本發(fā)明屬于食品微生物鑒定與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生鮮果蔬草莓中沙門氏菌、的DNA提取及微滴數(shù)字PCR快速定量篩查方法。

背景技術(shù)：

即食生鮮蔬菜和水果是食源性致病菌傳播的主要載體之一。目前，質(zhì)檢總局將食品安全的風(fēng)險監(jiān)測列入了民生民計的重大解決問題，影響食品安全的因素有很多，而其中由微生物危害導(dǎo)致的食品安全問題達到了總量的40％^[1-2]。當(dāng)前中國在食源性病原菌微生物方面面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，急需對潛在危害做出合理的風(fēng)險評估，化被動為主動將危害控制在可接受水平^[3]。而目前微生物定量監(jiān)測的技術(shù)手段主要為傳統(tǒng)培養(yǎng)法，費時費力，輔助的實時熒光定量PCR方法，雖在時間上有了很大突破，但其定量結(jié)果的準(zhǔn)確性要依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建的準(zhǔn)確性和引物的擴增效率，而微滴數(shù)字PCR技術(shù)在食源性病原菌上的應(yīng)用，彌補了這一缺陷。

微滴數(shù)字PCR技術(shù)作為第三代PCR技術(shù)，是在傳統(tǒng)PCR方法基礎(chǔ)上采用一種全新的方式進行核酸分子的定量，與實時熒光定量PCR相比，無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，不受擴增效率的影響，其結(jié)果具有更高的精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度。微滴數(shù)字PCR的核心是能夠?qū)⒁环輼悠贩殖?0,000個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子，且每個微滴都作為一個獨立的PCR反應(yīng)器。經(jīng)PCR擴增后，采用微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，以絕對定量的方式直接“數(shù)”出靶分子的個數(shù)^[4]。

沙門氏菌是腸道桿菌中最重要的病原菌，人的沙門氏菌感染和帶菌非常普遍。食用生前感染的動物或食品受到污染，均可使人發(fā)生食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒常占首位或第二位。傳統(tǒng)培養(yǎng)法是目前常用檢測方法，但其檢測沙門氏菌的檢驗程序復(fù)雜繁瑣、耗時費力，全過程需至少4～7d，才能得出明確的診斷結(jié)果。因而，建立一種準(zhǔn)確快速的檢測沙門氏菌的方法一直是研究的熱點^[5]，而微滴數(shù)字PCR的應(yīng)用解決了這一難題，并填補了微滴數(shù)字PCR技術(shù)在食源性病原菌檢測上的空白。

研究表明，沙門氏菌的侵襲蛋白(invasion protein，inv)決定細菌進入宿主上皮細胞的能力，與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門氏菌的主要毒力因子，因此在前人研究的基礎(chǔ)上根據(jù)invA毒力基因序列合成特異性引物和TaqMan探針，通過特異性、靈敏度等試驗的優(yōu)化摸索，建立微滴數(shù)字PCR沙門氏菌快速定量檢測方法，以其克服傳統(tǒng)致病微生物檢測方法的諸多不便，并與傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)方法進行比較，為食源性病原菌檢測開辟了新的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于在大樣本定量篩查生鮮草莓中的沙門氏菌時能夠快速、簡便的得到篩查結(jié)果，在第一時間控制食源性致病菌的蔓延，為食品安全突發(fā)事件爭取有效的時間。本發(fā)明的快速篩查方法具有高效、快速、精準(zhǔn)、操作簡便等優(yōu)勢。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：

一種基于微滴數(shù)字PCR方法快速定量篩查草莓中沙門氏菌的方法，其特征在于它按如下步驟進行：

(1)參照國標(biāo)GB4789方法稱取草莓樣品25g，加入225mL0.85％滅菌生理鹽水，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液100mL，利用滅菌的集菌器，將100mL 1:10的稀釋液富集于孔徑為0.45μm的集菌膜上，通過Chelex-100法提取集菌膜中草莓細菌DNA；

(3)采用微滴數(shù)字PCR擴增引物及探針引物，對沙門氏菌的DNA進行擴增；

其中的微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系為20μL，各成分含量為：2×ddPCR Supermix for probes預(yù)混液10μL，上下游引物各1.6μL，探針引物0.4μL，模板2μL，無菌超純水補足20μL，混勻后離心。將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μL，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μL生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在PCR儀上開始循環(huán)，PCR儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s，循環(huán)參數(shù)為：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。

本發(fā)明所述的快速定量篩查方法，Chelex-100法提取集菌膜中草莓細菌DNA，其中Chelex-100溶液濃度為13％。

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的快速篩查方法，下面以生鮮果蔬草莓為樣本實例，對本發(fā)明的快速篩查方法加以說明。

一、材料和引物

(1)樣品：草莓樣品，由農(nóng)貿(mào)市場購置。

(2)主要儀器：高速冷凍離心機，微滴數(shù)字PCR儀，恒溫水浴鍋。

(3)主要試劑：

PCR引物、探針由上海生工公司合成，引物序列見表1。

2×ddPCR Supermix for probes預(yù)混液，試劑購自伯樂公司。

表1沙門氏菌鑒定定量PCR引物序列

二、生鮮果蔬草莓中細菌DNA提取

(1)參照國標(biāo)GB4789方法稱取草莓樣品25g，加入225mL0.85％滅菌生理鹽水，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液100mL，利用滅菌的集菌器，將100mL 1:10的稀釋液富集于孔徑為0.45μm的集菌膜上；

(3)通過Chelex-100法提取集菌膜中草莓細菌DNA。

三、草莓中沙門氏菌DNA的微滴數(shù)字PCR定量篩查試驗：

1、PCR反應(yīng)體系組成：

2×ddPCR Supermix for probes預(yù)混液10μL，上下游引物各1.6μL，探針引物0.4μL，模板2μL，無菌超純水補足20μL，混勻后離心。

2、微滴生成：

將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μL，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μL生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在PCR儀擴增，PCR儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s。

3、PCR反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個擴增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字PCR擴增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，推算草莓樣品沙門氏菌濃度，結(jié)果見附圖1。擴增結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果基本一致。

本發(fā)明具有的積極效果在于：

(1)采用微滴數(shù)字PCR終點定量方法，有效的克服了因傳統(tǒng)方法費時、費力、繁瑣、且檢測周期過長，難以滿足應(yīng)急預(yù)案處理的需要。

(2)本方法最大的優(yōu)點在于其過程快速，簡便，精準(zhǔn)，充分提高了生鮮果蔬草莓中沙門氏菌鑒定的檢測效率。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定過程需要將近1周的時間相比，采用本方法，4小時即可完成樣本篩查的全過程。

(3)采用本發(fā)明方法對草莓樣品進行定量篩查，一次性可篩查的樣本量相比傳統(tǒng)培養(yǎng)法可大大提高。

附圖說明:

圖1為草莓樣品中沙門氏菌微滴數(shù)字PCR擴增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽性對照；空白對照；草莓樣品；

圖2為奶油草莓樣品中沙門氏菌微滴數(shù)字PCR擴增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽性對照；空白對照；奶油草莓樣品；

圖3為查理草莓樣品中沙門氏菌微滴數(shù)字PCR擴增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽性對照；空白對照；查理草莓樣品；

具體實施方式

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。

實施例1

以奶油草莓為樣本，采用本發(fā)明方法快速定量篩查沙門氏菌。制備方法如下：

(1)稱取黃瓜樣品25g，按照國標(biāo)GB 4789各致病菌檢測方法進行選擇性增菌；

(2)吸取選擇性增菌后的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和單增李斯特氏菌的增菌液各1mL于2mL離心管中，13200rpm離心10min，棄上清；沉淀溶于100μL去離子水中，封口膜封好，沸水浴10min；取出后迅速冷凍于-20℃冰箱中10min；去掉封口膜，13200rpm離心3min，上清即為DNA。

實時熒光PCR檢測：

1、對四種食源性致病菌進行實時熒光PCR擴增，引物序列為：

SM-F：5’-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3’

SM-R：5’-AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3’

SM-P：5’-FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMRA-3’

2、反應(yīng)體系：

2×ddPCR Supermix for probes預(yù)混液10μL，上下游引物各1.6μL，探針引物0.4μL，模板2μL，無菌超純水補足20μL，混勻后離心。

3、反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個擴增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字PCR擴增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，推算奶油草莓樣品中沙門氏菌濃度，結(jié)果見附圖2。

實施例2

以查理草莓為樣本，采用本發(fā)明方法快速定量篩查沙門氏菌。制備方法如下：

(1)稱取黃瓜樣品25g，按照國標(biāo)GB 4789各致病菌檢測方法進行選擇性增菌；

(2)吸取選擇性增菌后的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和單增李斯特氏菌的增菌液各1mL于2mL離心管中，13200rpm離心10min，棄上清；沉淀溶于100μL去離子水中，封口膜封好，沸水浴10min；取出后迅速冷凍于-20℃冰箱中10min；去掉封口膜，13200rpm離心3min，上清即為DNA。

實時熒光PCR檢測：

1、對四種食源性致病菌進行實時熒光PCR擴增，引物序列為：

SM-F：5’-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3’

SM-R：5’-AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3’

SM-P：5’-FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMRA-3’

2、反應(yīng)體系：

2×ddPCR Supermix for probes預(yù)混液10μL，上下游引物各1.6μL，探針引物0.4μL，模板2μL，無菌超純水補足20μL，混勻后離心。

3、反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個擴增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字PCR擴增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，推算查理草莓樣品中沙門氏菌濃度，結(jié)果見附圖3。