支原體的rDNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)，例如16S rDNA；雖然各種物種之間的堿基序列差別很大，但存在保守序列。發(fā)明人經過大量的研究試驗，篩選出了可以特異性PCR擴增支原體的16S rDNA保守序列的引物組，不僅廣譜性較好，且靈敏度較高。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，試劑盒還包括：支原體裂解緩沖液；聚合酶鏈式反應試劑；以及陽性對照。

其中，關于支原體裂解緩沖液，可以采用常規(guī)的支原體裂解緩沖液，諸如0.1mmol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.5％Triton X-100或Tween 20等；可以通過市場途徑直接購買獲得或自行配置后，裝配入試劑盒。

其中，關于聚合酶鏈式反應試劑，是PCR擴增反應所需的常規(guī)試劑，例如Taq酶、PCR反應緩沖液、MgCl₂和dNTPs等的組合；可以通過市場途徑直接購買獲得或自行配置后，裝配入試劑盒。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，PCR擴增反應的反應體系為：10倍的緩沖液5μl、dNTPs各200μmol/L、Taq酶2.5μl、待測樣品5μl；總體積50μl(其余用滅菌雙蒸水補平)。

其中，關于陽性對照，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，陽性對照可以包含支原體16S rDNA保守序列，更優(yōu)選的，陽性對照可以為含有支原體16S rDNA保守序列的陽性質粒。當然，在本發(fā)明的一個替代實施方案中，可以采用現有的支原體檢測試劑盒中的陽性對照，可市購、也可以根據現有技術自行構建。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，試劑盒還可以包括陰性對照。陰性對照可以為不含有支原體DNA序列的溶液，例如無菌水、PCR緩沖液、生理鹽水等。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，上述試劑盒可以用于檢測支原體污染。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，上述試劑盒可以用于檢測以下支原體中的任意一種或幾種：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種采用上述的試劑盒檢測支原體污染的方法，該方法包括以下步驟：步驟1)支原體裂解：采用所述試劑盒中的支原體裂解緩沖液；處理待檢測樣品獲得裂解液；步驟2)PCR擴增：將步驟1)所獲得的裂解液與所述聚合酶鏈式反應試劑和所述引物組混合，進行PCR擴增反應；步驟3)電泳：將步驟2)所得的PCR擴增產物上電泳，根據電泳條帶結果判斷是否存在支原體污染。

其中，步驟1)支原體裂解，可以采用常規(guī)的獲取支原體DNA的方法；例如，將待檢測樣品煮沸后離心，支原體DNA會溶于離心后的上清中；也可以采用常規(guī)的裂解試劑對支原體進行裂解處理，以獲取支原體DNA。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，步驟1)包括：對待檢測的樣品進行去除細胞碎片的處理，之后離心以沉淀支原體，該支原體沉淀物重新混懸于支原體裂解緩沖液中，并在90～95℃下加熱3～5分鐘。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，采用低速(例如500～800轉/分)、短暫離心2～3分鐘，以沉淀細胞碎片；然后取上清液移入新的離心管中，以15000～20000轉/分的轉速離心10～15分鐘，以沉淀支原體；之后，棄上清液，再向離心管中加入支原體裂解緩沖液，并使支原體沉淀物混懸于支原體裂解緩沖液中，最后在90～95℃下加熱3～5分鐘，以獲取支原體DNA。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟2)的PCR擴增的條件如下：首先進行步驟a，在94℃下變性10分鐘；隨后，步驟b：在94℃下變性30秒；步驟c：在60℃下退火30秒；步驟d：在72℃下延伸30秒；上述步驟b至步驟d共進行30個循環(huán)；最后進行步驟e：在72℃下延伸10分鐘。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟3)中，步驟2)所得的PCR擴增產物上瓊脂糖凝膠電泳，根據跑膠結果判斷是否存在支原體污染情況。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些具體實施方式。

實施例1：引物組的設計和合成

首先，選定待檢測的支原體物種：依據目前細胞培養(yǎng)過程中最常見的支原體污染案例，選定15種常見的支原體物種作為待檢測的目標支原體物種：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma；

然后，比對基因庫：從美國基因數據庫Genbank檢索，比對上述15種目標支原體物種的16S rDNA序列，通過xxxx軟件進行同源序列分析比對，找到保守專一的序列作為目標片段；

隨后，以上述的目標片段設計PCR擴增反應所需的引物。

最后，針對設計出來的引物進行特異性和靈敏度測試；如果特異性不足或者靈敏度不足，則重新設計引物。

經過發(fā)明人的大量試驗，最終獲得的優(yōu)化引物組如下：

正向引物的序列為5'-CGA GTC GGC ATC TAA TAC TAT-3'(參見序列表中的SEQ ID No.1)；

反向引物的序列為5'-AAA ACG ACA TTT CTG CCG C-3'(參見序列表中的SEQ ID No.2)；

在本實施例中，采用常規(guī)方法合成上述引物組。

實施例2：試劑盒的制備

1)參照上述實施例1合成引物組；

2)支原體裂解緩沖液：購自SIGMA-ALDRICH公司生產的支原體裂解試劑(產品號為07066)；

3)聚合酶鏈式反應試劑：購自TaKaRa生物科技公司生產的“低背景、高靈敏PCR系列”產品，主要包括：Taq酶、PCR反應緩沖液、MgCl₂和dNTPs；

4)陽性對照：為含有支原體16S rDNA保守序列(270bp)的質粒；

5)陰性對照：無菌水。

將上述引物組的正向序列和反向序列分別置于密閉容器中；陽性對照和陰性對照分別置于密閉容器中；再與購得的聚合酶鏈式反應試劑產品一同裝配入試劑盒。

實施例2的用于檢測支原體的試劑盒的特異性評價

本發(fā)明的目的是為了開發(fā)一種能夠檢測細胞培養(yǎng)過程中的常見支原體污染的試劑盒，必須對支原體樣品具有專一性(或者說特異性)。

在特異性評價試驗中，以15種物種(兔、馬、雞、狗、綠猴、豬、老鼠、大鼠、貓、人、恒河猴、牛、倉鼠、果蠅、魚)的體細胞DNA作為特異性檢測對象；以支原體DNA質粒(已知的陽性樣品)作為陽性對照；采用實施例1的引物組對15種物種的體細胞DNA和支原體DNA陽性樣品進行PCR擴增；

參見圖1，上述15種物種的體細胞DNA和支原體DNA樣品的擴增產品的電泳結果；從圖1可以看出，實施例1的引物組僅擴增的支原體DNA的目標片段，15種物種的體細胞DNA的結構均為陰性；該結果表明，本發(fā)明的引物組及其試劑盒的特異性良好。

實施例2的用于檢測支原體的試劑盒的廣譜性評價

本發(fā)明的目的是為了開發(fā)一種能夠檢測細胞培養(yǎng)過程中的常見支原體污染的試劑盒，最好能夠滿足常見支原體物種的廣譜性檢測。

在廣譜性評價試驗中，以14種支原體：M.fermentans、M.hyorhinis、M.arginini、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.pulmonis、M.arthritidis、M.bovis、M.pneumoniae、M.pirum、M.capricolum、Acholeplasma或Spiroplasma作為廣譜性檢測對象。

如圖2所示，14種支原體DNA樣品的檢測結果均為陽性，該結果表明，本發(fā)明的引物組及其試劑盒的廣譜性良好。

實施例2的用于檢測支原體的試劑盒的靈敏度評價

在靈敏度評價試驗中，以支原體陽性質粒作為檢測對象，進行倍比稀釋以驗證靈敏度。靈敏度測試最高檢測量設置為125個質?？截?，稀釋后依次為：62.5、31.25、15.3、7.81和3.91個拷貝。進行PCR反應、跑膠，驗證支原體最低檢測量。

檢測結果如圖3所示，本發(fā)明的引物組及其試劑盒能夠在31.25copies(即相當于31.25顆支原體的DNA量)獲得檢測結果，并且在62.5顆支原體(小于100顆支原體)具有較高的靈敏度。

從圖3的結果可以看出，本發(fā)明的引物組及其試劑盒能夠檢測出小于100顆支原體的樣品，具有較高的靈敏度。

實施例3：檢測支原體污染

步驟1)支原體裂解：采用實施例2試劑盒中的支原體裂解緩沖液處理待檢測樣品(樣品1、2和3)獲得裂解液；

首先，取0.5-1毫升的待檢測樣品(細胞培養(yǎng)上清液)加入2毫升的離心管中；以500rpm的轉速短暫離心60秒以沉淀細胞碎片；取離心后的上清液移入新的已滅菌的2毫升離心管中；以20000rpm的轉速離心10分鐘以沉淀支原體，再輕輕吸棄上清液；再向離心管中加入50微升的支原體裂解緩沖液，用移液槍輕輕抽打以混勻沉淀物，以95攝氏度加熱3分鐘，即獲得含有支原體DNA的裂解液；

步驟2)PCR擴增：將步驟1)所獲得的裂解液與所述聚合酶鏈式反應試劑和所述引物組混合，進行PCR擴增反應；

PCR擴增反應體系：10倍的緩沖液5μl、dNTPs各200μmol/L、Taq酶2.5μl、待測樣品5μl；總體積50μl(其余用滅菌雙蒸水補平)；

PCR擴增采用BIO-RAD T100^TM PCR儀。

PCR擴增的條件如下：

首先進行步驟a，在94℃下變性10分鐘；

隨后，步驟b：在94℃下變性30秒；步驟c：在60℃下退火30秒；步驟d：在72℃下延伸30秒；上述步驟b至步驟d共進行30個循環(huán)；

最后進行步驟e：在72℃下延伸10分鐘。

步驟3)電泳：將步驟2)所得的PCR擴增產物上電泳，根據電泳條帶結果判斷是否存在支原體污染。

電泳條件如下：選用Amresco的瓊脂糖凝膠、Bersing的TAE緩沖液；瓊脂糖凝膠的濃度為2％：100毫升TAE緩沖液中加入2g瓊脂糖凝膠；跑膠電壓100V，時間為30分鐘；使用標記物為100bpDNA標記物(SMOBio-DM2100)；無需添加上樣緩沖液。

關于支原體污染的判斷，基于陽性對照和陰性對照的結果。

參上述實施例2的試劑盒中采用的陽性對照(含有支原體16S rDNA保守序列(270bp)的陽性質粒)和陰性對照(無菌水)。

在電泳步驟中，以1μl的陽性對照和1μl的陰性對照作為替代。

參見圖4，三個待檢測樣品中，僅樣品1檢測出了支原體污染；樣品2和樣品3未檢測出支原體污染。

應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施方式中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。