本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的多重PCR檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

沙門菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的人獸共患病之一，其病原沙門菌屬于腸桿菌科，蛋、家畜和肉制品是主要傳播媒介，它不但可引起多種畜禽疾病，造成全身性敗血癥和腸炎，還可以作為食源性疾病的病原體，引起人類胃腸炎和食物中毒。在我國，細(xì)菌性食物中毒中，約有70％～80％是由沙門菌引起的。目前，根據(jù)Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，依據(jù)沙門菌菌體抗原及鞭毛抗原的不同，沙門菌目前的血清型有2600種以上，中國已報(bào)道了292種不同的血清型，分屬于35個(gè)O群。

傳統(tǒng)的檢測方法即非選擇性和選擇性增菌、生化特性及血清學(xué)鑒定很費(fèi)力、耗時(shí)，需4-7天才能完成，其它如抗體檢測法，雖然快速，但其高假陽性使之不適于常規(guī)檢測。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后導(dǎo)致沙門菌的“致傷”及食品其它成分的干擾等因素，使得沙門菌的檢測受到一些限制。因此，急需一些快速、特異、敏感的檢測方法，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)致病菌，控制污染及其可能對人體健康產(chǎn)生的危害。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒定腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的多重PCR檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種快速鑒定腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的多重PCR檢測試劑盒，所述試劑盒中包括tcpS基因檢測引物、lygD基因檢測引物和flhBinner基因檢測引物。

優(yōu)選地，所述tcpS基因檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

優(yōu)選地，所述lygD基因檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

優(yōu)選地，所述flhBinner基因檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物。

本發(fā)明的試劑盒采用多重PCR檢測技術(shù)進(jìn)行tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因檢測，根據(jù)擴(kuò)增及檢測情況可分析判斷檢測對象是否屬于腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌之一。因此，引物的設(shè)計(jì)是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵。

基于本發(fā)明所述試劑盒是采用PCR技術(shù)來進(jìn)行檢測的，所以試劑盒中還可以包括其他一些PCR所需要的常規(guī)試劑，如：無菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、樣品基因組DNA提取試劑等常用PCR反應(yīng)試劑中的一種或多種。由于此類PCR常用試劑均可經(jīng)市場途徑單獨(dú)購得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)客戶實(shí)際需要配置，為方便起見，也可全部裝配入試劑盒。

本發(fā)明的試劑盒，可以是含有獨(dú)立包裝的引物對，也可以是含有配置好的含有引物對的PCR檢測液。

所述PCR檢測液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR檢測液加入引物獲得。例如，所述試劑盒中還可以含有無菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本發(fā)明的引物、待檢樣本DNA提取物或者樣本菌液即可獲得PCR反應(yīng)體系。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還可含有陽性對照。所述陽性對照為含有tcpS基因、lygD基因或flhBinner基因表達(dá)的DNA樣本。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還可含有陰性對照。陰性對照可為無tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因表達(dá)的DNA樣本。

本發(fā)明的第二方面，提供了前述多重PCR檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

(1)提取樣品基因組DNA；

(2)加樣：將樣品基因組DNA、陽性對照或陰性對照分別加入裝有PCR反應(yīng)體系的PCR管中，獲得對應(yīng)的樣品反應(yīng)管、陽性反應(yīng)管或陰性反應(yīng)管，所述PCR反應(yīng)體系中含有前述tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因檢測引物；

(3)PCR反應(yīng)：反應(yīng)管置于PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行PCR反應(yīng)；

(4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，分析結(jié)果。

優(yōu)選地，所述方法為非疾病診斷目的的方法。

步驟(1)中，提取樣品基因組DNA為現(xiàn)有技術(shù)。

優(yōu)選地，步驟(3)中，PCR反應(yīng)的條件設(shè)置為：(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)55℃45s；(d)72℃40s，步驟(b)～(d)循環(huán)30次，(e)72℃10min。

本發(fā)明的第三方面，提供了前述試劑盒在制備tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因檢測產(chǎn)品中的用途。

優(yōu)選地，所述檢測產(chǎn)品用于分別檢測和篩選腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明通過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)tcpS基因僅存在于腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林這三種血清型沙門菌中，lygD基因僅存在于腸炎沙門菌中，而雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB基因相較于其它血清型沙門菌flhB缺少中間的核苷酸片段，因而，以三對特異性引物通過PCR技術(shù)驗(yàn)證了tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因在不同血清型沙門菌及其它細(xì)菌中的分布。本發(fā)明的試劑盒能快速高通量分別鑒定腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林血清型沙門菌，可作為沙門菌傳統(tǒng)血清學(xué)分型的輔助方法，并為這三種特定血清型沙門菌的監(jiān)測與實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一種簡單快速、重復(fù)性好的新方法。

附圖說明

圖1：為利用tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因區(qū)分腸炎沙門菌、雞白痢和雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的示意圖；其中，tcpS基因僅存在于腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林這三種血清型沙門菌中，lygD基因僅存在于腸炎沙門菌中，而雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB基因相較于其它血清型沙門菌flhB缺少中間的核苷酸片段(flhBinner)，即雞白痢/雞傷寒沙門菌不能擴(kuò)增出flhBinner片段。

圖2：為多重PCR鑒定tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段在不同血清型沙門菌和其它細(xì)菌中的分布和片段大小圖片；其中，泳道M為：DL2000Marker；泳道C50041和C50336：tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)；泳道S06004、9855和SG9：tcpS基因；泳道SL5928：tcpS基因、flhBinner片段；C50041和C50336為腸炎沙門菌，S06004和6508為雞白痢沙門菌，SG9為雞傷寒沙門菌，SL5928為都柏林沙門菌，T3為烏干達(dá)沙門菌，T9為火雞沙門菌，T8為鴨沙門菌，G2為倫敦沙門菌，ZX為羅森沙門菌，Y7為德爾卑沙門菌，Y8為鼠傷寒沙門菌，C500為豬霍亂沙門菌；H37Rv為結(jié)核分枝桿菌，11168和110為空腸彎曲菌，S19為布魯氏菌，EGDe和JS15為李斯特菌，1314和1352為大腸桿菌。

圖3：為鑒定腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林沙門菌的多重PCR檢測試劑盒靈敏度；其中，泳道M為：DL2000Marker；泳道1、4、7、10、13、16為腸炎沙門菌C50041基因組，泳道2、5、8、11、14、17為雞白痢沙門菌S06004基因組，泳道3、6、9、12、15、18為都柏林SL5928基因組；泳道1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18基因組濃度依次為58.5ng/μl、5.85ng/μl、585pg/μl、58.5pg/μl、5.85pg/μl、585fg/μl。

圖4：為PCR鑒定1～24株豬場分離的沙門菌樣品中的腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌；其中，泳道M為：DL2000Marker；泳道1～24為豬場分離的沙門菌；可擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三條目的條帶的泳道為腸炎沙門菌。

圖5：為PCR鑒定1～24株雞場分離的沙門菌樣品中的腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌；其中，泳道M為：DL2000Marker；泳道1～24為雞場分離的沙門菌；可擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三條目的條帶的泳道為腸炎沙門菌，僅擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)的泳道為雞白痢沙門菌。

圖6：為PCR鑒定1～11株牛場分離的沙門菌樣品中的腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌；其中，泳道M為：DL2000Marker；泳道1～11為牛場分離的沙門菌；可擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)、flhBinner片段(155bp)兩條目的條帶的泳道為都柏林沙門菌。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1生物信息學(xué)方法鑒定tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因的分布

在NCBI中使用Blastn在線比對軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因，搜索結(jié)果表明tcpS基因僅存在于腸炎沙門菌、雞白痢和雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌中，lygD基因僅存在于腸炎沙門菌中，而雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB基因相較于其它血清型沙門菌flhB缺少中間的核苷酸片段，即雞白痢和雞傷寒沙門菌中沒有flhB中間片段flhBinner，根據(jù)這三個(gè)基因的分布特點(diǎn)可將這三種血清型沙門菌區(qū)分開(圖1)。

實(shí)施例2試劑盒的制備

引物設(shè)計(jì)與合成：分別以tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)并分析引物，并根據(jù)基因組DNA序列情況，從中選擇最佳檢測用引物對，其中，tcpS引物擴(kuò)增其全長序列(882bp)，lygD引物擴(kuò)增部分序列(339bp)，flhBinner引物擴(kuò)增非雞白痢和雞傷寒沙門菌的flhBinner片段，其核苷酸序列如下表1所示：

表1

所述tcpS引物能夠擴(kuò)增出的tcpS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具體為：

ATGTCTATAAGCACCACAATGTCAAATATCAACAGAATACAAAAAGACATTGCTAGTCTACAAAAACAACTTTCTGATGAGCAGCGTAAAGAGGCCCAACTTTCAGGAAAAATCAATCAAATAAAGCGTAGCGTCACTAAGTCAACGTCTTTAAGCACATTGAATTCCAAAATGTCAGAGATCTCTCGTCATAAAAATGATATTTCAAGATGTAACTCTAAAAAAGCAGATATTAATAAAAAAATAACAGCAAAAACTGGAGACTTACACCGTTATCAATTACAACTCATTAAAGAGCAAGAGAATGACCAGAAAAAAAGAATTGCTGCACAGAAGAAACTTGAAAAAGAACAATTAGATTACCAGAAGAAAATCACACGAGAATTGAAATCGCAGAAAAGGGCAATATCTCCAAGCCATAAATTCAATCGTCCAGTCATCAACAAATCTGATGAGACAGAAGATATTACAGAGAGTTATGATGTTTTTATCTCTCATGCAACAGAAGATAAAGATAGTTTTGTCCGTCCCCTTGCTGAGTTGTTAAGAGCAAAAGGGATAAATGTATGGTATGACGAATTCTCTTTAGGCTGGGGTAAAAGTCTACGTAAGACAATCGATTATGGATTAGCAAATTCTCGGTTTGGAGTTGTTGTTTTATCTAAATCCTTTATCAAAAAGGACTGGACAGAGTATGAATTAAATGGTTTGACTGCTAGAGAGATGAGCGGTGAAAACCAAGTAATACTGCCTATCTGGCACGAAGTATCTAAATCTGATATTTTAAAATTCAGCCCTACACTAGTAGATAAAATGGCATTAAATACATCGATAAATACCATTGATGAAATTGCTGAACAGCTTGAATCATTATTGAAATGA。

所述lygD引物夠擴(kuò)增出的lygD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具體為：

TCACTGATTTTTTAGGCGCTTTTGTGCAGCGAGCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTATATAGCTCATTCTGACCTTTAAGCCGGTCAATGAGTTTTTCTTTCTCAGATTCAGGGAGTATATCAAAAAGGTTTAGTAAATCAGCCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCACCACCTTCGAAGTTGTCATCGTAAGTACCAGAAGAACGAACGTAGTTCATTAGATCGGCCAAATCCGGTCGTAACTCTTCGGGTTTAACTCTCAATAGAACAGAAAATTTTAAGGCCGCATCAGTGTTGAGAGGTGCCTTACCGTTCAAATAGTGACTGACGGTAGATTGTGTCTCAAAGCCCATAAGATCAGCGGCGATCTCCTGAGTAAGTTTGAGGTCTCGCTTTTTGGCGTCCCAGATGGCGCGTAAGCGCTGGGTAGCTTCTGGTGGAGCTATTTCTTCACGTTTTTTTCTCAT。

所述flhBinner引物夠擴(kuò)增出的flhBinner基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具體為：

GCAGCGCCGCATGATGGAAGATGTGCCGAAAGCGGACGTCATTGTCACTAACCCGACGCACTATTCCGTGGCGCTGCAGTATGACGAAAACAAAATGAGCGCGCCGAAAGTGGTCGCGAAGGGGGCTGGATTAATAGCGCTGCGCATTCGCGAGATCGGCGCTGAACATCGGGTTCCCACTTTAGAAGCGCCGCCGC。

上述各引物對可單獨(dú)包裝，也可以配成PCR檢測液。所述PCR檢測液中，上述引物在多重PCR最終體系中的濃度為80nM。

也就是說，本發(fā)明的試劑盒，可以是含有上述獨(dú)立包裝的各引物對，也可以是含有配置好的含有各引物對的PCR檢測液。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還可以含有無菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、樣品基因組DNA提取試劑等等。

實(shí)施例3試劑盒檢測腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的特異性鑒定

采用實(shí)施例2所述試劑盒中的三組引物對，以不同血清型沙門菌和其它細(xì)菌的基因組分別為模板，多重PCR方法檢測腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的特異性。

PCR反應(yīng)體系為(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O補(bǔ)至25μL。

PCR程序?yàn)?4℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，PCR電泳結(jié)果表明以腸炎沙門菌基因組為模板的泳道可擴(kuò)增出三條帶，分別為tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)；以雞白痢和雞傷寒沙門菌基因組為模板的泳道僅擴(kuò)增一條帶，為tcpS基因；以都柏林沙門菌基因組為模板的泳道可擴(kuò)增出兩條帶，分別為tcpS基因、flhBinner片段(圖2)。表明以實(shí)施例2所述試劑盒中特定的tcpS、lygD和flhBinner擴(kuò)增引物，可以通過多重PCR方法快速鑒定未知細(xì)菌是否為這三種血清型沙門菌。

實(shí)施例4試劑盒檢測腸炎沙門菌、雞白痢和雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的靈敏性鑒定

采用實(shí)施例2所述試劑盒中的三組引物對，將腸炎沙門菌C50041基因組、雞白痢沙門菌S06004基因組和都柏林沙門菌SL5928基因組依次10倍稀釋，分別以稀釋的基因組為模板，鑒定試劑盒檢測腸炎沙門菌、雞白痢/雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的靈敏性。

PCR反應(yīng)體系為(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O補(bǔ)至25μL。

PCR程序?yàn)?4℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，PCR電泳結(jié)果表明基于tcpS、flhBinner和flhBinner的多重PCR檢測試劑盒可檢測58.5pg/μl的腸炎沙門菌基因組、雞白痢沙門菌基因組和都柏林沙門菌基因組(圖3)。

實(shí)施例5試劑盒在豬場的應(yīng)用

采用實(shí)施例2中試劑盒，檢測24株豬場分離的沙門菌樣品，可快速準(zhǔn)確地分別檢測出腸炎沙門菌。具體步驟如下：

1)沙門菌的分離

本試驗(yàn)中樣品采自江蘇某豬場，樣品的采集、增菌及沙門菌的分離和生理生化鑒定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，本次試驗(yàn)共分離鑒定了24株沙門菌。

2)多重PCR方法檢測樣本中腸炎沙門菌

將24株沙門菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃180rpm過夜培養(yǎng)，次日，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取各株細(xì)菌的基因組，以基因組為模板同時(shí)擴(kuò)增tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，PCR反應(yīng)體系為(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O補(bǔ)至25μL。PCR程序?yàn)?4℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，可擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三條目的條帶的泳道為腸炎沙門菌。結(jié)果顯示24株沙門菌中共有3株可同時(shí)檢測到這三條帶，分別是9、17和21(圖4)，這些沙門菌分離株即為腸炎沙門菌。

3)沙門菌的傳統(tǒng)血清型鑒定

本次試驗(yàn)分離的24株沙門菌的血清型鑒定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鑒定結(jié)果表明24株沙門菌中共有3株腸炎沙門菌，分別為9、17和21，PCR檢測結(jié)果與血清型鑒定結(jié)果完全一致。

在本實(shí)施例中，采用血清型鑒定的方法，將24株沙門菌中的腸炎沙門菌篩選出來，需要至少2天的時(shí)間。而采用本發(fā)明實(shí)施例2的檢測試劑盒，僅需3個(gè)小時(shí)，即可將24株沙門菌中的腸炎沙門菌準(zhǔn)確篩選出來，且正確率為100％。

實(shí)施例6試劑盒在雞場的應(yīng)用

采用實(shí)施例2中試劑盒，檢測24株雞場分離的沙門菌樣品，可快速準(zhǔn)確地檢測出腸炎沙門菌以及雞白痢/雞傷寒沙門菌。具體步驟如下：

1)沙門菌的分離

本試驗(yàn)中樣品采自江蘇某雞場，樣品的采集、增菌及沙門菌的分離和生理生化鑒定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，本次試驗(yàn)共分離鑒定了24株沙門菌。

2)多重PCR方法檢測樣本中腸炎沙門菌以及雞白痢和雞傷寒沙門菌

將24株沙門菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃180rpm過夜培養(yǎng)，次日，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取各株細(xì)菌的基因組，以基因組為模板同時(shí)擴(kuò)增tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，PCR反應(yīng)體系為(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O補(bǔ)至25μL。PCR程序?yàn)?4℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，可擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三條目的條帶的泳道為腸炎沙門菌，僅擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)的泳道為雞白痢沙門菌。結(jié)果顯示24株沙門菌樣品中共有5株可同時(shí)檢測到tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，分別是6、8、17、22和24，這些沙門菌即為腸炎沙門菌；共有11株僅檢測到tcpS基因，分別是3、5、7、10、12、13、14、16、18、20和21(圖5)，這些沙門菌即為雞白痢/雞傷寒沙門菌。

3)沙門菌的傳統(tǒng)血清型鑒定

本次試驗(yàn)分離的22株沙門菌的血清型鑒定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鑒定結(jié)果表明22株沙門菌中共有5株腸炎沙門菌，分別為6、8、17、22和24，共有11株雞白痢沙門菌，分別為3、5、7、10、12、13、14、16、18、20和21，PCR檢測結(jié)果與血清型鑒定結(jié)果完全一致。

在本實(shí)施例中，采用血清型鑒定的方法，將24株沙門菌中的腸炎沙門菌以及雞白痢和雞傷寒沙門菌篩選出來，需要至少2天的時(shí)間。而采用本發(fā)明實(shí)施例2的檢測試劑盒，僅需3個(gè)小時(shí)，即可將24株沙門菌中的腸炎沙門菌以及雞白痢/雞傷寒沙門菌準(zhǔn)確篩選出來，且正確率為100％。

實(shí)施例7試劑盒在牛場的應(yīng)用

采用實(shí)施例2中試劑盒，檢測11株牛場分離的沙門菌樣品，可快速準(zhǔn)確地檢測出都柏林沙門菌這三種血清型。具體步驟如下：

1)沙門菌的分離

本試驗(yàn)中樣品采自江蘇某牛場，樣品的采集、增菌及沙門菌的分離和生理生化鑒定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，本次試驗(yàn)共分離鑒定了11株沙門菌。

2)PCR方法檢測樣本中都柏林沙門菌

將11株沙門菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃180rpm過夜培養(yǎng)，次日，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取各株細(xì)菌的基因組，以基因組為模板同時(shí)擴(kuò)增tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，PCR反應(yīng)體系為(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O補(bǔ)至25μL。PCR程序?yàn)?4℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，可擴(kuò)增出tcpS基因(882bp)、flhBinner片段(155bp)兩條目的條帶的泳道為都柏林沙門菌。結(jié)果顯示11株沙門菌中僅7號樣品同時(shí)含tcpS基因和flhBinner片段(圖6)，該沙門菌即為都柏林沙門菌。

3)沙門菌的傳統(tǒng)血清型鑒定

本次試驗(yàn)分離的11株沙門菌的血清型鑒定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鑒定結(jié)果表明11株沙門菌中共有1株都柏林沙門菌，為7號分離菌，PCR檢測結(jié)果與血清型鑒定結(jié)果完全一致。

在本實(shí)施例中，采用血清型鑒定的方法，將11株沙門菌中的都柏林沙門菌篩選出來，需要至少2天的時(shí)間。而采用本發(fā)明實(shí)施例2的檢測試劑盒，僅需3個(gè)小時(shí)，即可將11株沙門菌中的都柏林沙門菌準(zhǔn)確篩選出來，且正確率為100％。

綜上所述，本發(fā)明試劑盒相較于傳統(tǒng)血清型鑒定方法的優(yōu)勢：

傳統(tǒng)血清型鑒定需購買特定的沙門菌血清型鑒定試劑盒，價(jià)格昂貴，步驟繁瑣，尤其在大樣本中分離特定的血清型沙門菌(如腸炎沙門菌、雞白痢和雞傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌)時(shí)，需耗費(fèi)大量時(shí)間(至少兩天)，且工作量龐大，其結(jié)果是由肉眼進(jìn)行判斷，因而可能存在人為誤差；而本發(fā)明試劑盒的檢測方法操作簡單，成本非常低，整個(gè)鑒定過程在三小時(shí)內(nèi)即可完成(包含PCR和瓊脂糖凝膠電泳)，且準(zhǔn)確率達(dá)到100％。

因此，本發(fā)明的一種快速鑒定腸炎沙門菌、雞白痢和雞傷寒沙門菌以及都柏林沙門菌的多重PCR檢測試劑盒，有利于簡化沙門菌血清型鑒定的傳統(tǒng)步驟，為在大量樣本中篩選腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林血清型沙門菌提供了一種快速鑒定的新方法。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。