本發(fā)明涉及浮游藻類生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于計(jì)數(shù)框的浮游藻類定量方法。

背景技術(shù)：

隨著城市和工業(yè)的快速發(fā)展，農(nóng)業(yè)化肥和含磷洗滌劑的大量使用，不合理的開墾、放牧造成大面積的土壤侵蝕和退化，使得地表徑流中營養(yǎng)物質(zhì)含量大為提高，大量未經(jīng)處理的城市生活污水和工農(nóng)業(yè)用水流入湖泊和江河，水體氮、磷營養(yǎng)鹽不斷積累，水體富營養(yǎng)化進(jìn)程被大大加速。浮游藻類的大量繁殖是水體富營養(yǎng)化的重要表征，在水體富營養(yǎng)化控制研究領(lǐng)域，浮游藻類的群落特征和演替規(guī)律既是研究對(duì)象，也是評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一。目前，關(guān)于浮游藻類的群落調(diào)查研究主要分原位監(jiān)測(cè)和取樣實(shí)驗(yàn)室鏡檢兩種。前者采用流式細(xì)胞儀等現(xiàn)場實(shí)時(shí)進(jìn)行，所需儀器花費(fèi)昂貴，同時(shí)針對(duì)復(fù)雜多樣的藻類類群，需要事先建立龐大的數(shù)據(jù)庫。因此絕大多數(shù)的藻類調(diào)查依然采用的是實(shí)驗(yàn)室鏡檢方法，為了使調(diào)查結(jié)果具有代表性，且盡可能的接近真實(shí)狀態(tài)，除了隨機(jī)采樣、規(guī)范前處理如沉淀濃縮等操作以外，浮游藻類的顯微鏡定量方法尤為重要。

目前在對(duì)浮游藻類進(jìn)行鏡檢時(shí)一般采用的是0.1ml計(jì)數(shù)框(規(guī)格：20mm×20mm；計(jì)數(shù)框橫、縱方向劃線分為等量的10行×10列)。定量方法主要有三種：①計(jì)數(shù)框行格法，對(duì)計(jì)數(shù)框上第二、五、八行三行共30個(gè)小格進(jìn)行計(jì)數(shù)；②目鏡視野法，利用顯微鏡的目鏡視野在計(jì)數(shù)框上均勻選取計(jì)數(shù)的面積，需先用測(cè)微尺量得一定放大倍數(shù)下[一般為400倍：40(目鏡)×10(物鏡)]的視野直徑，然后用圓面積計(jì)算公式(πr²)求得單個(gè)視野面積，一般計(jì)數(shù)100-500個(gè)視野；③目鏡行格法，是在目鏡上利用兩條玻璃絲形成平行的橫行(一般寬度100-150μm)，只計(jì)數(shù)兩橫行之間出現(xiàn)的藻類，或者利用目微尺上的刻度來限定計(jì)數(shù)區(qū)域，通過連續(xù)移動(dòng)顯微鏡托物平臺(tái)來完成計(jì)數(shù)。方法①工作量大，同一行內(nèi)往復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)重復(fù)計(jì)數(shù)的概率較高，現(xiàn)已較少用；方法②可避免重復(fù)計(jì)數(shù)，但選取視野時(shí)容易受人為主觀傾向影響()，選擇視野的隨機(jī)性不夠，而且工作量大；方法③是綜合①②兩種方法而來，大大降低了工作量和人為主觀性，但操作上較為復(fù)雜，首先，光學(xué)顯微鏡作為精密儀器，在其目鏡上人為添加玻璃絲難度極大，其次，在連續(xù)移動(dòng)托物平臺(tái)時(shí)，判斷和保持目鏡玻璃絲或是目微尺處于與托物平臺(tái)移動(dòng)方向垂直的水平位置，也有較大難度，如若不垂直，則計(jì)算計(jì)數(shù)面積時(shí)就會(huì)產(chǎn)生誤差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種基于計(jì)數(shù)框的浮游藻類定量方法(即視野行格法)，該方法包括如下步驟：

將顯微鏡的視野調(diào)至計(jì)數(shù)框的左或右豎直邊框，使左或右豎直邊框位于視野的中間，橫向緩慢移動(dòng)顯微鏡托物臺(tái)，并計(jì)數(shù)視野掃過的范圍內(nèi)所有藻類，直到抵達(dá)計(jì)數(shù)框的另一豎直邊框；

根據(jù)公式N＝20n/XD計(jì)算計(jì)數(shù)框所承載的水樣中藻類總數(shù)量；

其中：N為0.1ml水樣中的藻類數(shù)量，X為計(jì)數(shù)的行數(shù)，D為視野的直徑，n為X行的總計(jì)數(shù)；

其中的“行”是行進(jìn)過程中視野上下邊緣形成的兩條虛擬邊線之間的“行”；所述“行”的長度即為視野從計(jì)數(shù)框一邊行進(jìn)至另一邊的距離，也即計(jì)數(shù)框的邊框長20mm；

其中所述“行”的寬度為視野直徑D，每一行的面積為20D；

計(jì)數(shù)的行數(shù)根據(jù)藻類的多少來確定，一般為3-5行。

本發(fā)明所提供的視野行格法需先測(cè)定一定放大倍數(shù)下，顯微鏡的視野直徑(以上海光學(xué)儀器一廠的普通生物顯微鏡XSP-2CA型為例，400倍放大倍數(shù)下，視野直徑D為0.45-0.475mm)；

本發(fā)明的基于計(jì)數(shù)框的浮游藻類定量方法——視野行格法，相比現(xiàn)有的基于計(jì)數(shù)框的其他定量方法具有以下優(yōu)勢(shì)：

(1)工作量小，本發(fā)明能將一個(gè)樣品的計(jì)數(shù)時(shí)間控制在30分鐘以內(nèi)(使用計(jì)數(shù)框?qū)Ω∮卧孱愡M(jìn)行定量時(shí)，若計(jì)數(shù)時(shí)間過長，隨著計(jì)數(shù)框內(nèi)的水樣自然蒸發(fā)，空氣會(huì)以氣泡的形式滲入到蓋玻片與計(jì)數(shù)框之間，對(duì)剩余的水樣形成擠壓，從而移動(dòng)水樣中的藻類在計(jì)數(shù)框內(nèi)的位置，進(jìn)而造成計(jì)數(shù)結(jié)果不可用，因此必須盡可能的減少計(jì)數(shù)所花費(fèi)的時(shí)間)；

(2)消除了目鏡視野法中視野選擇的主觀性(采用目鏡視野法時(shí)，具體操作過程中，人的主觀傾向于選擇有藻類出現(xiàn)的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，導(dǎo)致結(jié)果比實(shí)際偏高，此法適用于單種藻類的純培養(yǎng)計(jì)數(shù))

(3)操作簡單，因?yàn)椴恍枰谀跨R上作任何操作，也不需要借助目微尺來界定每一行，而是利用行進(jìn)中的視野自身來界定上下邊線，避免了復(fù)雜的操作。

附圖說明

圖1計(jì)數(shù)框

圖2視野行格法運(yùn)行圖

其中：1、計(jì)數(shù)框邊框線；2、計(jì)數(shù)框行格線；3、視野；4、視野橫向運(yùn)行虛擬邊線

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做一詳述，但本發(fā)明并不限于此。

本發(fā)明所提供的視野行格法是基于計(jì)數(shù)框的一種浮游藻類定量方法。

實(shí)施例1

水樣采自江西鄱陽湖(2014年8月)，1L水樣經(jīng)魯哥式液染色固定后，在玻璃沉降柱中重力沉降48h，上清液用虹吸導(dǎo)管排出，用100mL廣口塑料瓶收集沉降柱底部藻類濃縮液，并定容至50mL。

(1)測(cè)定400倍放大倍數(shù)[40(目鏡)×10(物鏡)]下顯微鏡視野3的直徑D(本例中使用上海光學(xué)儀器一廠的普通生物顯微鏡XSP-2CA型，400倍放大倍數(shù)下，視野直徑D為0.45mm)；

(2)上下?lián)u動(dòng)裝有50mL水樣的100mL塑料瓶5-10次，移液器吸取其中0.1ml待測(cè)水樣放置在計(jì)數(shù)框中，蓋上蓋玻片，靜止數(shù)分鐘后置于顯微鏡托物臺(tái)；

(3)400倍放大倍數(shù)下對(duì)焦，將視3調(diào)至計(jì)數(shù)框右側(cè)邊框線1的中段[計(jì)數(shù)框行格線2的第五行格]，使邊框線位于視野的豎直中線處，橫向緩慢移動(dòng)托物臺(tái)時(shí)開始計(jì)數(shù)(借助計(jì)數(shù)器手動(dòng)計(jì)數(shù))，直至抵達(dá)計(jì)數(shù)框的左邊框線為止，計(jì)數(shù)視野掃過的區(qū)域[視野行進(jìn)過程中形成的虛擬邊線4與計(jì)數(shù)框縱向邊框線(1)所包圍的長方形區(qū)域]內(nèi)所有不同種類的藻類數(shù)量；

(4)縱向移動(dòng)托物臺(tái)，使視野位于計(jì)數(shù)框縱向邊框線1的下部中段(計(jì)數(shù)框第八行)，與上一步驟反向橫向移動(dòng)視野，計(jì)數(shù)整個(gè)視野行的藻類數(shù)量，合計(jì)2個(gè)視野行的藻類總數(shù)為473個(gè)(總計(jì)出現(xiàn)23個(gè)種類)；

(5)以公式N＝20n/XD來計(jì)算所測(cè)0.1mL中的藻類總數(shù)N(X為計(jì)數(shù)的行數(shù)，D為視野的直徑，n為X行的總計(jì)數(shù))

N＝20n/XD＝(20×473)/(2×0.45)≈1.05*10⁴

則1L原水樣中的藻類總數(shù)N′為5.25*10⁶[N′＝(50/0.1)×N，50為1L水濃縮后定容的體積，0.1為加入計(jì)數(shù)框的濃縮水樣的體積]；

同一水樣，自第(2)步驟開始至第(5)步驟，重復(fù)計(jì)數(shù)操作的結(jié)果為436個(gè)(20個(gè)種類)，兩次重復(fù)計(jì)數(shù)藻類數(shù)量與平均值相差4.2％、種類數(shù)相差7.5％，結(jié)果可信。(兩次重復(fù)計(jì)數(shù)的結(jié)果與平均值之間的差值應(yīng)小于15％時(shí)，否則需重新取樣計(jì)數(shù)?！兜∮紊镅芯糠椒ā?，科學(xué)出版社)

實(shí)施例2

水樣采自上海市奉賢區(qū)稻田田面水(2016年6月)，1L水樣經(jīng)魯哥式液染色固定后，在玻璃沉降柱中重力沉降48h，上清液用虹吸導(dǎo)管排出，100mL廣口塑料瓶收集沉降柱底部濃縮液，并定容至30mL。

(1)測(cè)定400倍放大倍數(shù)下顯微鏡視野3的直徑D為0.45mm；

(2)上下?lián)u動(dòng)裝有30mL水樣的100mL塑料瓶5-10次，移液器吸取其中0.1ml待測(cè)水樣放置在計(jì)數(shù)框中，蓋上蓋玻片，靜止數(shù)分鐘后置于顯微鏡托物臺(tái)；

(3)400倍放大倍數(shù)下對(duì)焦，將視野3調(diào)至計(jì)數(shù)框右側(cè)邊框線1的中段[計(jì)數(shù)框行格線2的第六行格]，使邊框線位于視野的豎直中線處，橫向慢慢移動(dòng)托物臺(tái)時(shí)開始計(jì)數(shù)，直至抵達(dá)計(jì)數(shù)框的左邊框線為止，計(jì)數(shù)視野掃過的區(qū)域內(nèi)所有不同藻類的數(shù)量；

(4)縱向移動(dòng)托物臺(tái)，使視野先后位于計(jì)數(shù)框縱向邊框線1的中上部(計(jì)數(shù)框第二、四行)和下部(計(jì)數(shù)框第八行)，橫向移動(dòng)托物臺(tái)，分別計(jì)數(shù)4個(gè)視野行內(nèi)的藻類數(shù)量，合計(jì)4個(gè)視野行的藻類總數(shù)為152個(gè)(總計(jì)出現(xiàn)9個(gè)種類)；

(5)計(jì)算0.1mL藻類濃縮液中的藻類總數(shù)

N＝20n/XD＝(20×152)/(4×0.45)≈1.69*10³，

則1L原水樣中的藻類總數(shù)N′為5.07*10⁵[N′＝(30/0.1)×N，30為1L水樣濃縮后定容的體積，0.1為加入計(jì)數(shù)框的濃縮水樣的體積]；

同一水樣，自第(2)步驟開始至第(5)步驟，重復(fù)計(jì)數(shù)結(jié)果為179個(gè)(11個(gè)種類)，兩次重復(fù)計(jì)數(shù)藻類數(shù)量相差8.2％、種類數(shù)相差10％，結(jié)果可信。