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一種基于微滴數(shù)字PCR方法快速定量篩查草莓中沙門氏菌的方法與流程

文檔序號:12457517閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.用于鑒定沙門氏菌的PCR擴增引物及探針引物,其特征在于,包括沙門氏菌引物正向序列:5′-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3′,反向序列:5′-AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3′,探針序列:5′-FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMRA-3′。

2.一種基于微滴數(shù)字PCR方法快速定量篩查草莓中沙門氏菌的方法,其特征在于它按如下步驟進行:

(1)參照國標(biāo)GB4789方法稱取草莓樣品25g,加入225mL0.85%滅菌生理鹽水,制成1:10的稀釋液,用均質(zhì)器充分均質(zhì);

(2)取1:10的稀釋液100mL,利用滅菌的集菌器,將100mL 1:10的稀釋液富集于孔徑為0.45μm的集菌膜上,通過Chelex-100法提取集菌膜中草莓細(xì)菌DNA;

(3)采用微滴數(shù)字PCR擴增引物及探針引物,對沙門氏菌的DNA進行擴增;

其中的微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系為20μL,各成分含量為:2×ddPCR Supermix for probes預(yù)混液Mix預(yù)混液10μL,上下游引物各1.6μL,探針引物0.4μL,模板2μL,無菌超純水補足20μL,混勻后離心。將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器,切忌產(chǎn)生氣泡,同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μL,蓋上墊片,放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μL生成的微滴,小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR96孔反應(yīng)板中,170℃熱封后在PCR儀上開始循環(huán),PCR儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s,循環(huán)參數(shù)為:95℃,10min;40cycles(94℃,30s,60℃,1min);98℃,10min。

3.權(quán)利要求2所述的Chelex-100法提取集菌膜中草莓細(xì)菌DNA,其中Chelex-100溶液濃度為13%。

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