技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及擴(kuò)增核酸的簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法及其裝置。

背景技術(shù)：

特異性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的方法已經(jīng)成為了分子生物學(xué)研究領(lǐng)域、基因檢查等臨床應(yīng)用領(lǐng)域中非常重要的技術(shù)。作為特異性檢測(cè)通過核酸擴(kuò)增方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法之一有如下方法：將包含目標(biāo)序列的核酸片段固定在固相上并進(jìn)行檢測(cè)的方法。在該方法中，目標(biāo)核酸被特異地捕獲在固相上，通過清洗等可以容易地去除非特異性核酸序列，從而可以提高檢測(cè)特異性。

目前，使目標(biāo)核酸捕獲于固相的方法可列舉利用能夠形成特異性結(jié)合的抗原-抗體的組合、或配體-受體的組合的方法。例如，非專利文獻(xiàn)1公開了使用引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法，所述引物中的一條引物末端用生物素修飾，另一條引物用熒光物質(zhì)修飾。在該方法中，使PCR產(chǎn)物與由鏈霉親和素-瓊脂糖形成的固相接觸，通過形成鏈霉親和素-生物素復(fù)合物與固相結(jié)合，并可以通過測(cè)量其熒光而檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。

但是，由于受到能夠作為標(biāo)記使用的抗原/抗體或配體/受體的組合的限制，實(shí)際上難以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)核酸。此外，熒光標(biāo)記核酸較為昂貴也存在成本方面的問題。

在固相上捕獲目標(biāo)核酸的其他方法還有將由具有與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列的寡核苷酸形成的探針固定在固相上，通過目標(biāo)核酸與探針的雜交，將目標(biāo)核酸間接固定在固相上的方法。在該方法中，檢測(cè)由雜交體的形成所帶來的信號(hào)強(qiáng)度。這類核酸解析方法可以通過改變探針序列而一次性分析多個(gè)目標(biāo)序列。

但是，對(duì)于在固相上使固定化了的探針與目標(biāo)核酸雜交，一般地，通過熱處理使PCR方法擴(kuò)增了的雙鏈核酸變性成為單鏈的步驟是必需的，加熱處理不僅復(fù)雜，而且存在由于再退火導(dǎo)致雜交效率低下的問題。此外，單鏈DNA易于球形化，還具有檢測(cè)靈敏度差的問題。專利文獻(xiàn)1中公開了不進(jìn)行加熱處理、通過核酸酶處理來擴(kuò)增單鏈核酸的方法，但是，其操作仍然復(fù)雜，仍然存在單鏈的球形化的問題。

在核酸的檢測(cè)方法中，作為操作性優(yōu)異、迅速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)目標(biāo)核酸的方法，有基于專利文獻(xiàn)2記載的色譜的方法。該方法是如下基因檢測(cè)方法，所述方法是在單個(gè)基因檢測(cè)裝置上，通過毛細(xì)管作用，使包含任意被提取的基因或其片段的液體樣品移動(dòng)，從而連續(xù)進(jìn)行從細(xì)胞、病毒或細(xì)菌中提取基因的步驟、將任意被提取的基因片段化的步驟和檢測(cè)步驟?？梢耘袛嗍欠翊嬖谀康幕?，進(jìn)一步鑒別它的種類。

但是，專利文獻(xiàn)2也是通過NASBA法擴(kuò)增單鏈核酸。在使用單鏈核酸上的問題如前所述。

為了解決上述問題，在專利文獻(xiàn)3和專利文獻(xiàn)4中，通過使引物區(qū)域的5’端具有抑制DNA聚合酶催化的核酸合成的非天然核酸標(biāo)簽、發(fā)夾結(jié)構(gòu)或假結(jié)(シュードノット)結(jié)構(gòu)，從而即使在PCR反應(yīng)后也在雙鏈核酸的一端保留了單鏈區(qū)域。由于僅使用特殊的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，就能夠制備下述擴(kuò)增產(chǎn)物，因此是有利的。所述擴(kuò)增產(chǎn)物具在雙鏈DNA的一個(gè)末端具有能夠雜交的單鏈區(qū)域。但是，由于必須通過熒光標(biāo)記、表面等離子體共振差異成像進(jìn)行檢測(cè)，因此高價(jià)的專用裝置是必需的，在快捷性、簡(jiǎn)便性等方面存在問題。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1日本特開平5-252998號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2日本特開2006-201062號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)3國際公開第2006/095550號(hào)小冊(cè)子

專利文獻(xiàn)4日本特開2009-296948號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1Analytical biochemistry,193,231-235,(1991)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

由于在臨床現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行基因診斷或檢查需要大型且高價(jià)的檢查裝置，需要檢查時(shí)間，患者的檢查費(fèi)用、多次去醫(yī)院就醫(yī)的時(shí)間或負(fù)擔(dān)較重。因此，出于確保檢查的準(zhǔn)確性，同時(shí)減輕患者和檢查者負(fù)擔(dān)的原因，需要簡(jiǎn)便、快速且特異性高的方法、以及低成本且不需要特殊裝置的方法。本發(fā)明是針對(duì)上述問題進(jìn)行的發(fā)明，其目的在于提供如下核酸檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)裝置或試劑盒，該方法為有效利用雜交法的高特異性，同時(shí)減少PCR產(chǎn)物的檢測(cè)步驟所需的時(shí)間和步驟，在不需要特殊裝置的條件下，簡(jiǎn)便且高精度地目測(cè)檢測(cè)的核酸檢測(cè)方法。進(jìn)一步的，迄今為止需要針對(duì)每個(gè)目標(biāo)核酸制備高價(jià)的標(biāo)記標(biāo)簽，在勞動(dòng)力和成本方法還有改良的余地。

解決問題的方法

本發(fā)明人等為了解決上述問題進(jìn)行深入研究，結(jié)果獨(dú)創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)：將目標(biāo)核酸作為在兩個(gè)末端分別具有單鏈區(qū)域的雙鏈核酸進(jìn)行擴(kuò)增，使該擴(kuò)增片段與具有能夠與上述單鏈區(qū)域之一進(jìn)行雜交的寡核苷酸探針的固相相結(jié)合，從而檢測(cè)核酸，就可以在不需要特殊裝置的條件下，簡(jiǎn)便且高精度的檢測(cè)上述DNA擴(kuò)增片段，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)方法，其包括：使雙鏈DNA擴(kuò)增片段的一個(gè)末端的單鏈區(qū)域與固定在固相上的第1寡核苷酸探針雜交的步驟，所述雙鏈DNA擴(kuò)增片段是在兩個(gè)末端具有包含天然核苷酸的單鏈區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增片段。

優(yōu)選還包括使上述DNA擴(kuò)增片段的另一個(gè)末端的單鏈區(qū)域與結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。

標(biāo)志物優(yōu)選包括著色擔(dān)載體，并可以目測(cè)檢測(cè)上述DNA擴(kuò)增片段。

優(yōu)選包括在核酸檢測(cè)裝置上檢測(cè)上述DNA擴(kuò)增片段的步驟。

優(yōu)選用色譜檢測(cè)上述DNA擴(kuò)增片段。

優(yōu)選包括下述步驟(a)-(c)：

(a)在上述核酸檢測(cè)裝置上的不同于固定有上述第1寡核苷酸探針的區(qū)域的區(qū)域中，配置上述DNA擴(kuò)增片段的步驟，

(b)使用溶劑，使上述DNA擴(kuò)增片段在朝向固定有上述第1寡核苷酸探針的區(qū)域的方向上在上述裝置上擴(kuò)散的步驟，以及

(c)在固定有上述第1寡核苷酸探針的區(qū)域中，使上述第1寡核苷酸探針與上述DNA擴(kuò)增片段雜交的步驟。

優(yōu)選還包括在上述步驟(c)之前，使上述DNA擴(kuò)增片段與結(jié)合有上述標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。

優(yōu)選：

(d)在上述核酸檢測(cè)裝置上的不同于固定有上述第1寡核苷酸探針的區(qū)域的各個(gè)區(qū)域中，分別配置上述DNA擴(kuò)增片段、以及結(jié)合有所述標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針，

(e)使用溶劑，使上述DNA擴(kuò)增片段在朝向配置有第2寡核苷酸探針的區(qū)域的方向上擴(kuò)散，所述第2寡核苷酸探針結(jié)合有上述標(biāo)志物，

(f)在配置了結(jié)合有上述標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針的區(qū)域中，使上述DNA擴(kuò)增片段與結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針雜交，

(g)使在步驟(f)中雜交而得到的復(fù)合物在朝向配置有上述第1寡核苷酸探針的方向上在展開介質(zhì)上擴(kuò)散，以及

(h)在固定有上述第1寡核苷酸探針的區(qū)域中，使上述第1寡核苷酸探針與上述復(fù)合物雜交。

上述包含天然核苷酸的單鏈區(qū)域優(yōu)選是與雙鏈DNA區(qū)域相同方向的序列。

上述DNA擴(kuò)增片段優(yōu)選是使用2種下述引物且通過核酸擴(kuò)增方法獲得的產(chǎn)物，所述引物具有在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域。

上述DNA擴(kuò)增片段優(yōu)選是使用第1引物組和第2引物組且通過核酸擴(kuò)增方法獲得的產(chǎn)物，所述第1引物組包括下述引物，該引物具有能夠與目標(biāo)核酸的模板雜交的序列、和不能夠與該模板雜交的共同序列，以及所述第2引物組包括下述引物，該引物具有能夠與上述共同序列的互補(bǔ)序列雜交的序列、和在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域。

優(yōu)選上述在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域包括天然核苷酸，且第2引物組的引物全長(zhǎng)為相同方向的序列。

此外，本發(fā)明涉及在上述核酸檢測(cè)方法中使用的核酸檢測(cè)裝置，其具有：配置上述DNA擴(kuò)增片段的區(qū)域，保持有上述第1寡核苷酸探針的色譜擔(dān)載體，所述第1寡核苷酸探針待與上述DNA擴(kuò)增片段結(jié)合，以及結(jié)合有標(biāo)志物的上述第2寡核苷酸探針。

此外，本發(fā)明涉及雙鏈DNA擴(kuò)增片段，其為使用具有在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域的2種引物且通過核酸擴(kuò)增方法而獲得的、并在兩個(gè)末端具有包含天然核苷酸的單鏈區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增片段。

優(yōu)選引物的在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域包括天然核苷酸，且引物全長(zhǎng)為相同方向的序列。

發(fā)明的效果

通過本發(fā)明，可以利用DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)域、特異地與固相結(jié)合，進(jìn)一步的，可以利用另一個(gè)末端的單鏈區(qū)域與目標(biāo)化合物形成復(fù)合物，能夠在不使用特殊裝置的條件下，簡(jiǎn)便、快速的目測(cè)判斷DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，通過檢測(cè)結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定的雙鏈DNA，使得檢測(cè)靈敏度比檢測(cè)全長(zhǎng)單鏈更高。此外，通過準(zhǔn)備用于結(jié)合固相的擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)域和與其互補(bǔ)的固相上的寡核苷酸探針的多種組合，還可以同時(shí)鑒別存在于樣品中的2種以上的目標(biāo)核酸。此外，使用本發(fā)明的其他實(shí)施方式，可以通過廉價(jià)的聯(lián)合引物(jointprimer)，在所有目標(biāo)核酸上添加相同的單鏈區(qū)域。利用該相同的單鏈區(qū)域，可以使用相同的標(biāo)記標(biāo)簽和裝置進(jìn)行檢測(cè)。在此情況下，不必針對(duì)每個(gè)目標(biāo)核酸來制備高價(jià)的標(biāo)記標(biāo)簽，可以極大的改善時(shí)間和成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的PCR用引物的示意圖。

圖2為本發(fā)明的PCR用第1引物的示意圖。

圖3為本發(fā)明PCR用第2引物的示意圖。

圖4為本發(fā)明的部分雙鏈核酸的合成方法示意圖。

圖5為本發(fā)明的部分雙鏈核酸的合成方法的其他實(shí)施方式的示意圖。

圖6為顯示本發(fā)明的核酸色譜裝置的一個(gè)例子的示意圖。

圖7為本發(fā)明的PCR產(chǎn)物檢測(cè)原理的示意圖。

圖8為顯示本發(fā)明的微陣列(DNA芯片)的一個(gè)例子的示意圖。

圖9為顯示本發(fā)明的珠狀擔(dān)載體的一個(gè)例子的示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)方法，包括使雙鏈DNA擴(kuò)增片段的一個(gè)末端的單鏈區(qū)域與固定在固相上的第1寡核苷酸探針雜交的步驟，所述雙鏈DNA擴(kuò)增片段是在兩個(gè)末端具有包含天然核苷酸的單鏈區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增片段。

雙鏈DNA擴(kuò)增片段是針對(duì)作為模板的樣品DNA，使用特定的引物組進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)而獲得的。

樣品DNA沒有特殊的限制，只要可以作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板使用即可。具體而言，可以使用血液、體液、組織、口腔黏膜、毛發(fā)、爪、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物、植物、微生物等所有源自生物樣品的DNA。此外，上述樣品DNA可以是基因組DNA、cDNA、線粒體DNA和葉綠體DNA等。此外，也可以使用以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA。這些DNA可以根據(jù)擴(kuò)增的DNA片段來恰當(dāng)?shù)倪x擇。此外，樣品DNA不必是純化的DNA，可以是包含樣品DNA的細(xì)胞或組織，在不進(jìn)行純化處理的條件下，直接適用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)。

在兩個(gè)末端具有單鏈區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增片段優(yōu)選是使用2種下述引物且通過核酸擴(kuò)增方法獲得的產(chǎn)物，所述引物具有在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域。在此情況下，雙鏈DNA擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端的單鏈區(qū)域是源自核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用的引物中的、通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域的區(qū)域。

圖1顯示了用于核酸擴(kuò)增的引物。該引物包括引物本體區(qū)域1和位于上述引物本體部分的5’末端的通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域2。此外，引物本體區(qū)域和標(biāo)簽區(qū)域之間可以具有包括聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域3的間隔區(qū)結(jié)構(gòu)。

此外，雙鏈DNA擴(kuò)增片段優(yōu)選是使用第1引物組和第2引物組且通過核酸擴(kuò)增方法獲得的產(chǎn)物，所述第1引物組包括具有能夠與目標(biāo)核酸的模板雜交的序列、和不能夠與該模板雜交的共同序列的引物，并且所述第2引物組包括具有能夠與上述共同序列的互補(bǔ)序列雜交的序列，和在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域的引物。圖2顯示了構(gòu)成PCR用第1引物組的引物。PCR用第1引物(聯(lián)合引物)的特征是包括能夠與目標(biāo)核酸的模板雜交的引物本體區(qū)域4和位于上述引物本體區(qū)域的5’端的共同區(qū)域5，所述共同區(qū)域5包括與第2引物共同的序列。圖3顯示了構(gòu)成PCR用第2引物組的引物。第2引物的特征是包括具有與上述第1引物共同的序列的引物本體區(qū)域6，和位于本體區(qū)域6的5’末端的通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)不被雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)域7。第2引物本體區(qū)域和標(biāo)簽區(qū)域之間，可以具有包括聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域8的間隔區(qū)結(jié)構(gòu)。

引物本體區(qū)域是指具有在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中能夠作為引物發(fā)揮作用的堿基序列的寡核苷酸區(qū)域。具體而言，是能夠與目標(biāo)核酸的目標(biāo)堿基序列的5’末端或3’末端雜交的序列；一般而言，是與目標(biāo)堿基序列的5’末端或3’末端的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這些引物本體區(qū)域只要可以與目標(biāo)核酸特異性結(jié)合即可，可以具有堿基缺失、插入和錯(cuò)配位點(diǎn)。引物本體區(qū)域的長(zhǎng)度優(yōu)選是8個(gè)堿基以上，更優(yōu)選是12個(gè)堿基以上，更優(yōu)選是15個(gè)堿基以上。此外，引物的鏈長(zhǎng)沒有特殊的上限，從它的合成成本等觀點(diǎn)來看，通常50個(gè)堿基以下，或者40個(gè)堿基以下是合適的。

引物的標(biāo)簽區(qū)域只要是包含天然核苷酸即可，沒有特殊的限制。天然核苷酸是指由天然的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶堿基，以及脫氧核糖、核糖糖基，以及磷酸基形成的核苷酸，各部分都是未經(jīng)人工修飾的核苷酸。天然核苷酸可以是D型核苷酸，也可以是L型核苷酸。D型核苷酸表示包含D型脫氧核糖或核糖的核苷酸。此外，L型核苷酸表示包含L型脫氧核糖或核糖的核苷酸。標(biāo)簽區(qū)域由于包含天然核苷酸，因此可以發(fā)揮合成廉價(jià)且容易實(shí)現(xiàn)的效果。此外，引物的標(biāo)簽區(qū)域中的天然核苷酸的比例優(yōu)選在5％以上，更優(yōu)選在20％以上，更優(yōu)選在50％以上，更優(yōu)選在70％以上，最優(yōu)選在90％以上。標(biāo)簽區(qū)域的長(zhǎng)度沒有特殊的限制，只要是具有對(duì)于與互補(bǔ)鏈核酸雜交而言為足夠的長(zhǎng)度即可。通常是5個(gè)堿基-60個(gè)堿基，優(yōu)選是6個(gè)堿基-40個(gè)堿基。

引物的標(biāo)簽區(qū)域的核酸方向優(yōu)選朝向與引物本體區(qū)域相同的方向排列。通過朝向與引物本體區(qū)域相同的方向來排列引物的標(biāo)簽區(qū)域的核酸方向，實(shí)現(xiàn)了廉價(jià)且方便的合成的效果。標(biāo)簽區(qū)域和引物本體區(qū)域即使沒有直接連接，例如，在標(biāo)簽區(qū)域和引物本體區(qū)域之間插入偶氮苯這樣的非天然化合物時(shí)，也優(yōu)選朝向相同的方向排列。在本文中，核酸為相同方向是指相鄰的核苷酸是通過核苷酸糖基的5’位和3’位之間的磷酸二酯鍵而結(jié)合，并不是通過3’位和3’位之間或者是5’位與5’位之間的磷酸二酯鍵而結(jié)合。例如，標(biāo)簽區(qū)域中的核苷酸彼此之間通過磷酸二酯鍵在糖基的5’位和3’位之間結(jié)合時(shí)，本體區(qū)域中的核苷酸彼此之間也在糖基的5’位和3’位之間形成連接。

聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域，其只要是能夠抑制聚合酶催化的核酸延伸反應(yīng)，保持該區(qū)域的單鏈結(jié)構(gòu)即可，沒有特殊的限制。這類結(jié)構(gòu)包括：具有穩(wěn)固的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或假結(jié)結(jié)構(gòu)這一類抑制聚合酶行進(jìn)的立體結(jié)構(gòu)的核酸序列、或L型核酸或人工核酸等非天然核酸、或RNA、和脂肪鏈這類非核酸結(jié)構(gòu)。

“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”或“假結(jié)結(jié)構(gòu)”是指與同一分子中的另一單鏈區(qū)域配對(duì)所形成的穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。L型DNA是包含L型脫氧核糖的DNA，由于不能被一般使用的DNA聚合酶識(shí)別，因此不具有作為DNA延伸反應(yīng)的模板的功能。進(jìn)一步的，L型DNA由于形成左旋的雙螺旋結(jié)構(gòu)，不能與天然存在的D型核酸形成雜交體，而僅可以在L型核酸之間形成雜交體。人工核酸是指人為插入在天然核酸序列中不存在的化合物而得的核酸?？闪信e例如肽核酸(PNA)、交聯(lián)核酸(BNA或LNA)或偶氮苯、熒光素、Cy3、Cy5等，但不限于此。

PNA是指在主鏈中保留了肽結(jié)構(gòu)，并具有與DNA或RNA類似結(jié)構(gòu)的分子，N-(2-氨基乙基)甘氨酸以酰胺鍵相結(jié)合而得到的物質(zhì)作為主鏈。因此，與核酸堿基相對(duì)應(yīng)的嘌呤環(huán)或嘧啶環(huán)通過亞甲基和羰基與主鏈結(jié)合。BNA(LNA)表示通過交聯(lián)修飾DNA或RNA的糖基結(jié)構(gòu)而人工合成的核酸。

在標(biāo)簽區(qū)域僅由天然核苷酸組成，且標(biāo)簽區(qū)域的核酸方向與引物本體區(qū)域的方向相同的情況下，通常與引物區(qū)域之間需要聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域。另一方面，在當(dāng)標(biāo)簽區(qū)域是L型核酸或人工核酸等這類不能作為DNA聚合酶催化的反應(yīng)的模板、且在核酸擴(kuò)增反應(yīng)后也不被雙鏈化的情況下，也可以省略聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域。此外，本發(fā)明的引物可以單獨(dú)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)等穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、L型核酸、人工核酸等非天然核酸、以及脂肪鏈等非核酸結(jié)構(gòu)等，也可以具有多個(gè)的組合。

可以通過寡核苷酸標(biāo)記中常用的各種分子來標(biāo)記引物。這類分子可列舉酶、磁性顆粒、熒光色素、放射性同位素等。這些分子可以單獨(dú)使用，也可以組合多個(gè)來使用。

制備所設(shè)計(jì)的引物的方法沒有特殊的限制，可以通過公知的方法來制備。具體而言，使用DNA合成裝置，利用委托合成服務(wù)，可以容易的獲得設(shè)計(jì)的引物。

核酸擴(kuò)增方法只要是使用上述引物，獲得在兩個(gè)末端具有包含天然核苷酸的單鏈區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增片段的方法即可，沒有特殊的限制?？闪信e例如PCR。此外，也可以使用LAMP法、ICAN法等等溫?cái)U(kuò)增方法。

在使用PCR作為核酸擴(kuò)增方法時(shí)，作為用于PCR反應(yīng)中的反向引物和正向引物的組合，可以使用與兩條引物不同的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域，也可以在一條中使用聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域，在另一條中不導(dǎo)入聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域而是進(jìn)行生物素等修飾。

PCR條件沒有特殊的限制，在以上述樣品DNA作為模板，使用上述引物組進(jìn)行PCR時(shí)，只要是可以擴(kuò)增樣品DNA的預(yù)期區(qū)域的條件即可。具體而言，用于PCR的聚合酶沒有特殊的限制，更優(yōu)選是耐熱性DNA聚合酶，更優(yōu)選是實(shí)質(zhì)上沒有3’→5’外切核酸酶活性的耐熱性DNA聚合酶。此類耐熱性DNA聚合酶可列舉Ex-Taq(TAKARA BIO公司生產(chǎn))等，但不限于此。此外，對(duì)溫度、時(shí)間、緩沖液組成等PCR反應(yīng)條件也沒有特殊的限制，可以根據(jù)所選擇的DNA聚合酶、引物序列、目的序列部分的長(zhǎng)度等，恰當(dāng)?shù)卦O(shè)置。通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)度優(yōu)選是20個(gè)堿基以上，更優(yōu)選是40個(gè)堿基以上。如果少于20個(gè)堿基，則非特異性擴(kuò)增的傾向增加。

使用上述引物組，通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR，可以獲得在目標(biāo)核酸序列的兩末端添加了單鏈區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4顯示了擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)例子，是在使用了包含引物本體區(qū)域和標(biāo)簽區(qū)域的引物時(shí)的擴(kuò)增反應(yīng)的模式圖。正向引物10具有引物本體區(qū)域11和位于其5’末端的標(biāo)簽區(qū)域12，所述引物本體區(qū)域11包括與目標(biāo)核酸序列9的5’末端的一部分相同的序列。反向引物13具有引物本體區(qū)域14和位于其5’末端的標(biāo)簽區(qū)域15，所述引物本體區(qū)域14包括與目標(biāo)核酸序列的3’末端的一部分互補(bǔ)的序列。兩條引物結(jié)合的標(biāo)簽區(qū)域的序列通常分別具有不同的序列。使用上述引物組進(jìn)行PCR時(shí)，由于添加在兩條引物上的標(biāo)簽區(qū)域?qū)嶋H上不參與PCR反應(yīng)，因此，獲得了在兩個(gè)末端具有單鏈區(qū)域的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物16。在兩個(gè)末端具有單鏈區(qū)域的DNA擴(kuò)增片段是指下述DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖4所示的，所述DNA擴(kuò)增產(chǎn)物具有與目標(biāo)DNA區(qū)域相同的雙鏈DNA部分，以及在其兩側(cè)各自的5’末端具有作為標(biāo)簽部分的單鏈區(qū)域。換言之，如果對(duì)上述DNA擴(kuò)增片段更詳細(xì)的說明，其表示在兩個(gè)末端具有包含沒有修飾的核酸的單鏈區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增片段，并且，兩個(gè)末端的單鏈區(qū)域分別具有與其所連接的DNA鏈方向相同的序列。

圖5顯示了擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)例子，是在使用了包含引物本體區(qū)域和共同序列區(qū)域的引物作為聯(lián)合引物組、以及包含共同序列和標(biāo)簽區(qū)域的引物的情況下的擴(kuò)增反應(yīng)的模式圖。使用第1和第2引物組，通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR，可以獲得在目標(biāo)核酸序列的兩末端添加了單鏈區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物。

正向第1引物18具有引物本體區(qū)域19及位于其5’末端的共同序列區(qū)域20，所述引物本體區(qū)域19包括與目標(biāo)核酸序列17的5’末端的一部分相同的序列。反向第1引物21具有引物本體區(qū)域22及位于其5’末端的共同序列區(qū)域23，所述引物本體區(qū)域22包括與目標(biāo)核酸序列的3’末端的一部分互補(bǔ)的序列。在兩條引物中添加的共同區(qū)域的序列通常分別具有不同的序列。使用上述第1引物組進(jìn)行PCR，獲得具有共同區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物24。

此外，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物24的兩端的共同序列區(qū)域的正向第2引物25，具有引物本體區(qū)域26及位于其5’末端的標(biāo)簽區(qū)域27，所述引物本體區(qū)域26包括與具有上述共同區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物24的5’末端的一部分相同的序列。反向第2引物28具有引物本體區(qū)域29及位于其5’末端的標(biāo)簽區(qū)域30，所述引物本體區(qū)域29包括與具有上述共同區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物24的3’末端的一部分共同的互補(bǔ)的序列。兩條引物中結(jié)合的標(biāo)簽區(qū)域的序列通常分別具有不同的序列。使用上述引物組進(jìn)行PCR時(shí)，由于添加在兩條引物上的標(biāo)簽區(qū)域?qū)嶋H上不參與PCR反應(yīng)，因此，獲得了在兩個(gè)末端具有單鏈區(qū)域的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物31。在該實(shí)施方式中，使用第1引物的PCR反應(yīng)和使用第2引物的PCR反應(yīng)，如圖5所示連續(xù)進(jìn)行，其順序可以是同時(shí)添加第1引物和第2引物?；蛘咭部梢允呛筇砑拥?引物。

在兩個(gè)末端具有單鏈區(qū)域的DNA擴(kuò)增片段是指如圖5的31所示，具有與目標(biāo)DNA區(qū)域相同的雙鏈DNA部分，及在其兩側(cè)的5’末端分別具有作為標(biāo)簽部分的單鏈區(qū)域的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

通過使用第1和第2引物組，即使改變目標(biāo)核酸，通過將共同序列設(shè)計(jì)為相同的序列，第2引物可以使用相同的引物，可以制備出相同的單鏈標(biāo)簽序列。如果對(duì)上述DNA擴(kuò)增片段更詳細(xì)的說明，其表示在兩個(gè)末端具有包含沒有修飾的核酸的單鏈區(qū)域的雙鏈DNA擴(kuò)增片段，并且，兩個(gè)末端的單鏈區(qū)域分別具有與其所連接的DNA鏈方向相同的序列。

利用使用上述引物獲得的上述擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)域，形成雜交復(fù)合物。雜交是指包含核酸的分子互補(bǔ)地形成復(fù)合物，除DNA/DNA外，還包括DNA/RNA、DNA/PNA、L-DNA/L-DNA等。在本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法中，由于DNA擴(kuò)增片段具有單鏈區(qū)域，因此，在核酸擴(kuò)增步驟中獲得的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可以不進(jìn)行熱處理等單鏈化處理等，就用于雜交反應(yīng)中。

可以使在兩個(gè)末端具有包含天然核苷酸的單鏈區(qū)域標(biāo)簽的雙鏈DNA擴(kuò)增片段的一個(gè)單鏈區(qū)域，與固定在用于捕獲的擔(dān)載體(固相)上的第1寡核苷酸探針雜交。優(yōu)選還包括使雙鏈DNA擴(kuò)增片段的另一個(gè)單鏈區(qū)域，與直接或間接結(jié)合了標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。雙鏈DNA擴(kuò)增片段、第1寡核苷酸探針和第2寡核苷酸探針這3者的復(fù)合物的形成被稱為夾心雜交。此外，對(duì)三者的雜交順序沒有特殊的限制。

對(duì)第1寡核苷酸探針的長(zhǎng)度沒有特殊的限制，只要能夠與雙鏈DNA擴(kuò)增片段的單鏈區(qū)域雜交即可，優(yōu)選5-60個(gè)堿基長(zhǎng)，更優(yōu)選10-40個(gè)堿基長(zhǎng)。

對(duì)第2寡核苷酸探針的長(zhǎng)度沒有特殊的限制，只要能夠與雙鏈DNA擴(kuò)增片段的單鏈區(qū)域雜交即可，優(yōu)選5-60個(gè)堿基長(zhǎng)，更優(yōu)選10-40個(gè)堿基長(zhǎng)。

與第2寡核苷酸探針結(jié)合的標(biāo)志物沒有特殊的限制，只要能夠?qū)崿F(xiàn)雙鏈DNA擴(kuò)增片段的檢測(cè)即可，優(yōu)選能夠?qū)崿F(xiàn)目測(cè)檢測(cè)雙鏈DNA擴(kuò)增片段的著色擔(dān)載體。這類著色擔(dān)載體可列舉著色顆粒、酶或色素結(jié)合但載體等。其中，優(yōu)選使用著色顆粒。

著色顆?？闪信e包括金、銀、銅、鉑等金屬的膠體粒子、用色素或染料等使膠乳著色而形成的著色膠乳、將色素分子固定在硅石(二氧化硅)顆粒內(nèi)部的硅石納米顆粒等。其中，優(yōu)選使用金膠體顆粒、由藍(lán)色、紅色等著色的水分散型高分子聚合物所形成的著色膠乳顆粒。通過使用這類著色顆粒，可以方便的目測(cè)判斷DNA擴(kuò)增片段。特別是當(dāng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)對(duì)象時(shí)，通過每個(gè)對(duì)象使用不同顏色的著色顆粒，可以方便地同時(shí)目測(cè)判斷多個(gè)對(duì)象。

在使用著色顆粒的情況下，對(duì)顆粒的粒徑?jīng)]有特殊的限制，優(yōu)選是對(duì)夾心雜交復(fù)合物的形成和在固相上捕獲包含目標(biāo)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的不利影響小，且在檢測(cè)時(shí)顯色好的粒徑。著色顆粒的粒徑選自比下述用于色譜的介質(zhì)的孔徑更小的粒徑。具體而言，通常使用500nm以下的，其中優(yōu)選0.1nm-100nm，更優(yōu)選1nm-50nm的。作為著色擔(dān)載體使用的酶是指催化顯色或發(fā)光的底物的反應(yīng)的蛋白質(zhì)?？闪信e例如過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素酶等，只要能夠用肉眼檢測(cè)即可，沒有特殊的限制。

對(duì)雙鏈DNA擴(kuò)增片段末端的單鏈區(qū)域與第1或第2寡核苷酸探針的雜交條件沒有特殊的限制，只要是發(fā)生雜交的條件即可，優(yōu)選是在室溫下，10mM磷酸緩沖液中反應(yīng)。此時(shí)，通過加入氯化鈉等鹽，可以提高雜交效率。

通過檢測(cè)在捕獲擔(dān)載體(固相)上的能夠識(shí)別的位置所形成的夾心雜交復(fù)合物中所包含的標(biāo)志物，可以判斷有無目標(biāo)核酸。檢測(cè)優(yōu)選通過目測(cè)判斷。通過本發(fā)明的檢測(cè)方法，核酸擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物可以在不進(jìn)行熱變性等單鏈化處理的條件下，直接用于雜交反應(yīng)。此外，也不需要特殊的裝置，就可以簡(jiǎn)單、迅速的目測(cè)判斷有無目標(biāo)核酸。

上述通過形成夾心雜交復(fù)合物而檢測(cè)核酸的方法，優(yōu)選在核酸檢測(cè)裝置上實(shí)施。此外，優(yōu)選用色譜檢測(cè)DNA擴(kuò)增核酸。

圖6的核酸色譜裝置是在作為基體材料的構(gòu)件36上，使用粘合劑等貼合樣品墊32(用于添加DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的擔(dān)載體)、聯(lián)結(jié)墊33(配置有結(jié)合了著色擔(dān)載體的寡核苷酸的擔(dān)載體)、保持有捕獲用寡核苷酸的擔(dān)載體34(色譜用介質(zhì))和吸收墊35。在擔(dān)載體34上，設(shè)計(jì)了涂抹了捕獲用寡核苷酸的測(cè)試線37和控制線38。當(dāng)將結(jié)合著色擔(dān)載體的寡核苷酸混合在展開溶液中時(shí)，也可以沒有聯(lián)結(jié)墊33。

色譜優(yōu)選通過包括下述步驟(a)-(c)的方法，檢測(cè)雙鏈DNA擴(kuò)增片段：(a)在核酸檢測(cè)裝置上的不同于固定有第1寡核苷酸探針的區(qū)域的區(qū)域中，配置DNA擴(kuò)增片段的步驟；(b)使用溶劑，使DNA擴(kuò)增片段在朝向固定有第1寡核苷酸探針區(qū)域的方向上在裝置上擴(kuò)散的步驟；以及(c)在固定有第1寡核苷酸探針的區(qū)域中，使第1寡核苷酸探針和DNA擴(kuò)增片段雜交的步驟。

例如，在圖6的核酸色譜裝置的情況下，在步驟(a)中，DNA擴(kuò)增片段配置在樣品墊32上。在步驟(b)中，按箭頭方向使DNA擴(kuò)增片段擴(kuò)散。在步驟(c)中，在測(cè)試線37中，通過與固定的第1寡核苷酸探針雜交，捕獲DNA擴(kuò)增片段。

在步驟(c)之前，優(yōu)選還包括使DNA擴(kuò)增片段與結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。例如，在圖6的核酸色譜裝置的情況下，DNA擴(kuò)增片段和第2寡核苷酸探針在聯(lián)結(jié)墊33中雜交。

此外，色譜優(yōu)選是(d)在核酸檢測(cè)裝置上的不同于固定有第1寡核苷酸探針的區(qū)域的各個(gè)區(qū)域中，分別配置DNA擴(kuò)增片段、以及結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針；(e)使用溶劑，使DNA擴(kuò)增片段在朝向配置有第2寡核苷酸探針的區(qū)域的方向上擴(kuò)散，該第2寡核苷酸結(jié)合有標(biāo)志物；(f)在配置了結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針的區(qū)域中，使DNA擴(kuò)增片段與結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針雜交；(g)使在步驟(f)中雜交而得的復(fù)合物在朝向配置有第1寡核苷酸探針的方向上在展開介質(zhì)上擴(kuò)散；以及(h)在固定有上述第1寡核苷酸探針的區(qū)域中，使上述第1寡核苷酸探針與上述復(fù)合物雜交。

例如，在圖6的核酸色譜裝置的情況下，在步驟(d)中，DNA擴(kuò)增片段配置在樣品墊32上，第2寡核苷酸探針配置在聯(lián)結(jié)墊33上。在步驟(e)中，DNA擴(kuò)增片段從樣品墊32按箭頭方向擴(kuò)散。在步驟(f)中，DNA擴(kuò)增片段和第2寡核苷酸探針在聯(lián)結(jié)墊33中雜交。在步驟(g)中，DNA擴(kuò)增片段和結(jié)合了標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針的復(fù)合物按箭頭方向擴(kuò)散。在步驟(h)中，第1寡核苷酸探針和復(fù)合物在測(cè)試線37中雜交。

將具有與上述DNA擴(kuò)增片段的一個(gè)標(biāo)簽區(qū)域互補(bǔ)的序列的寡核苷酸探針，作為用于捕獲的第1寡核苷酸探針，固定在膜上的測(cè)試線中。用于捕獲的第1寡核苷酸探針可以直接與膜結(jié)合，也可以通過官能團(tuán)結(jié)合，也可以通過任何物質(zhì)與膜結(jié)合。作為中介的物質(zhì)可列舉肽、蛋白質(zhì)、核酸等，沒有限制。當(dāng)作為中介的物質(zhì)是抗生物素蛋白時(shí)，用于捕獲的寡核苷酸需要進(jìn)行生物素修飾。

在膜上的控制線中，固定有用于捕獲著色擔(dān)載體的寡核苷酸探針。用于控制線的寡核苷酸探針具有與結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針互補(bǔ)的序列，使得當(dāng)溶液展開時(shí)，必然捕獲標(biāo)志物。用于控制線的寡核苷酸探針也如前所述，同樣可以直接與膜結(jié)合，也可以通過官能團(tuán)結(jié)合，也可以通過任何物質(zhì)與膜結(jié)合。作為中介的物質(zhì)可列舉肽、蛋白質(zhì)、核酸等，沒有限制。當(dāng)作為中介的物質(zhì)是抗生物素蛋白時(shí)，用于捕獲的寡核苷酸需要進(jìn)行生物素修飾。

通過在測(cè)試線中顯色，可以目測(cè)判斷樣品中存在目標(biāo)核酸。另一方面，通過控制線中的顯色，可以目測(cè)判斷正常進(jìn)行了展開與著色反應(yīng)。在本文中，目測(cè)是指用肉眼觀察判斷顏色。

色譜用介質(zhì)可列舉包括定性濾紙、定量濾紙、分液濾紙、玻璃纖維濾紙、二氧化硅纖維濾紙、復(fù)合纖維濾紙?jiān)趦?nèi)的濾紙等。此外，也可以使用硝化纖維素等包含纖維素的濾紙、聚醚砜膜等合成樹脂的膜、硅膠、瓊脂糖、葡聚糖、明膠等多孔凝膠。此外，也可以恰當(dāng)?shù)氖褂媚猃埬ぁＴ趯?shí)際使用時(shí)，對(duì)該色譜介質(zhì)的形態(tài)和大小沒有特殊的限制，只要適合操作和觀察反應(yīng)結(jié)果即可。

為了提高親水性或與化合物的結(jié)合性，可以對(duì)這些擔(dān)載體實(shí)施各種修飾。為了使操作更簡(jiǎn)單，優(yōu)選在表面形成反應(yīng)部位的色譜介質(zhì)的內(nèi)部，設(shè)計(jì)包括塑料等在內(nèi)的支持物。

裝置內(nèi)的展開方向可以是如圖6所示的水平方向，也可以是垂直方向，沒有特殊的限制。對(duì)于展開溶劑，由于可以在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用溶劑，因此可以直接將核酸擴(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)液滴至圖6中的樣品墊32上?；蛘撸部梢栽跀U(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)液中另外添加展開溶液并加至樣品墊中。展開溶劑只要是液體即可，沒有特殊的限制，可以使用磷酸緩沖液、Tris緩沖液等優(yōu)秀的緩沖液。此外，也可以在溶劑中溶解鹽、表面活性劑、蛋白質(zhì)或核酸。

在圖7中，作為本發(fā)明的實(shí)施方案的一個(gè)例子，以在層析擔(dān)載體上形成的夾心雜交復(fù)合物為例進(jìn)行說明。在不進(jìn)行熱處理等單鏈化處理的條件下，將核酸擴(kuò)增步驟中獲得的DNA擴(kuò)增片段16用于之后的復(fù)合物形成步驟中。通過寡核苷酸探針與DNA擴(kuò)增片段16之間的雜交，形成第1復(fù)合物41，所述寡核苷酸探針包括能夠與上述DNA片段一個(gè)末端的標(biāo)簽區(qū)域12特異性結(jié)合的核酸序列39和著色擔(dān)載體40。復(fù)合物41可以在上樣至展開介質(zhì)之前在PCR反應(yīng)容器中形成，也可以將DNA擴(kuò)增片段上樣至擔(dān)載體上，并使其利用毛細(xì)管現(xiàn)象，在移動(dòng)中，使其通過涂布了與上述標(biāo)記分子結(jié)合的寡核苷酸并干燥了的擔(dān)載體而形成。

復(fù)合物41與用于捕獲的寡核苷酸探針43在展開介質(zhì)上接觸，所述寡核苷酸探針43預(yù)先結(jié)合在了包括多孔膜等的色譜用介質(zhì)42上的能夠識(shí)別的位置上。上述用于捕獲的寡核苷酸43具有與上述DNA擴(kuò)增片段的另一個(gè)末端的標(biāo)簽序列15互補(bǔ)的序列，通過復(fù)合物41與用于捕獲的寡核苷酸雜交，形成夾心雜交復(fù)合物。

形成夾心雜交復(fù)合物的順序沒有特殊的限制。優(yōu)選在形成DNA擴(kuò)增片段與結(jié)合有標(biāo)志物的第2寡核苷酸探針的復(fù)合物41之后，形成與用于捕獲的第1寡核苷酸探針的復(fù)合物，但也可以在展開介質(zhì)上通過用于捕獲DNA擴(kuò)增片段的第1寡核苷酸探針來濃縮DNA擴(kuò)增片段之后，展開結(jié)合了標(biāo)志物的第2寡核苷酸，形成夾心雜交復(fù)合物。

其他的核酸檢測(cè)裝置的實(shí)施方式可列舉圖8所示的微陣列(DNA芯片)。在微陣列44上的固定有用于捕獲的寡核苷酸的孔內(nèi)，可以通過夾心雜交形成3者的復(fù)合物。

此外，可列舉圖9所示的珠狀方式。在保持有用于捕獲的寡核苷酸的珠狀載體45上，可以通過夾心雜交成3者的復(fù)合物。

本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)裝置可用于包括核酸擴(kuò)增步驟的所有技術(shù)。換言之，可用于包括檢測(cè)通過核酸擴(kuò)增法得到的DNA擴(kuò)增片段(例如，PCR產(chǎn)物)的所有技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，可用于例如分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域、病原體檢測(cè)、過敏原等食品中的摻入物檢測(cè)、食品質(zhì)量管理(仿冒食品、基因重組食品等的檢查)、家畜管理、堿基多態(tài)性(下文也稱為“SNP”)檢測(cè)、癌癥等疾病檢查等。因此，本發(fā)明還包括了病原體感染癥的檢測(cè)方法、食品中的混合物(例如，過敏原)的檢測(cè)方法、食品質(zhì)量管理、家畜的管理方法和堿基多態(tài)性的檢測(cè)方法等，上述方法包括本發(fā)明所涉及的核酸檢測(cè)方法作為一個(gè)步驟。

在本文中，作為本發(fā)明應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案，詳細(xì)的說明本發(fā)明所涉及的病原體檢測(cè)方法和過敏原的檢測(cè)方法。

本發(fā)明所涉及的病原體檢測(cè)方法使用了本發(fā)明所涉及的核酸檢測(cè)方法，只要包括檢測(cè)病原體特有基因的步驟即可。上述病原體沒有特殊的限制，具體而言，可列舉例如病原性細(xì)菌、病原性病毒、食物中毒細(xì)菌、醫(yī)院內(nèi)感染病原菌和病毒等。更具體而言，可列舉例如丙型肝炎病毒(HCV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、皰疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)等病毒、O157等大腸桿菌、結(jié)核菌、傷寒桿菌、沙門氏菌或腸炎弧菌等細(xì)菌、或支原體等微生物。

對(duì)本發(fā)明所涉及的病原體檢測(cè)方法更具體的說明是：例如，使用上述核酸檢測(cè)方法，判斷由作為檢查有無病原體的對(duì)象的樣品制備的DNA樣品中，是否包含上述病原體特有的基因。此外，在不制備DNA樣品的條件下，可以將作為檢查有無病原體的對(duì)象的樣品直接作為核酸擴(kuò)增法的模板使用。例如，在檢測(cè)作為病原體的大腸桿菌等細(xì)菌的情況下，可以使用細(xì)菌菌落的懸浮液作為模板。其結(jié)果是，當(dāng)檢測(cè)到病原體特有的基因時(shí)，判斷所述樣品中包含病原體。因此，可以不需要特殊的裝置，簡(jiǎn)單且高精度地判斷樣品中是否包含病原體。即，本發(fā)明所涉及的病原體檢測(cè)方法可用于診斷微生物感染癥。

本發(fā)明所涉及的過敏原的檢測(cè)方法只要包括使用本發(fā)明所涉及的核酸檢測(cè)方法，檢測(cè)編碼過敏原的基因的步驟即可。上述過敏原沒有特殊的限制，具體而言，可列舉例如包含在食品中的過敏原。更具體而言，可列舉蛋清過敏原、乳過敏原、小麥過敏原、蕎麥過敏原和花生過敏原等。對(duì)本發(fā)明所涉及的過敏原的檢測(cè)方法更具體的說明是：例如，使用上述核酸檢測(cè)方法，判斷從食品制備的DNA樣品中，是否存在編碼蛋、乳、小麥、蕎麥、花生等過敏原的基因。其結(jié)果是在檢測(cè)到這類基因的情況下，判斷所述食品中包括含有過敏原的原材料。

因此，不需要特殊的裝置，就可以簡(jiǎn)單且高精度地判斷食品等樣品中是否包含具有過敏原的原材料。此外，過敏原的來源不限于上文示例的對(duì)象，例如以谷類為例，包括稻、玉米、小米、黍、稗子、蕎麥和豆類的全部。此外，DNA是熱穩(wěn)定的，也可以在加工食品中進(jìn)行微量檢測(cè)。因此，通過本發(fā)明所涉及的過敏原的檢測(cè)方法獲得的數(shù)據(jù)，除了用于食品標(biāo)示、食品的過敏原信息外，還可用于檢測(cè)極微量殘存的加工助劑或殘留物等食品添加物，或者生產(chǎn)線之間有無相互污染等生產(chǎn)者預(yù)料以外的物質(zhì)的摻入。

此外，本發(fā)明可用于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的親子鑒定、家畜的血統(tǒng)鑒定、農(nóng)產(chǎn)品品種鑒定、SNP檢測(cè)、由于基因突變?cè)斐傻募膊?癌等)檢測(cè)等。具體而言，例如，以家畜為例，可用于血統(tǒng)登記、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、去除病原基因攜帶個(gè)體等目的。但本發(fā)明并不限于上文說明的各種構(gòu)成，可以在權(quán)利要求保護(hù)的范圍所表示的范圍內(nèi)進(jìn)行各種改變，對(duì)于恰當(dāng)?shù)慕M合不同實(shí)施方案中啟示的技術(shù)手段所獲得的實(shí)施方案，也包括在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例

下面通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些實(shí)施例。

<實(shí)施例1>

(1)連接有L-DNA標(biāo)簽的引物的合成

在本實(shí)施例中，使用pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))作為模板，設(shè)計(jì)了用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增約330個(gè)堿基對(duì)的正向引物(F)和反向引物(R)。進(jìn)一步地，設(shè)計(jì)了分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入了由非天然型(L型)DNA鏈形成的標(biāo)簽序列T1和T2的連有L-DNA標(biāo)簽的引物，即T1-F和T2-R。連接有L-DNA標(biāo)簽的引物的合成使用0.2μM尺寸的柱子，基于一般的亞磷酰胺法，使用DNA自動(dòng)合成儀(H-8-SE：Gene World)合成。

示出在本研究中制備的引物組。

引物F：5’-^Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)1)

引物R：5’-^Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)2)

標(biāo)簽序列T1：5’-^Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)-3’(序列號(hào)3)

標(biāo)簽序列T2：5’-^Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)-3’(序列號(hào)4)

引物T1-F：

5’-^Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)-^Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)5)

引物T2-R：

5’-^Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)-^Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)6)。

(2)使用連接有L-DNA標(biāo)簽的引物組的PCR反應(yīng)

使用在上述步驟(1)中實(shí)施制備的引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各15pmol引物F和引物R、10ng pUC19添加到0.2Ml PCR管中，根據(jù)ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制100μl的PCR反應(yīng)液。然后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行35個(gè)95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，擴(kuò)增約330bp的目標(biāo)。此外，進(jìn)行不添加pUC19的相同反應(yīng)，作為陰性對(duì)照。

(3)制備與膠乳結(jié)合的L型寡核苷酸探針

在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的L型寡核苷酸探針(序列號(hào)7、序列號(hào)3的互補(bǔ)鏈)，在結(jié)合后，用單乙醇胺進(jìn)行嵌段。在離心分離上述反應(yīng)液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，將其均勻的添加在用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

核苷酸探針1：5’-^Ld(TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC)-NH₂-3’(序列號(hào)7)。

(4)將L型寡核苷酸探針固定在固相上

用水溶性碳化二亞胺處理羧基修飾的尼龍膜(日本Pall公司生產(chǎn)、6mm×60mm)，用去離子水洗滌。在距活化的膜的一個(gè)末端30mm處，用分配器將具有與序列號(hào)4互補(bǔ)的序列(序列號(hào)8)的含有氨基的L型寡核苷酸探針涂抹在線上，風(fēng)干15分鐘。然后，用Tris緩沖液處理膜，在嵌段后，水洗膜并干燥。

核苷酸探針2：5’-^Ld(CACTGGGCATACGGTAGCAT)-NH₂-3’(序列號(hào)8)。

(5)制備核酸色譜型測(cè)試條(test strip)

如圖6所示，將如上所述制備的由尼龍膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板(backing sheet)制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了連接有L型DNA標(biāo)簽的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(6)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在不變性通過步驟(2)制備的PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物直接上樣于通過步驟(5)制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)步驟(2)中添加pUC19作為檢查材料時(shí)，在測(cè)試線上檢測(cè)到目標(biāo)核酸特異性的著色線。另一方面，當(dāng)添加水作為陰性對(duì)照時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到線。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例2>

(1)合成連接有發(fā)夾標(biāo)簽的引物

與實(shí)施例1的步驟(1)相同，使用pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))作為模板，設(shè)計(jì)用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增約330個(gè)堿基對(duì)的正向引物(F)和反向引物(R)。還分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(H)和標(biāo)簽序列T3和T4，合成連接有標(biāo)簽的引物T3-H-F和T4-H-R。

示出在本研究中制備的引物組。

聚合酶反應(yīng)抑制序列H：

5’-^Dd(AGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTCGCCT)-3’(序列號(hào)9)

標(biāo)簽序列T3：5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-3’(序列號(hào)10)

標(biāo)簽序列T4：5’-^Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAAT)-3’(序列號(hào)11)

引物T3-H-F：

5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATG

TGCGCTCGCGACCTCGCCTGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)12)

引物T4-H-R：

5’-^Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGC GCTCGCGACCTCGCCTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)13)。

(2)使用了連接有發(fā)夾標(biāo)簽的引物組的PCR反應(yīng)

使用了在上述步驟(1)中實(shí)施制備的引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各15pmol引物F和引物R、10ng pUC19添加到0.2ml PCR管中，根據(jù)ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制100μl PCR反應(yīng)液。然后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行35個(gè)95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，擴(kuò)增約330bp的目標(biāo)。此外，進(jìn)行不添加pUC19的相同反應(yīng)，作為陰性對(duì)照。

(3)制備與膠乳結(jié)合的寡核苷酸探針

在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針(序列號(hào)14、序列號(hào)10的互補(bǔ)鏈)，在結(jié)合后，用單乙醇胺進(jìn)行嵌段。在離心分離上述反應(yīng)液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，將其均勻的添加在用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

寡核苷酸探針3：

5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-NH₂-3’(序列號(hào)14)。

(4)將寡核苷酸探針固定在固相上

用水溶性碳化二亞胺處理羧基修飾的尼龍膜(日本Pall公司生產(chǎn)、6mm×60mm)，用去離子水洗滌。在距活化的膜的一個(gè)末端30mm處，用分配器將具有與序列號(hào)11互補(bǔ)的序列(序列號(hào)15)的含有氨基的L型寡核苷酸探針涂抹在線上，風(fēng)干15分鐘。然后，用Tris緩沖液處理膜，在嵌段后，水洗膜并干燥。

寡核苷酸探針4：5’-^Dd(ATTGAGCAAGTGTACAGAGCA)-NH₂-3’(序列號(hào)15)。

(5)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由尼龍膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了連接有發(fā)夾標(biāo)簽的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(6)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在不變性通過步驟(2)制備的PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物直接上樣至由步驟(5)制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)步驟(2)中添加pUC19作為檢查材料時(shí)，在測(cè)試線上檢測(cè)到目標(biāo)核酸特異性的著色線。另一方面，當(dāng)添加水作為陰性對(duì)照時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到線。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例3>

(1)合成插入人工核酸(偶氮苯)的引物

與實(shí)施例1的步驟(1)相同，使用pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))作為模板，設(shè)計(jì)用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增約330個(gè)堿基對(duì)的正向引物(F)和反向引物(R)。還分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入含有人工核酸即偶氮苯的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(X)和標(biāo)簽序列T5和T6，合成了連接有標(biāo)簽的引物T5-X-F和T6-X-R。這2種插入偶氮苯的引物是委托筑波OLIGO SERVICE株式會(huì)社合成并購入的。示出本研究中制備的引物組。

標(biāo)簽序列T5：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列號(hào)16)

標(biāo)簽序列T6：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列號(hào)17)

引物T5-X-F：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)18)

引物T6-X-R：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)19)

此外，插入到引物中的偶氮苯如下式(1)所示。

[化學(xué)式1]

(2)使用了插入偶氮苯的引物組的PCR反應(yīng)

使用了在上述步驟(1)中實(shí)施制備的引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各15pmol引物T5-X-F和引物T6-X-R、10ng pUC19添加到0.2ml PCR管中，根據(jù)ExTaqPCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制100μl PCR反應(yīng)液。然后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行35個(gè)95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，擴(kuò)增約330bp的目標(biāo)。此外，進(jìn)行不添加pUC19的相同反應(yīng)，作為陰性對(duì)照。

(3)制備與膠乳結(jié)合的寡核苷酸探針

在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針(序列號(hào)20、序列號(hào)16的互補(bǔ)鏈)，在結(jié)合后，用單乙醇胺進(jìn)行嵌段。在離心分離上述反應(yīng)液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，將其均勻的添加在用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

寡核苷酸探針5：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH₂-3’(序列號(hào)20)。

(4)將寡核苷酸探針固定在固相上

用水溶性碳化二亞胺處理羧基修飾的尼龍膜(日本Pall公司生產(chǎn)、6mm×60mm)，用去離子水洗滌。在距活化的膜的一個(gè)末端30mm處，用分配器將具有與序列號(hào)17互補(bǔ)的序列(序列號(hào)21)的含有氨基的D型寡核苷酸探針涂抹在線上，風(fēng)干15分鐘。然后，用Tris緩沖液處理膜，在嵌段后，水洗膜并干燥。

寡核苷酸探針6：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-NH₂-3’(序列號(hào)21)。

(5)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由尼龍膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了插入偶氮苯的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(6)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在不變性通過步驟(2)制備的PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物直接上樣至由步驟(5)制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)步驟(2)中添加pUC19作為檢查材料時(shí)，在測(cè)試線上檢測(cè)到目標(biāo)核酸特異性的著色線。另一方面，當(dāng)添加水作為陰性對(duì)照時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到線。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例4>

(1)制備結(jié)合有金膠體的寡核苷酸探針

混合Gold Colloid(40nm、9.0×1010(顆粒數(shù)/ml)、British BioCellInternational公司生產(chǎn))和含有巰基的寡核苷酸探針(序列號(hào)22、序列號(hào)16的互補(bǔ)鏈)，在50℃下溫育16小時(shí)。在6000rpm下離心分離15分鐘，去除上清液，加入0.05M氯化鈉、5mM磷酸緩沖液pH7，混和后，再在50℃下溫育40小時(shí)。

溫育后，進(jìn)行離心(6000rpm、15分鐘)，去除上清液，加入5mM磷酸緩沖液(pH7)。再次進(jìn)行該緩沖液置換。

將配制的金膠體溶液均勻的添加到用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上之后，在真空干燥器中干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

寡核苷酸探針7：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-SH-3’(序列號(hào)22)。

(2)將寡核苷酸探針固定在固相上

將具有與序列號(hào)17互補(bǔ)的序列(序列號(hào)23)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針，與鏈霉親和素混合。用分配器將該混合液涂抹在硝化纖維素膜(商品名：Hi-Flow 180、Millipore公司生產(chǎn))上，在40℃風(fēng)干30分鐘。

寡核苷酸探針8：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列號(hào)23)。

(3)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由硝化纖維素膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了插入偶氮苯的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(4)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在不變性通過實(shí)施例3的步驟(2)制備的PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物直接上樣至由步驟(3)制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)實(shí)施例3的步驟(2)中添加pUC19作為檢查材料時(shí)，在測(cè)試線上檢測(cè)到目標(biāo)核酸特異性的著色線。另一方面，當(dāng)添加水作為陰性對(duì)照時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到線。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例5>

(1)將寡核苷酸探針固定在固相上

用分配器將具有與序列號(hào)17互補(bǔ)的序列(序列號(hào)24)的寡核苷酸探針涂抹在UltraBind親和膜(日本Pall公司生產(chǎn))上，在80℃風(fēng)干1小時(shí)。

寡核苷酸探針9：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-3’(序列號(hào)24)。

(2)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由UltraBind親和膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了插入偶氮苯的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(3)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在不變性通過實(shí)施例3的步驟(2)制備的PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物直接上樣至由步驟(2)制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)實(shí)施例3的步驟(2)中添加pUC19作為檢查材料時(shí)，在測(cè)試線上檢測(cè)到目標(biāo)核酸特異性的著色線。另一方面，當(dāng)添加水作為陰性對(duì)照時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到線。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例6>

(1)合成插入人工核酸(偶氮苯)的引物

在本實(shí)施例中，目標(biāo)核酸的模板使用pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))、EcoRI甲基化酶基因和BamHI甲基化酶基因這3種作為模板，分別設(shè)計(jì)用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增約330個(gè)堿基對(duì)、約200個(gè)堿基對(duì)和約100個(gè)堿基對(duì)的正向引物(F1)和反向引物(R1)、正向引物(F2)和反向引物(R2)，以及正向引物(F3)和反向引物(R3)這3組引物。還分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入含有人工核酸即偶氮苯的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(X)和標(biāo)簽序列T10和T11、標(biāo)簽序列T12和T13，以及標(biāo)簽序列T14和T15，合成了連接有標(biāo)簽的引物T10-X-F1和T11-X-R1、T12-X-F2和T13-X-R2、T14-X-F3和T15-X-R3。這6種插入偶氮苯的引物是委托筑波OLIGO SERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文示出本研究中制備的3組引物組。

標(biāo)簽序列T10：

5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列號(hào)25)

標(biāo)簽序列T11：

5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列號(hào)26)

引物T10-X-F1：

5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)27)

引物T11-X-R1：

5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)28)

標(biāo)簽序列T12：

5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)-3’(序列號(hào)29)

標(biāo)簽序列T13：

5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3’(序列號(hào)30)

引物T12-X-F2：

5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT XAGCATTATGAATTATATGGT)-3’(序列號(hào)31)

引物T13-X-R2：

5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA XTTGTTTACATTTATAGCATC)-3’(序列號(hào)32)

標(biāo)簽序列T14：

5’-^Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)-3’(序列號(hào)33)

標(biāo)簽序列T15：

5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3’(序列號(hào)34)

引物T14-X-F3：

5’-^Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA XTGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3’(序列號(hào)35)

引物T15-X-R3：

5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG XAGTATGATGAGGGTGTAACA)-3’(序列號(hào)36)

(2)使用了3組插入偶氮苯的引物組的PCR反應(yīng)

使用了在上述步驟(1)中實(shí)施制備的3組引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各15pmol引物T10-X-F1、引物T11-X-R1、引物T12-X-F2、引物T13-X-R2、引物T14-X-F3和引物T15-X-R3、各模板10ng添加到0.2ml PCR管中，根據(jù)ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制100μl PCR反應(yīng)液。制備以下5種反應(yīng)液。

(i)添加pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))作為模板

(ii)添加EcoRI甲基化酶基因作為模板

(iii)添加BamHI甲基化酶基因作為模板

(uv)添加所有3種pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))、EcoRI甲基化酶基因和BamHI甲基化酶基因作為模板，和

(v)無模板。

在配制了這些反應(yīng)液后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCRSystem、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，如下獲得具有相應(yīng)的目標(biāo)序列的DNA片段。擴(kuò)增了(i)約330bp；(ii)約200bp；(iii)約100bp；和(iv)約330bp、約200bp、約100bp這3種；(v)無擴(kuò)增DNA片段(作為陰性對(duì)照)。

(3)制備與膠乳結(jié)合的寡核苷酸探針

在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，分別混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(藍(lán)色)(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針16(序列號(hào)37、序列號(hào)25的互補(bǔ)鏈)、含有羧基的聚苯乙烯膠乳(桔色)(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針17(序列號(hào)38、序列號(hào)29的互補(bǔ)鏈)、以及含有羧基的聚苯乙烯膠乳(綠色)(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針18(序列號(hào)39、序列號(hào)33的互補(bǔ)鏈)，在結(jié)合后，用單乙醇胺進(jìn)行嵌段。在離心分離上述反應(yīng)液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，制備結(jié)合了寡核苷酸探針16的膠乳(藍(lán)色)、結(jié)合了寡核苷酸探針17的膠乳(桔色)、結(jié)合了寡核苷酸探針18的膠乳(綠色)。

將這3種膠乳均勻的添加在用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

寡核苷酸探針16：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH₂-3’(序列號(hào)37)。

寡核苷酸探針17：

5’-^Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-NH₂-3’(序列號(hào)38)。

寡核苷酸探針18：

5’-^Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)-NH₂-3’(序列號(hào)39)。

(4)將3種寡核苷酸探針固定在固相上

將具有與序列號(hào)26互補(bǔ)的序列(序列號(hào)40)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針、具有與序列號(hào)30互補(bǔ)的序列(序列號(hào)41)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針，和具有與序列號(hào)34互補(bǔ)的序列(序列號(hào)42)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針，分別與鏈霉親和素混合。使用分配器，將這些混合液涂抹在硝化纖維素膜(商品名：Hi-Flow 135、Millipore公司生產(chǎn))3個(gè)位點(diǎn)處，為自上游開始依次相互分離的位置上，在40℃風(fēng)干30分鐘。制備3條測(cè)試線。

寡核苷酸探針19：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列號(hào)40)。

寡核苷酸探針20：

5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-生物素-3’(序列號(hào)41)。

寡核苷酸探針21：

5’-^Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-生物素-3’(序列號(hào)42)。

(5)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由硝化纖維素膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、步驟(3)制備的聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了插入偶氮苯引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(6)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在分別不變性通過步驟(2)中制備的(i)-(v)PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物分別直接上樣至步驟(5)中制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下所示。

(i)：僅第1條測(cè)試線著色為藍(lán)色。

(ii)：僅第2條測(cè)試線著色為桔色。

(iii)：僅第3條測(cè)試線著色為綠色。

(iv)：第1條測(cè)試線著色為藍(lán)色，第2條測(cè)試線著色為桔色，第3條測(cè)試線著色為綠色。

(v)：沒有發(fā)現(xiàn)任何一條測(cè)試線著色。

根據(jù)上述結(jié)果，可以分別特異性地檢測(cè)目標(biāo)基因，確定可以同時(shí)檢測(cè)3種。

此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例7>

(1)合成聯(lián)合引物

在本實(shí)施例中，目標(biāo)核酸的模板使用pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))、EcoRI甲基化酶基因和BamHI甲基化酶基因這3種作為模板，分別設(shè)計(jì)用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增約330個(gè)堿基對(duì)、約200個(gè)堿基對(duì)和約100個(gè)堿基對(duì)的正向引物(Fj1)和反向引物(Rj1)、正向引物(Fj2)和反向引物(Rj2)，以及正向引物(Fj3)和反向引物(Rj3)這3組引物。還分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入共同序列KF1和KR1、共同序列KF2和KR2，以及共同序列KF3和KR3，合成了連接有共同序列的引物KF1-Fj1和KR1-Rj1、KF2-Fj2和KR2-Rj2、KF3-Fj3和KR3-Rj3。這6種連接共同序列的引物是委托筑波OLIGO SERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文顯示本研究中制備的3組引物組。

共同序列KF1：5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列號(hào)43)

共同序列KR1：5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列號(hào)44)

引物KF1-Fj1：

5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT

GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)45)

引物KR1-Rj1：

5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG

TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)46)

共同序列KF2：5’-^Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3’(序列號(hào)47)

共同序列KR2：5’-^Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)-3’(序列號(hào)48)

引物KF2-Fj2：

5’-^Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT

AGCATTATGAATTATATGGT)-3’(序列號(hào)49)

引物KR2-Rj2：

5’-^Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA

TTGTTTACATTTATAGCATC)-3’(序列號(hào)50)

共同序列KF3：5’-^Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3’(序列號(hào)51)

共同序列KR3：5’-^Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)-3’(序列號(hào)52)

引物KF3-Fj3：

5’-^Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC

TGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3’(序列號(hào)53)

引物KR3-Rj3：

5’-^Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC

AGTATGATGAGGGTGTAACA)-3’(序列號(hào)54)

(2)合成插入人工核酸(偶氮苯)的引物

在本實(shí)施例中，為了能夠與步驟1中制備的聯(lián)合引物組分別擴(kuò)增的3種PCR擴(kuò)增片段結(jié)合，分別設(shè)計(jì)與聯(lián)合引物具有相同的共同序列的3組引物。分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入含有人工核酸即偶氮苯的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(X)和標(biāo)簽序列T22和T23、標(biāo)簽序列T24和T25、標(biāo)簽序列T26和T27，合成了連接有標(biāo)簽的引物T22-X-KF1和T23-X-KR1、T24-X-KF2和T25-X-KR2、T26-X-KF3和T27-X-KR3。這6種插入偶氮苯的引物是委托筑波OLIGO SERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文示出研究中制備的3組引物組。

標(biāo)簽序列T22：

5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列號(hào)55)

標(biāo)簽序列T23：

5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列號(hào)56)

引物T22-X-KF1：

5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XTGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列號(hào)57)

引物T23-X-KR1：

5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列號(hào)58)

標(biāo)簽序列T24：

5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)-3’(序列號(hào)59)

標(biāo)簽序列T25：

5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3’(序列號(hào)60)

引物T24-X-KF2：

5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT XCCGGAACAGACACCAGGTTT)-3’(序列號(hào)61)

引物T25-X-KR2：

5’-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA XGAAGCTGTACCGTCACATGA)-3’(序列號(hào)62)

標(biāo)簽序列T26：5’-Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)-3’(序列號(hào)63)

標(biāo)簽序列T27：5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3’(序列號(hào)64)

引物T26-X-KF3：

5’-^Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA XATACCGATGAGTGTGCTACC)-3’(序列號(hào)65)

引物T27-X-KR3：

5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG XTGGCCTGTGTGACACTATGC)-3’(序列號(hào)66)

(3)使用聯(lián)合引物和插入偶氮苯的引物的PCR反應(yīng)

使用了在上述步驟(1)和(2)中實(shí)施制備的6組引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各8pmol引物KF1-Fj1、引物KR1-Rj1、引物KF2-Fj2、引物KR2-Rj2、引物KF3-Fj3、引物KR3-Rj3、引物T22-X-KF1、引物T23-X-KR1、引物T24-X-KF2、引物T25-X-KR2、引物T26-X-KF3、引物T27-X-KR3、各模板10ng添加到0.2ml PCR管中，根據(jù)ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制100μl PCR反應(yīng)液。制備以下5種反應(yīng)液。

(i)添加pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))作為模板

(ii)添加EcoRI甲基化酶基因作為模板

(iii)添加BamHI甲基化酶基因作為模板

(iv)添加所有3種pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))、EcoRI甲基化酶基因和BamHI甲基化酶基因作為模板，和

(v)無模板。

在配制了這些反應(yīng)液后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCRSystem、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，如下獲得具有相應(yīng)的目標(biāo)序列的DNA片段。擴(kuò)增(i)約360bp；(ii)約230bp；(iii)約130bp；和(iv)約360bp、約230bp、約130bp這3種；(v)無擴(kuò)增DNA片段(作為陰性對(duì)照)。

(4)制備與膠乳結(jié)合的寡核苷酸探針

在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，分別混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(藍(lán)色)(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針28(序列號(hào)67、序列號(hào)55的互補(bǔ)鏈)、含有羧基的聚苯乙烯膠乳(桔色)(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針29(序列號(hào)68、序列號(hào)59的互補(bǔ)鏈)、以及含有羧基的聚苯乙烯膠乳(綠色)(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和含有氨基的寡核苷酸探針30(序列號(hào)69、序列號(hào)63的互補(bǔ)鏈)，在結(jié)合后，用單乙醇胺進(jìn)行嵌段。在離心分離上述反應(yīng)液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，制備結(jié)合了寡核苷酸探針28的膠乳(藍(lán)色)、結(jié)合了寡核苷酸探針29的膠乳(桔色)、結(jié)合了寡核苷酸探針30的膠乳(綠色)。

將這3種膠乳均勻的添加在用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

寡核苷酸探針28：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH₂-3’(序列號(hào)67)。

寡核苷酸探針29：

5’-^Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-NH₂-3’(序列號(hào)68)

寡核苷酸探針30：5’-^Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)-NH₂-3’(序列號(hào)69)

(5)將3種寡核苷酸探針固定在固相上

將具有與序列號(hào)56互補(bǔ)的序列(序列號(hào)70)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針、具有與序列號(hào)60互補(bǔ)的序列(序列號(hào)71)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針，和具有與序列號(hào)64互補(bǔ)的序列(序列號(hào)72)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針，分別與鏈霉親和素混合。用分配器將這些混合液涂抹在硝化纖維素膜(商品名：Hi-Flow 135、Millipore公司生產(chǎn))的三個(gè)位點(diǎn)處，自上游開始依次相互分離的位置上，在40℃風(fēng)干30分鐘。制備3條測(cè)試線。

寡核苷酸探針31：5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列號(hào)70)。

寡核苷酸探針32：5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-生物素-3’(序列號(hào)71)。

寡核苷酸探針33：5’-^Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-生物素-3’(序列號(hào)72)。

(6)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由硝化纖維素膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、步驟(4)制備的聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了插入偶氮苯的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(7)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在分別不變性通過步驟(3)制備的(i)-(v)PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物分別直接上樣至步驟(6)中制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下所示。

(i)：僅第1條測(cè)試線著色為藍(lán)色。

(ii)：僅第2條測(cè)試線著色為桔色。

(iii)：僅第3條測(cè)試線著色為綠色。

(iv)：第1條測(cè)試線著色為藍(lán)色，第2條測(cè)試線著色為桔色，第3條測(cè)試線著色為綠色。

(v)：沒有發(fā)現(xiàn)任何一條測(cè)試線著色。

根據(jù)上述結(jié)果，可以分別特異性地檢測(cè)目標(biāo)基因，確定可以同時(shí)檢測(cè)3種。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例8>

(1)合成聯(lián)合引物

在本實(shí)施例中，目標(biāo)核酸的模板使用pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))作為模板，設(shè)計(jì)用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增約330個(gè)堿基對(duì)的正向引物(F)和反向引物(R)。分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入共同序列KF和KR，合成了連接有共同序列的引物KF-F和KR-R。這2種連接共同序列的引物是委托筑波OLIGOSERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文示出本研究中制備的引物組。

共同序列KF：5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列號(hào)73)

共同序列KR：5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列號(hào)74)

引物KF-F：

5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT

GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)75)

引物KR-R：

5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG

TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)76)

(2)合成生物素修飾的引物和FITC修飾的引物

在本實(shí)施例中，為了能夠與步驟(1)中制備的聯(lián)合引物組擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增片段結(jié)合，分別設(shè)計(jì)與聯(lián)合引物具有相同的共同序列的引物。合成了一條引物的5’末端進(jìn)行了生物素修飾的引物，合成了另一條引物的5’末端進(jìn)行了FITC修飾的引物。這2種修飾引物是委托筑波OLIGO SERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文示出本研究中制備的引物組。

引物KF2：5’-生物素-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列號(hào)77)

引物KR2：5’-FITC-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列號(hào)78)

(3)使用了聯(lián)合引物和修飾引物的PCR反應(yīng)

使用在上述步驟(1)和(2)中實(shí)施制備的引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各8pmol引物KF-F、引物KR-R、引物KF2、引物KR2、10ng作為模板的pUC19添加到0.2ml PCR管中，根據(jù)ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制100μl PCR反應(yīng)液。在配制了反應(yīng)液后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，擴(kuò)增具有約360bp的目標(biāo)序列的DNA片段。

(4)制備與膠乳結(jié)合的鏈霉親和素

在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(藍(lán)色)(固體成分10％(w/w)、Bangs公司生產(chǎn))和鏈霉親和素(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))，在結(jié)合后，用單乙醇胺進(jìn)行嵌段。在離心分離上述反應(yīng)液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，制備結(jié)合了鏈霉親和素的膠乳(藍(lán)色)。將該膠乳溶液均勻的添加在用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

(5)將抗FITC(異硫氰酸熒光素)抗體固定在固相上

將抗FITC抗體(Invitrogen公司生產(chǎn))溶解在5mM Tris緩沖液(pH7.5)中，使用分配器涂抹在硝化纖維素膜(商品名：Hi-Flow 135、Millipore公司生產(chǎn))的線上，在40℃風(fēng)干30分鐘。制備測(cè)試線。

(6)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由硝化纖維素膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、步驟(4)制備的聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了生物素修飾引物和FITC修飾引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(7)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在不變性通過步驟(3)制備的PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物直接上樣至由步驟(6)制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)在步驟(3)中添加pUC19作為檢查材料時(shí)，結(jié)果在測(cè)試線上檢測(cè)到目標(biāo)核酸特異性著色線。另一方面，當(dāng)添加水作為陰性對(duì)照時(shí)，沒有檢測(cè)到線。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例9>

(1)合成聯(lián)合引物

在本實(shí)施例中，目標(biāo)核酸的模板使用pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))、EcoRI甲基化酶基因和BamHI甲基化酶基因這3種作為模板，分別設(shè)計(jì)用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增的約330個(gè)堿基對(duì)、約200個(gè)堿基對(duì)和約100個(gè)堿基對(duì)的正向引物(Fj1)和反向引物(Rj1)、正向引物(Fj2)和反向引物(Rj2)，以及正向引物(Fj3)和反向引物(Rj3)這3組引物。還分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入共同序列KF1和KR1、共同序列KF2和KR2，以及共同序列KF3和KR3，合成了連接有共同序列的引物KF1-Fj1和KR1-Rj1、KF2-Fj2和KR2-Rj2、KF3-Fj3和KR3-Rj3。這6種連接共同序列的引物是委托筑波OLIGOSERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文示出本研究中制備的3組引物組。

共同序列KF1：5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列號(hào)79)

共同序列KR1：5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列號(hào)80)

引物KF1-Fj1：

5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT

GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)81)

引物KR1-Rj1：

5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG

TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)82)

共同序列KF2：5’-^Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3’(序列號(hào)83)

共同序列KR2：5’-^Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)-3’(序列號(hào)84)

引物KF2-Fj2：

5’-^Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT

AGCATTATGAATTATATGGT)-3’(序列號(hào)85)

引物KR2-Rj2：

5’-^Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA

TTGTTTACATTTATAGCATC)-3’(序列號(hào)86)

共同序列KF3：5’-^Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3’(序列號(hào)87)

共同序列KR3：5’-Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)-3’(序列號(hào)88)

引物KF3-Fj3：

5’-^Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC

TGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3’(序列號(hào)89)

引物KR3-Rj3：

5’-^Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC

AGTATGATGAGGGTGTAACA)-3’(序列號(hào)90)

(2)合成插入人工核酸(偶氮苯)的引物和生物素修飾的引物

在本實(shí)施例中，為了能夠與步驟1中制備的聯(lián)合引物組分別擴(kuò)增的3種PCR擴(kuò)增片段結(jié)合，分別設(shè)計(jì)與聯(lián)合引物具有相同的共同序列的3組引物。合成了3組引物中各自的一條引物為在5’末端進(jìn)行了生物素化修飾的引物KF1、KF2、和KF3。此外，合成了3組引物中各自的另一條引物為在5’末端導(dǎo)入含有人工核酸即偶氮苯的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(X)和標(biāo)簽序列T34、標(biāo)簽序列T35和標(biāo)簽序列T36的具有標(biāo)簽的引物，即T34-X-KR1、T35-X-KR2和T36-X-KR3。這6種修飾的引物是委托筑波OLIGO SERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文示出本研究中制備的3組引物組。

標(biāo)簽序列T34：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列號(hào)91)

引物KF1：5’-生物素-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列號(hào)92)

引物T34-X-KR1：

5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列號(hào)93)

標(biāo)簽序列T35：

5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3’(序列號(hào)94)

引物KF2：5’-生物素-^Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3’(序列號(hào)95)

引物T35-X-KR2：

5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA XGAAGCTGTACCGTCACATGA)-3’(序列號(hào)96)

標(biāo)簽序列T36：5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3’(序列號(hào)97)

引物KF3：5’-生物素-^Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3’(序列號(hào)98)

引物T36-X-KR3：

5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG XTGGCCTGTGTGACACTATGC)-3’(序列號(hào)99)

(3)使用聯(lián)合引物和偶氮苯插入引物的PCR反應(yīng)

使用在上述步驟(1)和(2)中實(shí)施制備的6組引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各8pmol引物KF1-Fj1、引物KR1-Rj1、引物KF2-Fj2、引物KR2-Rj2、引物KF3-Fj3、引物KR3-Rj3、引物KF1、引物T34-X-KR1、引物KF2、引物T35-X-KR2、引物KF3、引物T36-X-KR3、各模板10ng添加到0.2ml PCR管中，根據(jù)ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制100μl PCR反應(yīng)液。制備以下5種反應(yīng)液。

(i)添加pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))作為模板

(ii)添加EcoRI甲基化酶基因作為模板、

(iii)添加BamHI甲基化酶基因作為模板

(iv)添加所有3種pUC19(Takara Bio公司生產(chǎn))、EcoRI甲基化酶基因和BamHI甲基化酶基因作為模板，和

(v)無模板。

在配制了這些反應(yīng)液后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCRSystem、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，如下獲得具有相應(yīng)的目標(biāo)序列的DNA片段。擴(kuò)增(i)約360bp；(ii)約230bp；(iii)約130bp；和(iv)約360bp、約230bp、約130bp這3種；(v)無擴(kuò)增DNA片段(作為陰性對(duì)照)。

(4)制備與金膠體結(jié)合的鏈霉親和素

混合Gold Colloid(粒徑40nm、British BioCell International公司生產(chǎn))和鏈霉親和素，在50℃下溫育16小時(shí)。在6000rpm下離心分離15分鐘，去除上清液，加入0.05M氯化鈉、5mM磷酸緩沖液pH7，混和后，再在50℃下溫育40小時(shí)。

溫育后，進(jìn)行離心(6000rpm、15分鐘)，去除上清液，加入5mM磷酸緩沖液(pH7)。再次進(jìn)行該緩沖液置換。

將配制的金膠體溶液均勻的添加到用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上之后，在真空干燥器中干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

(5)將3種寡核苷酸探針固定在固相上

合成具有與序列號(hào)91互補(bǔ)的序列(序列號(hào)100)的寡核苷酸探針、與序列號(hào)94互補(bǔ)的序列(序列號(hào)101)的寡核苷酸探針和與序列號(hào)97互補(bǔ)的序列(序列號(hào)102)的寡核苷酸探針。在硝化纖維素膜(商品名：Hi-Flow 135、Millipore公司生產(chǎn))上的3個(gè)位點(diǎn)，使用分配器將這些混合液涂抹在自上游開始依次相互分離的位置上的線上，在40℃風(fēng)干30分鐘。制備3條測(cè)試線。

寡核苷酸探針37：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-3’(序列號(hào)100)。

寡核苷酸探針38：

5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-3’(序列號(hào)101)。

寡核苷酸探針39：

5’-^Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-3’(序列號(hào)102)。

(6)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由硝化纖維素膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、步驟(4)制備的聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了生物素修飾的引物和插入偶氮苯的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(7)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在分別不變性通過步驟(3)制備的(i)-(v)PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物分別直接上樣至步驟(6)中制備的測(cè)試條上的樣品添加部位，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下所示。

(i)：僅第1條測(cè)試線著色。

(ii)：僅第2條測(cè)試線著色。

(iii)：僅第3條測(cè)試線著色。

(iv)：第1、第2、第3條測(cè)試線分別著色。

(v)：沒有發(fā)現(xiàn)任何一條測(cè)試線著色。

根據(jù)上述結(jié)果，可以分別特異性的檢測(cè)目標(biāo)基因，確定可以同時(shí)檢測(cè)3種。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

<實(shí)施例10>

(1)合成插入人工核酸(偶氮苯)的引物

在本實(shí)施例中，使用導(dǎo)入了質(zhì)粒pUC19的大腸桿菌(E.coli DH5α)作為目標(biāo)。當(dāng)以pUC19作為模板時(shí)，設(shè)計(jì)了用于通過PCR擴(kuò)增擴(kuò)增約330堿基對(duì)的正向引物(F)和反向引物(R)。分別在上述引物的5’末端導(dǎo)入含有人工核酸即偶氮苯的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(X)和標(biāo)簽序列T37和T38，合成連接標(biāo)簽的引物T37-X-F和T38-X-R。這2種偶氮苯插入引物是委托筑波OLIGOSERVICE株式會(huì)社合成并購入的。下文示出本研究中制備的引物組。

標(biāo)簽序列T37：

5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列號(hào)103)

標(biāo)簽序列T38：

5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列號(hào)104)

引物F：5’-^Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)105)

引物R：5’-^Dd(TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)106)

引物T37-X-F：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號(hào)107)

引物T38-X-R：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號(hào)108)

(2)使用插入偶氮苯的引物的PCR反應(yīng)

選取導(dǎo)入了質(zhì)粒pUC19的大腸桿菌(E.coli DH5α)的菌落，與1ml水混和。使用在上述步驟(1)制備的引物組進(jìn)行PCR反應(yīng)。將各5pmol引物F和引物R、上述大腸桿菌的懸浮液1μl分別添加到0.2Ml PCR管中，根據(jù)ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產(chǎn))的說明書，配制25μl PCR反應(yīng)液。然后，將PCR管放入熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，在95℃熱處理5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)的95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循環(huán)，擴(kuò)增約330bp的目標(biāo)。此外，進(jìn)行不添加懸浮液的相同反應(yīng)，作為陰性對(duì)照。

(3)制備與金膠體結(jié)合的寡核苷酸探針

混合Gold Colloid(10nm、5.7×10¹²(顆粒數(shù)/ml)、British BioCellInternational公司生產(chǎn))和抗FITC抗體溶液(5mM磷酸緩沖液、pH7)，在室溫下靜置20分鐘。添加1/2量的1％BSA、0.1％PEG溶液，在10000rpm下離心分離25分鐘，去除上清液，加入1％BSA、0.1％PEG溶液，混和后，10000rpm下離心分離25分鐘。在離心后，添去除上清液，添加5mM磷酸緩沖液(pH7)。再次進(jìn)行該緩沖液置換。

將3’末端FITC修飾的寡核苷酸探針40(序列號(hào)109、序列號(hào)103的互補(bǔ)鏈)混合到配制的金膠體溶液中，均勻的添加到用玻璃纖維生產(chǎn)的墊片上之后，在真空干燥器中干燥，作為聯(lián)結(jié)墊。

寡核苷酸探針40：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-FITC-3’(序列號(hào)109)。

(4)將寡核苷酸探針固定在固相上

合成具有與序列號(hào)104互補(bǔ)的序列(序列號(hào)110)的3’末端生物素修飾的寡核苷酸探針41，與鏈霉親和素混合。使用分配器將該混合液涂抹在硝化纖維素膜(商品名：Hi-Flow 180、Millipore公司生產(chǎn))的線上，在40℃風(fēng)干30分鐘。

寡核苷酸探針41：5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列號(hào)110)。

(5)制備核酸色譜型測(cè)試條

如圖6所示，將如上所述制備的由硝化纖維素膜構(gòu)成的色譜介質(zhì)、聯(lián)結(jié)墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標(biāo)志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測(cè)使用了插入偶氮苯的引物組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)試條。

(6)用測(cè)試條檢測(cè)PCR產(chǎn)物

在不變性通過步驟(2)制備的PCR產(chǎn)物的條件下，將所述產(chǎn)物直接上樣至由步驟(5)制備的測(cè)試條上的樣品添加部位中，通過色譜進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)在步驟(2)中添加大腸桿菌作為檢查材料時(shí)，結(jié)果是在測(cè)試線上檢測(cè)到目標(biāo)核酸特異性著色線。另一方面，當(dāng)不添加大腸桿菌作為陰性對(duì)照時(shí)，沒有檢測(cè)到線。此外，用色譜檢測(cè)所需要的時(shí)間是10-15分鐘的短時(shí)間。

符號(hào)說明

1.引物區(qū)域

2.標(biāo)簽區(qū)域

3.聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(間隔區(qū)區(qū)域)

4.第1引物(聯(lián)合引物)的引物區(qū)域

5.第1引物(聯(lián)合引物)的共同區(qū)域

6.第2引物的共同區(qū)域

7.第2引物的標(biāo)簽區(qū)域

8.第2引物的聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)域(間隔區(qū)區(qū)域)

9.目標(biāo)核酸序列

10.正向引物

11.正向引物的引物區(qū)域

12.正向引物的標(biāo)簽區(qū)域

13.反向引物

14.反向引物的引物區(qū)域

15.反向引物的標(biāo)簽區(qū)域

16.具有部分雙鏈核酸結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物

17.目標(biāo)核酸序列

18.正向第1引物

19.正向第1引物的引物區(qū)域

20.正向第1引物的標(biāo)簽區(qū)域

21.反向第1引物

22.反向第1引物的引物區(qū)域

23.反向第1引物的標(biāo)簽區(qū)域

24.根據(jù)第1引物的雙鏈PCR產(chǎn)物

25.正向第2引物

26.正向第2引物的引物區(qū)域

27.正向第2引物的標(biāo)簽區(qū)域

28.反向第2引物

29.反向第2引物的引物區(qū)域

30.反向第2引物的標(biāo)簽區(qū)域

31.具有部分雙鏈核酸結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物

32.樣品墊

33.聯(lián)結(jié)墊

34.保持有用于捕捉的寡核苷酸的擔(dān)載體

35.吸收墊

36.基體材料

37.測(cè)試線

38.控制線

39.用于結(jié)合標(biāo)記分子的寡核苷酸

40.標(biāo)記分子

41.PCR產(chǎn)物-標(biāo)記分子復(fù)合物

42.多孔膜

43.用于捕獲的寡核苷酸

44.在各孔中保持有用于捕獲的寡核苷酸的擔(dān)載體(微陣列)

45.保持有用于捕獲的寡核苷酸的珠狀載體