本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種特異性甲基化檢測引物及子宮內膜異位癥診斷試劑盒。
背景技術：
子宮內膜異位癥(endometriosis，內異癥)是引起盆腔疼痛和不孕的常見因素,是指具有生長功能的子宮內膜組織在子宮腔被覆粘膜以外的其他部位生長、浸潤、反復出血,可形成結節(jié)及包塊。子宮內膜異位癥是激素依賴性疾病，主要見于育齡婦女。近年來，其發(fā)病率越來越高，育齡婦女中的發(fā)病率約為10％，然而，由于它與不孕和盆腔痛的關系，在這些女性人群中，其患病率明顯要高，已成為婦科常見病。據報道，不孕癥婦女的內異癥患病率為25％-35％，盆腔痛的婦女達39-59％。而內異癥患者50％的病人有明顯的痛經，30％合并不孕，嚴重地影響中青年婦女的健康和生活質量。
子宮內膜異位癥為婦科良性疾病，但具有惡性行為，發(fā)病率逐年上升，臨床早期誤診率可達70％。而且，內異癥的早期診斷比較困難，容易漏診?，F有的診斷方法有：
影像學診斷：如超聲、ct、mri等，但主要適合于子宮內膜異位癥囊腫的患者，有一定的局限性。
血ca125測定：ca125是一種高分子糖蛋白結構的抗原，開始只是上皮性卵巢癌的腫瘤標志物。上世紀80年代以來，學者們逐漸發(fā)現ca125余子宮內膜異位癥有密切關系：子宮內膜異位癥患者的血清ca125水平明顯高于正常生育期婦女。在i～ii期患者中，血清ca125水平雖有升高，但與正常婦女有交叉；而iii～ⅳ期等重度患者中，血清ca125水平越高，病情越重。以血清ca125升高為診斷標準，敏感性50～68％。血清ca125的測定對內異癥診斷有一定的意義，但是按美國生育協會對內異癥分期的標準，只有iii～ⅳ期有卵巢子宮內膜異位囊腫、病灶浸潤較深、盆腔粘連廣泛者血ca125陽性率較多，i～ii期子宮內膜異位癥血ca125多正常。因此，血清ca125對內異癥的診斷特異性低，提示ca125陰性者亦不能排除內異癥。
血清抗體檢測：已知子宮內膜異位癥是一種自身免疫性疾病，內異癥患者患者由于細胞免疫缺陷，子宮內膜中某些抗原在激素作用下表達與患者血清中可溶性的抗原，從而產生抗體，即子宮內膜抗體。正常婦女血清中的子宮內膜抗體陰性或在一基線水平，它的存在可能與不孕有關，內異癥患者的血清子宮內膜抗體陽性率在60％以上。雖然有一定的診斷價值，但也存在局限性，因為子宮內膜抗原的制備和檢測方法的不同有較大差異。
腹腔鏡：腹腔鏡是診斷子宮內膜異位癥的最佳方法，特別是對不明原因不育或腹痛者首選腹腔鏡檢查，當鏡下看到典型子宮內膜異位癥時，即可確定診斷。不過，肉眼診斷的子宮內膜異位病灶，只有約70％得到病理證實。
目前已有研究表明，sf-1基因的表達水平與子宮內膜異位有關，已經發(fā)現sf-1在非內異癥患者在位子宮內膜和內異癥患者異位內膜中的表達存在差異，在異位內膜中表達異常增高最顯著，異位病灶中如此的高表達說明sf-1是內異癥的一個非常重要的致病因子。而該基因近端啟動子區(qū)域cpg位點的甲基化水平則影響著sf-1基因的表達水平，因此，判斷sf-1啟動子區(qū)域cpg位點甲基化的狀態(tài)有潛力成為早期診斷子宮內膜異位癥的診斷手段。然而，通過sf-1啟動子區(qū)域的甲基化水平來診斷子宮內膜異位癥的精確度和靈敏度不夠高，一方面，目前發(fā)現在少數子宮內膜異位癥患者中，sf-1啟動子區(qū)域仍存在一定的甲基化狀態(tài)；另一方面，目前檢測甲基化狀態(tài)的常規(guī)方法是首先采用亞硫酸氫鹽對胞嘧啶進行修飾，再進行測序，依此來判斷某位點的甲基化狀態(tài)，但該方法的精確性和靈敏性受亞硫酸氫鹽修飾反應效率的影響，可能會出現假陽性的情況，進而影響診斷的精確性和靈敏性。即僅判斷該基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，仍會存在一定的假陰性或假陽性，因此，本領域迫切需要尋找更多的sf-1基因甲基化位點，與其啟動子區(qū)域的cpg位點組合使用，使得能夠提高基因診斷的精確性和靈敏度，以便進行及時、有針對性的治療，改善育齡期婦女的生活質量。
技術實現要素：
為了在患病初期精確、靈敏地發(fā)現病癥，協助治療患者，做到早診斷早治療，改善患者妊娠結局和生活質量，本發(fā)明提供一種用于子宮內膜異位癥診斷的特異性甲基化檢測的引物及試劑盒，本發(fā)明提供的引物和試劑盒通過擴增sf-1基因的多個cpg島，并對擴增產物測序分析，客觀地判斷待測樣本是否是發(fā)生了子宮內膜異位癥患者的樣本，從而實現子宮內膜異位癥的高精度、高靈敏度診斷，本發(fā)明方法操作簡單，成本低廉，有利于預后目標的監(jiān)測。
子宮內膜異位癥是雌激素依賴性疾病，芳香化酶是雌激素合成過程中的關鍵限速酶，催化雄激素轉化為雌激素，是子宮內膜異位癥發(fā)生的重要致病因子，而類固醇基因因子1(sf-1)可結合到芳香化酶的啟動子區(qū)調控其表達。本發(fā)明的發(fā)明人經過大量實驗研究和驗證，首次發(fā)現了sf-1基因在其內含子/外顯子中也存在可被甲基化的cpg島，該內含子/外顯子的cpg島與傳統的啟動子區(qū)域甲基化關閉基因表達的理論相反，即在位內膜時低甲基化而基因不表達，但在異位內膜時卻高度甲基化而基因高度表達。即異位病灶組織與正常人內膜相比，sf-1的啟動子區(qū)域位點和內含子/外顯子區(qū)域位點的甲基化水平存在相反的關系，因此，在同一次診斷中同時檢測這兩個區(qū)域的甲基化水平，可以最大程度地避免由于亞硫酸氫鹽修飾反應效率所帶來的假陽性，即兩者可以互為各自的陰性對照。
此外，在部分子宮內膜異位癥患者中，sf-1啟動子區(qū)域仍存在一定的甲基化水平，僅通過檢測sf-1啟動子區(qū)域的甲基化水平尚無法精確、準確地對其是否患病進行診斷，如果與檢測sf-1基因中內含子/外顯子的甲基化狀態(tài)相結合，兩者可以有效地實現互補，比起單獨檢測sf-1基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，同時檢測二者甲基化狀態(tài)可以更加精確、靈敏地診斷和預測疾病狀態(tài)。
為實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明第一方面提供一種檢測sf-1基因特異性甲基化的引物，其擴增經亞硫酸氫鈉修飾的sf-1基因的至少一個cpg島，包括：
如seqidno.1所示的上游引物和如seqidno.2所示的下游引物組成的第一引物對；和
如seqidno.3所示的上游引物和如seqidno.4所示的下游引物組成的第二引物對。
對擴增獲得的cpg島進行測序分析可以獲得sf-1基因上啟動子區(qū)域及內含子/外顯子區(qū)域的甲基化位點信息，根據甲基化位點信息可以判斷待測樣本是否是發(fā)生了子宮內膜異位癥患者的樣本，從而實現子宮內膜異位癥的診斷。
為實現本發(fā)明的技術目的，本發(fā)明第二方面提供一種將第一方面所述的引物應用于檢測子宮內膜異位癥的用途。
其中，所述用途包括：將利用引物擴增獲得的所述cpg島進行啟動子區(qū)域位點和內含子/外顯子區(qū)域位點的甲基化信息分析，根據啟動子區(qū)域位點和內含子/外顯子區(qū)域位點甲基化位點信息判斷待測樣本是否是發(fā)生了子宮內膜異位癥的樣本。
其中，所述甲基化位點信息包括自sf-1基因轉錄起始點起第+7、+121、+4114和+4215位點的信息。
本發(fā)明第三方面還提供一種將第一方面所述的引物應用于制備檢測人內異癥試劑中的應用。
為實現本發(fā)明的技術目的，本發(fā)明第四方面提供一種子宮內膜異位癥診斷的試劑盒，其通過擴增經亞硫酸氫鈉修飾的待測樣本的sf-1基因中的至少一個cpg島，并同時檢測sf-1基因的啟動子區(qū)域位點和內含子/外顯子區(qū)域位點的甲基化信息，判斷待測樣本是否為子宮內膜異位癥患者樣本，包括pcrmastermix和擴增引物，其中，所述特異性引物包括：
如seqidno.1所示的上游引物和如seqidno.2所示的下游引物組成的第一引物對；
如seqidno.3所示的上游引物和如seqidno.4所示的下游引物組成的第二引物對。
其中，所述啟動子區(qū)域位點為第+7和第+121位。
其中，所述內含子/外顯子區(qū)域位點為第+4114和+4215位。
特別是，所述通過擴增經亞硫酸氫鈉修飾的待測樣本的sf-1基因中的至少一個cpg島，并同時檢測sf-1基因的啟動子區(qū)域位點和內含子/外顯子區(qū)域位點的甲基化信息，判斷待測樣本是否為子宮內膜異位癥患者樣本包括：
對待測樣本提取的dna進行亞硫酸氫鹽修飾，使樣本sf-1基因cpg島中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶；
對所述經過亞硫酸氫鹽修飾的樣本dna進行pcr擴增處理，獲得大量sf-1基因片段；
對所述sf-1基因片段依次進行純化、ta克隆，取陽性克隆進行測序并同時分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，得到待測樣本是否為子宮內膜異位癥患者樣本的診斷結果。
其中，所述位點發(fā)生甲基化評價指標是：基因的某甲基化位點的胞嘧啶(c)經亞硫酸鹽修飾后變?yōu)槟蜞奏?u)；位點未發(fā)生甲基化評價指標是：基因的某甲基化位點的胞嘧啶(c)經亞硫酸鹽修飾后未發(fā)生變化。
其中，取所述陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，得到待測樣本是否為子宮內膜異位癥患者樣本的診斷結果包括：
將陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，若自sf-1基因的轉錄起始點起的第+7或/和+121位點未發(fā)生甲基化、第+4114或/和+4215位點發(fā)生甲基化，則診斷待測樣本是患有子宮內膜異位癥的樣本；
將陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，若自sf-1基因的轉錄起始點起的第+7或/和+121位點發(fā)生甲基化、第+4114或/和+4215位點未發(fā)生甲基化則診斷待測樣本不是患有子宮內膜異位癥的樣本。
其中，所述對經過亞硫酸氫鹽修飾的樣本dna進行pcr擴增處理，用于獲得sf-1基因片段的特異性引物的擴增處理包括：建立以待測樣本的dna為模板，以seqidno.1-4建立的反應體系在90℃10min，40個循環(huán)(95℃30s、50℃2min、72℃2min)，72℃7min的擴增條件下進行擴增處理。
其中，所述待測樣本包括臨床疑似待診的異位子宮內膜病灶組織。
本發(fā)明還提供一種使用第四方面的試劑盒方法。包括：
對待測樣本提取的dna進行亞硫酸氫鹽修飾，使樣本sf-1基因cpg島中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶；
對所述經過亞硫酸氫鈉處理的樣本dna進行pcr擴增處理，用于獲得大量sf-1基因片段；
對所述sf-1基因片段依次進行純化、ta克隆，取陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，得到待測樣本是否為子宮內膜異位癥患者樣本的診斷結果。
其中，所述將陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，得到待測樣本是否為子宮內膜異位癥患者樣本的診斷結果包括：
將陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，若自sf-1基因的轉錄起始點起的第+7或/和+121位點未發(fā)生甲基化、第+4114或/和+4215位點發(fā)生甲基化，則診斷待測樣本是患有子宮內膜異位癥的樣本；
將陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，若自sf-1基因的轉錄起始點起的第+7或/和+121位點發(fā)生甲基化、第+4114或/和+4215位點未發(fā)生甲基化則診斷待測樣本不是患有子宮內膜異位癥的樣本。
其中，所述位點發(fā)生甲基化評價指標是：基因的某甲基化位點的胞嘧啶(c)經亞硫酸鹽修飾后變?yōu)槟蜞奏?u)；位點未發(fā)生甲基化評價指標是：基因的某甲基化位點的胞嘧啶(c)經亞硫酸鹽修飾后未發(fā)生變化。
其中，所述對經過亞硫酸氫鹽修飾的樣本dna進行pcr擴增處理，用于獲得sf-1基因片段的特異性引物的擴增處理包括：建立以待測樣本的dna為模板，以seqidno.1-4建立的反應體系在90℃10min，40個循環(huán)(95℃30s、50℃2min、72℃2min)，72℃7min的擴增條件下進行擴增處理。
其中，所述擴增體系中還包括pcrmastermix。
本發(fā)明還在于提供一種將sf-1基因作為子宮內膜異位癥的標志物的用途，利用本發(fā)明第一方面提供的引物或第四方面提供的試劑盒對亞硫酸氫鈉修飾后的待測樣本的sf-1基因進行擴增及甲基化分析，可以判斷待測樣本是否為子宮內膜異位癥樣本。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明應用sf-1基因為標志物，對待測樣本的兩個dna甲基化位點的甲基化狀態(tài)進行檢測，可以準確的對樣本的子宮內膜異位癥進行提示，及時有效的提早預知患者疾病趨勢，協助治療患者，改善患者的生活質量。
附圖說明
圖1是正常人與內異癥患者的甲基化位點示意圖。
具體實施方式
為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點，下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述。
在下面的描述中闡述了很多具體的細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是，本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其他方式來實施，因此，本發(fā)明并不限于下面公開的具體實施例的限制。
實施例1試劑盒
試劑盒中包括：pcrmastermix，以及：
第一引物對：如seqidno.1所示的上游引物和如seqidno.2所示的下游引物；
第二引物對：如seqidno.3所示的上游引物和如seqidno.4所示的下游引物。
其中，試劑盒的使用條件是：90℃10min，40個循環(huán)(95℃30s、50℃2min、72℃2min)，72℃7min。
本發(fā)明所使用的pcrmastermix可以是市售的任一一種可以實現dnapcr擴增的混合物試劑，例如appliedbiosystems公司提供的amplitaqgoldpcrmastermix。
實施例2子宮內膜異位癥的診斷
1、樣本采集及dna的提取
少量獲取子宮內膜異位癥病灶組織，用酶原法消化、分離和培養(yǎng)子宮內膜間質細胞，使用dna提取試劑盒對培養(yǎng)的子宮內膜間質細胞進行提取。提取方法參照試劑盒(dneasytissuekit,qiagen,valencia,ca)的操作說明進行。
2、堿基修飾
取500ngdna進行亞硫酸氫鹽修飾(按照試劑盒ezdnamethylationkit,zymoresearch,orange,ca操作說明書進行)，dna中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。
3、pcr擴增
取上述3ul亞硫酸氫鈉處理過的dna加入到amplitaqgoldpcrmastermix(appliedbiosystems)中形成20ul的pcr反應體系進行pcr擴增，其中所用引物為：
第一引物對：f5’-tgtagaaggaggttggttattagag-3’；
r5’-aacraacaaaaccaacctactatcc-3’；
第二引物對：f5’-gaaggttaatggtattatttttttag-3’；
r5’-cacrtataaaaaactacaaaataaac-3’。
4、純化處理
將上述的pcr擴增產物通過1.5％dna凝膠電泳進行純化，兩對引物擴增得到相對應dna片段的大小分別為213bp和333bp。
5、ta克隆處理
將純化后的dna片段克隆到pgem-teasyvector(promega,madison,wi)中，然后挑選6-8個含有正確插入序列的克隆進行下一步的測序。
6、甲基化位點分析及提示的獲得
將獲得的陽性克隆進行測序并分析第+7、+121、+4114、+4215位點是否發(fā)生甲基化，(測序工作可由公司進行，例如：北京友誼中聯生物科技有限公司)。
以基因轉錄起始點為+1，若第+7或/和+121位點未發(fā)生甲基化，+4114或/和+4215位點發(fā)生甲基化，則診斷為患有子宮內膜異位癥，其中，正常人與內異癥患者的甲基化位點示意圖如圖1所示。
實施例3樣本檢測
1、樣本信息
選取因患子宮肌瘤行子宮切除的非內異癥患者的在位子宮內膜組織7例作為對照組，選取內異癥患者的異位子宮內膜組織7例作為實驗組。
2、樣本檢測
分別提取實驗組和對照組的dna，dna的提取可以采用市售的任一一種可以實現dna提取的試劑盒，提取方法參照試劑盒說明書操作，挑選實驗組和對照組中每個樣本的6-8個克隆應用實施例1中的試劑盒即實施例2中的方法進行子宮內膜異位癥的檢測，檢測結果如表1所示。
表1實驗組的檢測結果
其中，表中分數b/a的意義為:a表示每個樣本獲得的陽性克隆總數；b表示每個樣本中位點發(fā)生甲基化或非甲基化的克隆數。
根據表1的檢測結果可知，當待測樣本中自轉錄起始位點起的第+7或/和+121未發(fā)生甲基化，+4114位點或/和+4215位點發(fā)生甲基化，則樣本均為子宮內膜異位癥患者樣本。
根據表1的試驗結果還可以看出，在實驗組樣本之中，以nyz0007為例，sf-1基因的第+7位點的6個陽性克隆中未甲基化克隆數僅為3，sf-1基因的第+121位點的6個陽性克隆中未甲基化克隆數僅為4，可見sf-1基因的第+7位點及第+121位點仍出現了一定的甲基化水平，如果僅從第+7或/和+121位點的甲基化狀態(tài)來看，難以判斷這些樣本是否為子宮內膜異位癥患者，因此結合這些樣本的第+4114位點和第+4215位點的甲基化水平(如表1所示實驗組第+4114位點與第+4215位點均為甲基化克隆)可以推斷nyz0007試驗組樣本為子宮內膜異位癥患者樣本，可見，將sf-1基因的第+7位點和第+121位點與第+4114位點和第+4215位點共同進行判斷可以準確地診斷該樣本應當是子宮內膜異位癥患者，避免出現了假陰性的結果，精確度提高。
可見，利用本發(fā)明的引物及試劑盒可以準確的判斷樣本是否為子宮內膜異位癥患者樣本，方法簡單、操作簡便，成本低，普適性廣。
盡管上述對本發(fā)明做了詳細說明，但不限于此，本技術領域的技術人員可以根據本發(fā)明的原理進行修改，因此凡按照本發(fā)明的原理進行的各種修改都應當理解為落入本發(fā)明的保護范圍。
序列表
序列表
<110>北京大學第一醫(yī)院
<120>一種用于子宮內膜異位癥診斷的特異性甲基化檢測的引物和試劑盒
<160>5<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
tgtagaaggaggttggttattagag25
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
aacraacaaaaccaacctactatcc25
<210>3
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
gaaggttaatggtattatttttttag26
<210>4
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
cacrtataaaaaactacaaaataaac26
1yb16060371p