本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測(cè)acadl異常為手段的腫瘤診斷方法；及激活acadl基因或蛋白質(zhì)的腫瘤治療劑。

背景技術(shù)：

腹主動(dòng)脈瘤(abdominalaorticaneutysm，aaa)是指由于腹主動(dòng)脈壁的病變或損失，造成腹主動(dòng)脈的局限性擴(kuò)張、膨出，以搏動(dòng)性腫塊為主要癥狀的疾病。通常將腹主動(dòng)脈段動(dòng)脈壁三層結(jié)構(gòu)持續(xù)性擴(kuò)張至腎動(dòng)脈處腹主動(dòng)脈直徑1.5倍以上即定義為aaa，是一種常見(jiàn)的高病死率動(dòng)脈退行性疾病。目前，對(duì)于腹主動(dòng)脈瘤具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，已有的報(bào)道顯示其發(fā)病與遺傳因素、炎癥、蛋白酶降解、平滑肌細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān)，其發(fā)病與其他腫瘤因化學(xué)輻射、基因突變等不同。人腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(hvsmcs)作為腹主動(dòng)脈中膜的主要構(gòu)成成分，對(duì)維持動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)和功能的完整性起到重要作用。近年來(lái)，一些報(bào)道顯示腹主動(dòng)脈瘤組織中vsmc數(shù)量的減少是其形成過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵因素。如何有效抑制vsmc的凋亡有望為延緩aaa的形成、發(fā)展提供新的治療思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過(guò)檢測(cè)acadl基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)診斷腹主動(dòng)脈瘤的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過(guò)激活acadl基因或acadl蛋白來(lái)治療腹主動(dòng)脈瘤的方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種用于篩選治療腹主動(dòng)脈瘤的藥物的方法。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于治療腹主動(dòng)脈瘤的藥物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測(cè)acadl的產(chǎn)品在制備腹主動(dòng)脈瘤診斷工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述檢測(cè)acadl的產(chǎn)品包括檢測(cè)acadl基因表達(dá)量的產(chǎn)品。

更進(jìn)一步，所述檢測(cè)acadl的產(chǎn)品包括能夠定量acadl基因mrna的產(chǎn)品，和/或能夠定量acadl蛋白的產(chǎn)品。

本發(fā)明的定量acadl基因mrna的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點(diǎn)雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測(cè)序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。

包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得，或通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來(lái)獲得。

進(jìn)一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴(kuò)增的核酸可以通過(guò)使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來(lái)檢測(cè)。

所述能夠定量acadl基因mrna的產(chǎn)品包括實(shí)時(shí)定量pcr中使用的特異擴(kuò)增acadl基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

產(chǎn)品中包括的引物可以通過(guò)通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，或者可以通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò)增它來(lái)制備。

本發(fā)明的定量acadl蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測(cè)定法、免疫組織化學(xué)法、western印跡等。

本發(fā)明的定量acadl蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合acadl蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類(lèi)別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的定量acadl蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。

抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免疫動(dòng)物后，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過(guò)使用被用作抗原的acadl蛋白或其部分對(duì)獲得的抗體實(shí)施抗原特異性純化來(lái)獲得針對(duì)acadl蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對(duì)血清實(shí)施抗原特異性純化。可以通過(guò)用酶處理獲得的抗體或通過(guò)使用獲得的抗體的序列信息來(lái)獲得抗體片段。

標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域普遍知道的方法來(lái)實(shí)施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-nh2、生物素標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2、過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標(biāo)記試劑盒、qdot(tm)抗體標(biāo)記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體或其片段。

作為依照本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過(guò)處理的材料。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣品來(lái)自受試者的組織。

進(jìn)一步，所述定量acadl基因或acadl蛋白的產(chǎn)品可以是檢測(cè)acadl基因或acadl蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。

本發(fā)明還提供了一種診斷腹主動(dòng)脈瘤的工具，所述工具能夠檢測(cè)acadl基因表達(dá)量。

進(jìn)一步，所述工具包括包括能夠定量acadl基因mrna的試劑，和/或能夠定量acadl蛋白的試劑。

更進(jìn)一步，所述能夠定量acadl基因mrna的試劑是實(shí)時(shí)定量pcr中使用的特異擴(kuò)增acadl基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

進(jìn)一步，所述診斷腹主動(dòng)脈瘤的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷腹主動(dòng)脈瘤的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知acadl基因的異常與腹主動(dòng)脈瘤相關(guān)也屬于acadl的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗acadl抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的數(shù)目沒(méi)有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合acadl即可。

本發(fā)明還提供了一種診斷腹主動(dòng)脈瘤的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取受試者的樣品；

(2)檢測(cè)受試者樣品中acadl基因或蛋白的表達(dá)水平；

(3)將測(cè)得的acadl基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來(lái)。

(4)與對(duì)照相比，acadl基因或蛋白的表達(dá)水平降低，則該受試者被判斷患有腹主動(dòng)脈瘤或者具有患有腹主動(dòng)脈瘤的風(fēng)險(xiǎn)、或者腹主動(dòng)脈瘤患者被判斷為復(fù)發(fā)、或者腹主動(dòng)脈瘤患者被判斷為預(yù)后不良。

本發(fā)明還提供了一種腹主動(dòng)脈瘤的治療方法，所述方法包括激活acadl基因或acadl蛋白。

進(jìn)一步，所述方法包括促進(jìn)acadl基因的表達(dá)，或促進(jìn)acadl蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)acadl蛋白的活性。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過(guò)在對(duì)癌細(xì)胞添加測(cè)試藥物后或在對(duì)腫瘤模型動(dòng)物施用測(cè)試藥物后的某個(gè)時(shí)期測(cè)量acadl基因或者acadl蛋白的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定腫瘤藥物改善腫瘤預(yù)后的效果。更具體地說(shuō)，當(dāng)acadl基因或者acadl蛋白的表達(dá)水平在添加或施用測(cè)試藥物后升高時(shí)或者恢復(fù)正常水平時(shí)，可選擇該藥物作為改善腫瘤預(yù)后的治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種治療腹主動(dòng)脈瘤的藥物，所述藥物包含acadl的激活劑。

發(fā)明的acadl的激活劑不受限制，只要所述激活劑能夠促進(jìn)或增強(qiáng)acadl或涉及acadl上游或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)或活性，且對(duì)于治療腫瘤有效的藥物即可。

本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療腹主動(dòng)脈瘤的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述激活劑包括acadl基因、acadl蛋白、促進(jìn)型mirna、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。

本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的acadl蛋白的缺失或不足，通過(guò)提高acadl蛋白的表達(dá)，從而治療因acadl蛋白缺乏導(dǎo)致的腹主動(dòng)脈瘤。另一方面可以用于增強(qiáng)acadl蛋白的活性，從而治療腹主動(dòng)脈瘤。

本發(fā)明的激動(dòng)劑藥物可以通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方式配制藥物組合物來(lái)使用。這種組合物包含活性成分，加上一種或多種藥物可接受的載體、稀釋劑、填充劑、結(jié)合劑及其它賦形劑，這依賴(lài)于給藥方式及所設(shè)計(jì)的劑量形式。本領(lǐng)域枝術(shù)人員已知的治療惰性的無(wú)機(jī)或有機(jī)的載體包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蠟、脂肪、多羥基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，諸如此類(lèi)，各種防腐劑、潤(rùn)滑劑、分散劑、矯味劑。保濕剮、抗氧化劑、甜味劑、著色劑、穩(wěn)定劑、鹽、緩沖液諸如此類(lèi)也可加入其中，這些物質(zhì)根據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情況下產(chǎn)生可接受的口感或氣味，在這種組合物中可以使用的制劑可是其原始化合物本身的形式，或任選地使用其藥物學(xué)可接受的鹽的形式，本發(fā)明的激動(dòng)劑藥物可以單獨(dú)給藥，或以各種組合給藥，以及與其它治療藥劑一起結(jié)合形式給藥。如此配制的組合物根據(jù)需要可選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆绞桨鸭?dòng)劑藥物進(jìn)行給藥。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明的抑制劑施用于人，其中口服安全有效量通常至少約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。

本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過(guò)皮膚，通過(guò)胸膜，局部的，吸入，通過(guò)粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。

本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來(lái)恰當(dāng)?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用例如對(duì)疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來(lái)確定。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷腹主動(dòng)脈瘤”包括判斷受試者是否已經(jīng)患有腹主動(dòng)脈瘤、判斷受試者是否存在患有腹主動(dòng)脈瘤的風(fēng)險(xiǎn)、判斷腹主動(dòng)脈瘤患者是否已經(jīng)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、判斷腹主動(dòng)脈瘤患者對(duì)藥物治療的反應(yīng)性、或者判斷腹主動(dòng)脈瘤患者的預(yù)后情況。

本文所用的“治療”涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動(dòng)物例如人類(lèi)中治療相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：

(1)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，尤其是當(dāng)該哺乳動(dòng)物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時(shí)；

(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者

(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。

術(shù)語(yǔ)“治療”通常涉及治療人類(lèi)或動(dòng)物(例如，被獸醫(yī)所應(yīng)用)，其中可達(dá)到某些預(yù)期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預(yù)防措施(例如預(yù)防)的治療。對(duì)還沒(méi)有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險(xiǎn)的患者的用途，也包括在術(shù)語(yǔ)“治療”中。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷腹主動(dòng)脈瘤的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。

本發(fā)明的包括acadl基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的腹主動(dòng)脈瘤的治療藥物。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用qpcr檢測(cè)acadl基因在腹主動(dòng)脈瘤組織與正常對(duì)照組織中的差異表達(dá)；

圖2顯示利用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)acadl蛋白在腹主動(dòng)脈瘤組織與正常對(duì)照組織中的差異表達(dá)；

圖3顯示利用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)acadl基因表達(dá)抑制率。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1基因芯片篩選差異表達(dá)基因

1、組織獲取和處理：收集aaa動(dòng)脈壁中層活體標(biāo)本2份及腎下正常主動(dòng)脈對(duì)照組織2份，在無(wú)菌、無(wú)rna酶條件下，于平腎動(dòng)脈下方約4cm處切取主動(dòng)脈壁，滅菌生理鹽水沖洗去血跡，將所取組織除去動(dòng)脈內(nèi)外膜，迅速(<5min)凍存在液氮中備用。

2、rna提取、cdna合成

將液氮保存的動(dòng)脈瘤組織分別放在陶瓷研缽中液氮低溫環(huán)境下碾碎成粉末,加入trizol試劑勻漿，離心后取上清液經(jīng)1∶1酸性酚-氯仿兩次抽提后再經(jīng)醋酸鈉和5∶1酸性酚-氯仿抽提，等體積異丙醇沉淀，離心后用milli-q水溶解沉淀，紫外分光光度儀測(cè)定od值(a260/a280)，甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)28s、18srrna條帶。

3、芯片處理

hgec40s型表達(dá)譜芯片由上海博星基因芯片有限公司制作。用載體兩端通用引物對(duì)4096條全長(zhǎng)基因行聚合酶聯(lián)反應(yīng)(pcr)擴(kuò)增，產(chǎn)物長(zhǎng)度為1000～3000bp，應(yīng)用瓊脂糖電泳檢驗(yàn)pcr產(chǎn)物,濃縮后的擴(kuò)增產(chǎn)物作為靶基因溶解于3×ssc點(diǎn)樣液中用cartesianpixsys7500點(diǎn)樣儀在18mm×18mm玻片上按0.28mm間距點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后玻片經(jīng)水合、室溫干燥、uv交聯(lián)，再用0.2％sds、水及0.2％硼氫化鈉溶液處理10min，晾干備用。

4、探針制備

oligolexmrnamidikits(qiagen公司，美國(guó))純化mrna，據(jù)rna溶液的濃度取適量總rna，用oligodt親和柱純化，得到純mrna。參照文獻(xiàn)[schenam,shalond,davisrw,etal.quantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacomplementarydnamicroarray.science,1995,270:467-470]的方法逆轉(zhuǎn)錄合成及純化cdna探針，cy3-dutp標(biāo)記正常組織mrna，用cy5-dutp標(biāo)記aaa組織mrna。乙醇沉淀后將cy3-dutp和cy5-dutp標(biāo)記的探針混合溶解在20μl5×ssc+0.2％sds雜交液中。

5、雜交和洗滌：將hgec40s表達(dá)譜芯片和雜交探針?lè)謩e做95℃變性后置于雜交艙內(nèi)，加入混合探針，用雜交密封艙加以密閉，不留有氣泡。于恒濕雜交箱內(nèi)60℃雜交16h。

6、差異基因的檢測(cè)與分子生物學(xué)信息分析：用genepix4000b熒光掃描儀掃描芯片后，genepixpro3.0軟件分析2種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。用40個(gè)管家基因進(jìn)行cy3和cy5的均衡。先將所有數(shù)據(jù)的前景值與背景值相減，得出cy3、cy5標(biāo)記的強(qiáng)度值，根據(jù)總數(shù)為n的有效基因的cy5/cy3的自然對(duì)數(shù)值lnri＝lncy5/cy3，以ri值在0.1～10.0之間的有效基因作為均一化依據(jù)，算出這些基因cy5/cy3自然對(duì)數(shù)平均值即均一化系數(shù)。將所有數(shù)據(jù)項(xiàng)的cy3標(biāo)記強(qiáng)度乘上均一化系數(shù)，得出調(diào)整后的cy3值。將所有cy3值小于200的強(qiáng)度值以200取代生物信息學(xué)分析結(jié)果：用genepixpro3.0軟件分析2種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。

7、生物信息學(xué)分析結(jié)果

用genepixpro3.0軟件分析2種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。結(jié)果顯示差異表達(dá)基因?yàn)?32個(gè)，其中上調(diào)基因?yàn)?78個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?54個(gè)。

實(shí)施例2差異表達(dá)基因在大樣本中的驗(yàn)證

選擇在腹主動(dòng)脈瘤組織的表達(dá)選擇基因芯片提示差異表達(dá)的acadl為研究目標(biāo)進(jìn)行反向驗(yàn)證。

1、組織獲取和處理：按照實(shí)施例1的方法收集aaa動(dòng)脈壁中層活體標(biāo)本30份及腎下正常主動(dòng)脈對(duì)照組織40份。

2、rna提取

按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行rna提取。

3、逆轉(zhuǎn)錄

用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

4、qpcr

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管。配制以下反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl，正向引物(5μm)1μl，反向引物(5μm)1μl，模板cdna2.0μl，無(wú)酶水8.5μl；擴(kuò)增acadl基因的正向引物序列為5’-tagtattcattcaggtattgtc-3’(seqidno.1)，反向引物序列為5’-gctctgtcattgctattg-3’(seqidno.2)；擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-aaagggtcatcatctctg-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-gctgttgtcatacttctc-3’(seqidno.4)，各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃10s，60℃55s)*45個(gè)循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對(duì)定量。

5、westernblot檢測(cè)

剪碎組織后機(jī)械勻漿，4℃12000rmin離心10min?？捡R氏亮藍(lán)r250染色測(cè)總蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)到同一水平。制備10％sds-聚丙烯酰胺凝膠,每孔加蛋白樣品100μg，電泳后通過(guò)半干式電轉(zhuǎn)移儀(美國(guó)bio-rad公司)將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜。麗春紅s染色確定轉(zhuǎn)膜情況并標(biāo)記蛋白marker位置。5％脫脂奶粉tbs緩沖液封閉4℃冰箱過(guò)夜；一抗1∶1000稀釋?zhuān)覝叵聯(lián)u2h后tbs洗膜3次；按1∶1000加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔igg-hrp60min，tbs洗3次后加入ecl2-3min，暗室顯影2min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將acadl蛋白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

(1)qpcr結(jié)果

如圖1所示，與正常對(duì)照組織相比，腹主動(dòng)脈瘤組織中acadl基因mrna水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

(2)westernblot結(jié)果

如圖2所示，與正常對(duì)照組織相比，腹主動(dòng)脈瘤組織中acadl蛋白水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例3過(guò)表達(dá)acadl基因表達(dá)

1、acadl基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

(1)擴(kuò)增acadl基因的編碼序列；

(2)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；

(3)將擴(kuò)增后的acadl基因連接到表達(dá)載體pcdna3.0中，構(gòu)建pcdna3.0-acadl重組表達(dá)載體。

2、人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)

t/gha-vsmc細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)hvsmc細(xì)胞)用含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培養(yǎng)基加青霉素100units/ml、鏈霉素100μg/ml，置37℃，5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24h換1次培養(yǎng)液，48h傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體lipofectamine2000為轉(zhuǎn)染試劑。實(shí)驗(yàn)分2組：陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0)；實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0-acadl)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hvsmc細(xì)胞細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。24h后細(xì)胞培養(yǎng)板覆蓋率約為70％-80％。轉(zhuǎn)染方式參照l(shuí)ipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4、westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pcdna3.0-acadl的過(guò)表達(dá)情況

步驟同實(shí)施例2。

5、結(jié)果

如圖3所示，與陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0)相比，實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0-acadl)細(xì)胞中acadl蛋白表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例4acadl基因的表達(dá)對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

利用annexinv-pe/7-aad凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自北京科悅生物科技有限公司，ktk102-020)檢測(cè)acadl基因表達(dá)對(duì)平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行。

2、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)與檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，各組細(xì)胞分別換用無(wú)血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，以誘導(dǎo)凋亡。48小時(shí)后胰酶消化收集細(xì)胞，用pbs洗2遍，按照說(shuō)明分析加入bindingbuffer(200μl)、annexinv-pe(10μl)和7-aad(5μl)避光孵育15min，最后加入300μlendingbuffer，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。

3、結(jié)果

結(jié)果顯示，各組細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓刺激48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示pcdna3.0-acadl轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(13.428±1.196)％；而陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(31.627±1.513)％；pcdna3.0-acadl轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率較陰性對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，上述結(jié)果表明，促進(jìn)acadl基因表達(dá)可以抑制人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡。由于人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡增加導(dǎo)致了腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生，因此促進(jìn)acadl基因表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)治療腹主動(dòng)脈瘤的目的。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>acadl基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備腹主動(dòng)脈瘤診治產(chǎn)品中的應(yīng)用

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