本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及ORC1L基因及其表達(dá)產(chǎn)物在疾病診治中的應(yīng)用，具體的所述疾病為食管鱗癌。
背景技術(shù)：
：食管癌是人類最常見(jiàn)惡性腫瘤之一。據(jù)WHO報(bào)道，2012年全球食管癌新發(fā)病例為455,800例，死亡400,200例，以亞洲東部、非洲東部和南部地區(qū)發(fā)病率最高，非洲西部地區(qū)發(fā)病率最低，發(fā)病率差異顯著，中國(guó)為食管癌高發(fā)地區(qū)，每年中國(guó)的發(fā)病率為21.88/10萬(wàn)，居各類惡性腫瘤第5位；死亡率為15.85/10萬(wàn)，居第4位。我國(guó)衛(wèi)生部已經(jīng)將食管癌列為中國(guó)特色十大疾病之一。食管癌的主要病理類型有兩種，食管鱗癌及食管腺癌，食管鱗癌也被稱為食管鱗狀細(xì)胞癌。我國(guó)食管癌發(fā)生的病理組織類型與西方國(guó)家不同，90％以上為食管鱗癌，且呈現(xiàn)明顯的地域分布，主要集中在太行山、秦嶺、大別山以及川北、閩粵、蘇北、新疆和甘肅等地理區(qū)域。盡管近年來(lái)診斷及治療技術(shù)不斷進(jìn)步，食管癌的預(yù)后仍不十分理想，患者的5年生存率仍不超過(guò)14％。而導(dǎo)致其預(yù)后差的原因有很多，其中包括缺乏有效的普查手段，確診時(shí)病期較晚，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)治療時(shí)期，術(shù)后或放療后復(fù)發(fā)，缺乏特異性及敏感性較高的腫瘤標(biāo)志物等。改善預(yù)后是目前食管癌治療中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。而尋找能夠早期診斷病情并且精確預(yù)測(cè)治療效果的新的腫瘤標(biāo)志物是改善預(yù)后的一個(gè)重要方面。食管癌的發(fā)生是一個(gè)多階段的進(jìn)行性發(fā)展過(guò)程，不僅受到環(huán)境因素的影響，更是涉及到多個(gè)基因、多個(gè)通路的交互作用。食管癌的形成是由正常的食管粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生不同程度的非典型增生，之后逐漸發(fā)展成原位癌、早期浸潤(rùn)癌，最終發(fā)生癌變，在這期間的每一步進(jìn)展都涉及到相關(guān)基因的表達(dá)或功能改變。目前食管癌早期診斷滯后，確診時(shí)80％都是中晚期。此時(shí)的治療主要依靠放療及放化療，治療后5年的存活率只有10％左右。因此，尋找參與食管癌發(fā)生發(fā)展的重要分子，對(duì)于提高食管癌早期診斷及尋找新的治療靶點(diǎn)，改善食管癌患者的預(yù)后具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種食管鱗癌的分子標(biāo)志物，該分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，可以實(shí)現(xiàn)食管鱗癌的早發(fā)現(xiàn)早治療。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了檢測(cè)ORC1L的的試劑在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述產(chǎn)品通過(guò)檢測(cè)ORC1L基因的表達(dá)水平來(lái)診斷患者是否患有食管鱗癌。其中ORC1L在食管鱗癌患者表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、印記雜交、原位雜交、陣列雜交、芯片或新一代測(cè)序檢測(cè)ORC1L基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平以診斷食管鱗癌的產(chǎn)品。本發(fā)明提供了一種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中ORC1L基因的表達(dá)水平來(lái)診斷食管鱗癌。其中，所述“樣本”不僅包括生物體試樣，例如細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞氣管支清洗液、尿、便，也包括由這些生物體試樣得到的核酸提取物(基因組DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制備的cDNA制備物或cRNA制備物等)或蛋白質(zhì)提取物。另外，也可以對(duì)上述試樣實(shí)施福爾馬林固定處理、醇固定處理、凍結(jié)處理或石蠟包埋處理。優(yōu)選的所述樣本為組織。進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)ORC1L基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)ORC1L基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的ORC1L蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)ORC1L基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括ORC1L蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括針對(duì)ORC1L基因的引物和/或探針。本發(fā)明所述的基因芯片或基因檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括ORC1L基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與食管鱗癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括ORC1L蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與食管鱗癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。將食管鱗癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高食管鱗癌診斷的準(zhǔn)確率。本發(fā)明提供了ORC1L基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述藥物組合物包括ORC1L基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。所述抑制劑包括抑制ORC1L基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制ORC1L基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制ORC1L基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。進(jìn)一步，所述抑制劑是針對(duì)ORC1L基因的siRNA和/或針對(duì)ORC1L蛋白的抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述抑制劑針對(duì)ORC1L基因的siRNA。為了進(jìn)一步提高siRNA片斷的有效性，綜合設(shè)計(jì)用于篩選的siRNA片斷。最后，通過(guò)同源性比對(duì)(NCBIBLAST)來(lái)過(guò)濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi干擾的脫靶效應(yīng)。優(yōu)選的，所述siRNA的序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。本發(fā)明還提供了一種治療食管鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包含ORC1L基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物抑制劑。所述抑制劑包括抑制ORC1L基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制ORC1L基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制ORC1L基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。進(jìn)一步，上述的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，這類載體包括(但并不限于)：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨化合物、十二烷基硫酸鈉等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末等。本發(fā)明的藥物組合物可以使用不同的添加劑進(jìn)行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑。緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、谷氨酸及相應(yīng)的鹽(它們的堿金屬或堿性稀土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽)。等滲劑包括氯化鉀、氯化鈉、糖及甘油。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸。抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如＜1％w/v)的芐醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯。穩(wěn)定劑包括人類血清蛋白、L-氨基酸、糖及纖維素衍生物。L-氨基酸還可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一個(gè)。糖類包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麥芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羥丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質(zhì)酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素及羥甲基纖維素鈉。表面活性劑包括離子或非離子表面活性劑，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖單?；ァ⒅舅岣视王?。本發(fā)明的藥物還可包括藥學(xué)上可接受的涂層材料包括(但不限于)，快速分解涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散劑。常見(jiàn)快速分解涂層材料包括OPADRY；腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)烯酸聚合物、磷羥丙甲基纖維素苯二甲酸酯、羥丙甲基纖維素乙酸酯、羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲乙基纖維素、乙酰磷苯二甲酸纖維素；增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過(guò)吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過(guò)植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無(wú)毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來(lái)調(diào)節(jié)制劑的pH以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語(yǔ)非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達(dá)到目標(biāo)組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過(guò)任何途徑給予受體。本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對(duì)于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無(wú)水玉米淀粉。當(dāng)口服施用水懸浮液和/或乳液時(shí)，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當(dāng)時(shí)，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過(guò)在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長(zhǎng)或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的ORC1L蛋白的缺失或不足，通過(guò)提高ORC1L蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)ORC1L蛋白的功能，從而治療因ORC1L蛋白減少導(dǎo)致的食管鱗癌。本發(fā)明的藥物還可與其他治療食管鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過(guò)程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。本發(fā)明所述的藥物組合物也可以脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可有多種磷脂形成，如膽甾醇、硬脂基胺或磷脂酰膽堿。本發(fā)明攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。在本發(fā)明中，“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語(yǔ)“探針”通常指能通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。所述探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂“互補(bǔ)”，只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對(duì)于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過(guò)PNA(Polyamidenucleicacid，肽核酸)、LNA(注冊(cè)商標(biāo)，lockednucleicacid，BridgedNucleicAcid，交聯(lián)化核酸)、ENA(注冊(cè)商標(biāo)，2′-O,4′-C-Ethylene-bridgednucleicacids)、GNA(Glycerolnucleicacid，甘油核酸)、TNA(Threosenucleicacid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。本發(fā)明中所述ORC1L蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。本發(fā)明中“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。克隆抗體在本發(fā)明中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?！巴暾贵w”在本發(fā)明中指包含兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體具有功能性Fc區(qū)?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對(duì)本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。作為非限制性的實(shí)例，標(biāo)志物基因可具有SEQIDNO.1或SEQIDNO.2指定的編碼序列或氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。在本發(fā)明的上下文中，ORC1L基因表達(dá)產(chǎn)物包括人ORC1L蛋白以及ORC1L蛋白的部分肽。所述ORC1L蛋白的部分肽含有與食管鱗癌病相關(guān)的功能域。“ORC1L蛋白”包括ORC1L蛋白以及ORC1L蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括ORC1L蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物或其突變體。突變體包括等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、其氨基酸序列通過(guò)缺失、替代、增加和/或插入發(fā)生變異的突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人ORC1L的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。通常，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。氨基酸序列的修飾可以源自自發(fā)突變或遺傳后修飾，也可以人工誘導(dǎo)天然基因產(chǎn)生。通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是ORC1L蛋白的融合蛋白。對(duì)于與ORC1L蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留ORC1L蛋白的生物學(xué)活性即可。在本發(fā)明中，“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“治療”是指包括但不限于治愈，減緩(減少)靶定的病理狀況或病癥或防止復(fù)發(fā)。包括但不限于，(1)抑制作用，在一定程度上抑制疾病進(jìn)展，其包括減緩以及完全抑制；(2)減少疾病發(fā)作和/或癥狀的數(shù)量；(3)減少病灶尺寸；(4)抑制(即減少、減緩或完全阻止)疾病細(xì)胞滲透到相鄰的周邊器官和/或組織；(5)抑制(即減少、減緩或完全阻止)疾病傳播；(6)在一定程度上緩解與疾病相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀；(7)治療后增加無(wú)病表現(xiàn)的時(shí)間長(zhǎng)度；(8)在治療后的給定時(shí)間點(diǎn)減少死亡率；和/或(9)治療后無(wú)副作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了ORC1L基因在食管鱗癌患者中差異表達(dá)，ORC1L在食管鱗癌患者中高表達(dá)，為食管鱗癌的早期檢測(cè)提供了一種新的分子標(biāo)志物。本發(fā)明提供了一種治療精準(zhǔn)醫(yī)療手段，通過(guò)靶向于ORC1L治療食管鱗癌，延緩或者治愈患者的病癥，提供患者的生存質(zhì)量。附圖說(shuō)明圖1顯示利用QPCR檢測(cè)ORC1L基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況；圖2顯示利用QPCR檢測(cè)ORC1L基因在食管細(xì)胞中的表達(dá)情況；圖3顯示利用QPCR檢測(cè)siRNA對(duì)ORC1L基因表達(dá)的影響；圖4顯示軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ORC1L表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；圖5顯示利用transwell小室檢測(cè)ORC1L基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞侵襲的影響。具體的實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1篩選與食管鱗癌相關(guān)的基因標(biāo)志物1、樣品收集各收集6例周圍正常食管粘膜組織和食管鱗癌組織，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò)組織倫理委員會(huì)的同意。2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進(jìn)行操作)取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)提取分離RNA。具體如下：1)加入Trizol，室溫放置5min；2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10min；3)12000rpm離心15min，將上層水相移到另一新的離心管中(注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì))，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10min；4)12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按1ml/mlTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗滌沉淀(4℃保存)，洗滌沉淀物，振蕩混勻，4℃，12000rpm離心5min；5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；6)用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-70℃冰箱。3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記用LowRNAInputLinearAmplificationKit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)用Cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。4、雜交基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達(dá)譜芯片,每張芯片包括45015個(gè)寡核苷酸，其中有43376個(gè)人基因探針和1639個(gè)實(shí)驗(yàn)控制探針。按芯片使用說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，溫度在65℃，經(jīng)17h10r/min滾動(dòng)雜交，37℃洗片。5、數(shù)據(jù)處理雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動(dòng)以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動(dòng)合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用FeatureExtraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。6、結(jié)果與正常食管粘膜組織相比，ORC1L基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)量顯著上調(diào)。實(shí)施例2QPCR測(cè)序驗(yàn)證ORC1L基因的差異表達(dá)1、對(duì)ORC1L基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選擇正常食管組織和食管鱗癌組織各50例。2、RNA提取步驟如實(shí)施例1所述。3、逆轉(zhuǎn)錄：1)反應(yīng)體系：試劑體積MgCl22μl10×RTBuffer1μl無(wú)Rnase水3.75μldNTP混合液1μlRnase抑制劑0.25μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl寡聚dT適配子引物0.5μl實(shí)驗(yàn)樣品1μl2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件按照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件進(jìn)行。42℃～55℃60min，99℃2min，5℃5min。3)聚合酶鏈反應(yīng)1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank中ORC1L基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：ORC1L基因：正向引物為5’-TGCCATCCGTGATTCTGA-3’(SEQIDNO.3)；反向引物為5’-GGAGTAGAGGTCGCTTCAT-3’(SEQIDNO.4)。管家基因GAPDH的引物序列為：正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQIDNO.5)反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.6)2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：表1PCR反應(yīng)體系試劑體積正向引物1μl反向引物1μlTakaraExTaqHS12.5μl模板2μl去離子水補(bǔ)足25μl3)PCR反應(yīng)條件：95℃10min，(95℃15s，60℃45s)×30個(gè)循環(huán)。以SYBRGreen作為熒光標(biāo)記物，在LightCycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6、結(jié)果結(jié)果如圖1所示，與周圍正常食管粘膜組織相比，ORC1L基因在食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。實(shí)施例3ORC1L基因在食管癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)1、細(xì)胞培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150、KYSE450購(gòu)自中科院腫瘤研究所，正常食管上皮細(xì)胞株Het-1a購(gòu)自于廣州吉尼歐公司。以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。2、細(xì)胞總RNA的提取1)胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打獲得的細(xì)胞經(jīng)離心、重懸、清洗后，以1640培養(yǎng)基(10％小牛血清)重懸；2)將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板(/孔)，添加培養(yǎng)基至2m1/孔，輕搖6孔板使細(xì)胞均勻重懸；3)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48h，去培養(yǎng)基；4)以1mlTrizol試劑裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打6孔板壁，盡量使細(xì)胞完全裂解；5)轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液至1.5mlDEPC處理過(guò)的EP管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步驟同組織中RNA提取過(guò)程。3、逆轉(zhuǎn)錄具體步驟同實(shí)施例2.4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、結(jié)果結(jié)果如圖2所示，與食管上皮細(xì)胞相比，ORC1L基因在食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450中表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。實(shí)施例4ORC1L基因的沉默1、細(xì)胞培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。2、siRNA設(shè)計(jì)針對(duì)ORC1L基因的siRNA序列：陰性對(duì)照siRNA序列(siRNA-NC)：正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQIDNO.7)，反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQIDNO.8)；siRNA1-ORC1L：正義鏈為5’-AAGCAAUUUAGCAACAUACGG-3’(SEQIDNO.9)，反義鏈為5’-GUAUGUUGCUAAAUUGCUUGA-3’(SEQIDNO.10)；siRNA2-ORC1L：正義鏈為5’-UUUCGAAGCUGCAAUUCGGGU-3’(SEQIDNO.11)，反義鏈為5’-CCGAAUUGCAGCUUCGAAAAC-3’(SEQIDNO.12)；將細(xì)胞按5×105/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)24h，在無(wú)雙抗、含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于Invitrogen公司)的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(KYSE150)陰性對(duì)照組(siRNA-NC)和實(shí)驗(yàn)組(20nM)(siRNA1-ORC1L、siRNA2-ORC1L、)，其中陰性對(duì)照組siRNA與ORC1L基因的序列無(wú)同源性，濃度為20nM/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3、QPCR檢測(cè)ORC1L基因的轉(zhuǎn)錄水平3.1細(xì)胞總RNA的提取具體步驟同實(shí)施例3。3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。3.3QPCR擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾ORC1L基因表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、結(jié)果結(jié)果如圖3顯示，相比KYSE150、轉(zhuǎn)染空載siRNA-NC、siRNA2-ORC1L組，siRNA1-ORC1L組能夠顯著降低ORC1L基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例5ORC1L基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞凋亡的影響使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ORC1L基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。3、步驟細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，使用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，然后用0.25％胰酶消化細(xì)胞，中止消化，將離心收集的細(xì)胞使用PBS重懸，將細(xì)胞定量為1×106個(gè)/ml，取200μl上述細(xì)胞懸液放置到Eppendorf管中，加入10μlAnnexin-V-FITC混勻，室溫暗處孵育染色15min，上機(jī)前5min加入10mg/L碘化丙錠(PI)染色5μl。未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞分別用Annexin-V-FITC和PI染色用于標(biāo)準(zhǔn)定量。用FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞百分比。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、結(jié)果：轉(zhuǎn)染siRNA1-ORC1L組的細(xì)胞凋亡率為(17.35±0.016)％，轉(zhuǎn)染siRNA-NC空載體組的細(xì)胞凋亡率為(5.83±0.013)％，上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果表明，ORC1L基因的過(guò)表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。實(shí)施例6軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)1、用0.25％胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，輕輕吹打使之成為單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀。2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/ml。3、制備兩個(gè)濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。4、1.2％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于CO2溫箱中備用。5、在無(wú)菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×103個(gè)/ml的穩(wěn)定感染細(xì)胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)4個(gè)樣本。6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。8、結(jié)果結(jié)果如圖4所示，與其他組相比，siRNA1-ORC1L組單細(xì)胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。實(shí)施例7Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)1、向Transwell小室的上孔中加入100μl的無(wú)血清培養(yǎng)液Matrigel浸泡30min。2、用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定感染后各組細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞3次，用含有10％血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml。3、向包被有Matrigel的Transwell小室的上室中加入細(xì)胞懸液200μl。4、Transwell小室的下室中加入600μl含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液。5、37℃，5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。6、除去上室和下室中的培養(yǎng)液，用棉簽刮除上室中的Matrigel和存留的細(xì)胞，用PBS清洗2次。7、用1％結(jié)晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。8、隨機(jī)選取4個(gè)100倍視野，在顯微鏡下分別計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，每種不同類型的細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共重復(fù)3次。9、數(shù)據(jù)處理用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10、結(jié)果結(jié)果如圖5所示，KYSE150、siRNA1-ORC1L、siRNA-NC組細(xì)胞在transwell小室中培養(yǎng)24h后，siRNA1-ORC1L組聚碳酸酯膜下室面的細(xì)胞數(shù)顯著降低。上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3