賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶1抑制劑的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶1抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明以斑馬魚(yú)和小鼠兩種模式動(dòng)物，建立毛細(xì)胞損傷及保護(hù)研究的動(dòng)物模型，結(jié)果表明全身及圓窗局部給予LSD1抑制劑，能明顯上調(diào)組蛋白H3K4二甲基化表達(dá)水平，顯著降低耳蝸毛細(xì)胞Cleaved?Caspase-3表達(dá)，從而減輕毛細(xì)胞損傷，實(shí)現(xiàn)聽(tīng)力保護(hù)的目的，表明賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶1抑制劑對(duì)感音神經(jīng)性聾具有聽(tīng)力保護(hù)作用。本發(fā)明為尋找、防治感音神經(jīng)性耳聾提供了新的途徑，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶1抑制劑的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I (LSDl)抑制劑類(lèi)的新用途，具體涉及LSDl抑制劑對(duì)感音神經(jīng)性聾的聽(tīng)力保護(hù)作用，尤其是涉及對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物致感音神經(jīng)性聾的聽(tīng)力保護(hù)上的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]感音神經(jīng)性聾是耳鼻咽喉科的常見(jiàn)病和多發(fā)病，近年來(lái)發(fā)病呈上升趨勢(shì)，它不僅給患者及其家庭帶來(lái)生理上和心理上的痛苦，而且給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。據(jù)第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國(guó)現(xiàn)有聽(tīng)力殘疾人2004萬(wàn)、言語(yǔ)殘疾人127萬(wàn)。這是一個(gè)數(shù)量眾多、困難突出的社會(huì)群體。聽(tīng)力損傷與耳聾已成為影響人口素質(zhì)的重要因素之一。感音神經(jīng)性聾是一個(gè)醫(yī)學(xué)難題，由于內(nèi)耳毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)的損傷修復(fù)和再生能力的缺乏，感音神經(jīng)性聾的防治工作仍無(wú)突破性進(jìn)展。因此，早期的毛細(xì)胞保護(hù)策略在感音神經(jīng)性聾的防治工作中尤為重要。
[0003]近年來(lái)表觀遺傳學(xué)調(diào)控在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制逐漸被人們所認(rèn)識(shí)和關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中，組蛋白H3和H4的乙?；骄酗@著下降；近期的研究中也發(fā)現(xiàn)了與耳聾相關(guān)的小RNA調(diào)控，某些小RNA的特異性敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠進(jìn)行性聽(tīng)力下降。
[0004]賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I (lysine-specific demethylasel, LSDI)是最早發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶(Yujiang Shi, Fei Lan, Caitlin Matson, etal.2004，Cell.119:941 - 953)。目前認(rèn)為，組蛋白甲基化異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有著密切的關(guān)系。作為L(zhǎng)SDl特異性抑制劑，S2101和CBB1007等小分子藥物具有特異性高、能夠通過(guò)血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)，其在抑制腫瘤發(fā)生及精神類(lèi)疾病領(lǐng)域的調(diào)控機(jī)制逐漸被人們所認(rèn)識(shí)和關(guān)注(Jing Wang, Fei Lu, Qi Ren, et al.2011，Cancer Res.71:7238-7249)。
[0005]但是關(guān)于賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I (LSDl)抑制劑對(duì)感音神經(jīng)性聾聽(tīng)力的保護(hù)作用還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供LSDl抑制劑新的藥用用途，具體涉及其在防治感音神經(jīng)性聾中的用途。
[0007]本發(fā)明提供的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑的用途，用于:
[0008]⑴制備預(yù)防和/或治療感音神經(jīng)性聾的藥物或藥物組合物；或
[0009](ii)制備保護(hù)感音神經(jīng)性聾患者聽(tīng)力的藥物或藥物組合物。
[0010]根據(jù)本發(fā)明，所述的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑能夠提高耳蝸毛細(xì)胞中的組蛋白H3K4 二甲基表達(dá)水平。所述的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑用于制備提高耳蝸毛細(xì)胞中的組蛋白H3K4 二甲基表達(dá)水平的藥物或藥物組合物。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，所述的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑能夠降低耳蝸毛細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3表達(dá)水平。所述的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑用于制備所述的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑用于制備的的藥物或藥物組合物。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，所述預(yù)防和/或治療感音神經(jīng)性聾是指提高耳蝸毛細(xì)胞中的組蛋白H3K4 二甲基表達(dá)水平和/或降低耳蝸毛細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3表達(dá)水平。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，所述保護(hù)感音神經(jīng)性聾患者聽(tīng)力是指提高耳蝸毛細(xì)胞中的組蛋白H3K4 二甲基表達(dá)水平和/或降低耳蝸毛細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3表達(dá)水平。
[0014]根據(jù)本發(fā)明，所述感音神經(jīng)性聾是氨基糖苷類(lèi)藥物致感音神經(jīng)性聾。
[0015]根據(jù)本發(fā)明，所述賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑選自:小分子藥物S2101、小分子藥物CBB1007。
[0016]根據(jù)本發(fā)明，所述藥物或藥物組合物通過(guò)全身或圓窗局部給藥方式施用。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物包含所述賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0018]本發(fā)明以臨床常見(jiàn)的感音神經(jīng)性聾為靶，從新的研究領(lǐng)域——表觀遺傳學(xué)入手，通過(guò)抑制LSDl表達(dá)，實(shí)現(xiàn)毛細(xì)胞保護(hù)的目的，為臨床工作中感音神經(jīng)性聾防治提供新的途徑，為尋找預(yù)防感音神經(jīng)性聾提供了依據(jù)；也為進(jìn)一步分析LSDl抑制劑在抑制毛細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[0019]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷模型的建立。A:Brn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)側(cè)線器神經(jīng)丘；B:新霉素?fù)p傷I小時(shí)后Brn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)側(cè)線器神經(jīng)丘，箭頭表示凋亡小體。其中，綠色代表毛細(xì)胞，藍(lán)色代表細(xì)胞核。
[0021]圖2是LSDl抑制劑(S2101和CBB1007)對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。A:5dpf Brn3c:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)側(cè)線器及神經(jīng)丘的整體觀。其中箭頭代表初級(jí)側(cè)線系統(tǒng)神經(jīng)丘L1-L5和尾部神經(jīng)丘T1-T3，星號(hào)代表次級(jí)側(cè)線系統(tǒng)神經(jīng)丘。B-D:對(duì)照組、S2101處理組和CBB1007處理組的神經(jīng)丘免疫熒光情況；E-G:新霉素處理組、S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組的神經(jīng)丘免疫熒光情況；Bar=10 μ m.H-1:不同處理后神經(jīng)丘毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，且呈濃度依賴(lài)性。*P〈0.05。
[0022]圖3是小鼠耳蝸毛細(xì)胞體外培養(yǎng)損傷模型的建立。圖A是ImM新霉素?fù)p傷4小時(shí)，洗脫24小時(shí)后基底膜整體觀。圖B、圖C、圖D分別代表頂圈、中圈和底圈的典型圖片。其中綠色代表毛細(xì)胞，藍(lán)色代表細(xì)胞核。Scale bar=20 μ m0
[0023]圖4是LSDl抑制劑對(duì)新霉素致小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的體外保護(hù)作用。A_C:對(duì)照組、S2101實(shí)驗(yàn)組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組的頂圈、中圈和底圈的毛細(xì)胞存活情況。其中紅色代表毛細(xì)胞。Scalebar=1ymt5我們將基底膜分為三段，進(jìn)行毛細(xì)胞存計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組(S2101處理組和CBB1007處理組)明顯多于對(duì)照組(新霉素處理組)。每組標(biāo)本數(shù)n=9.**P〈0.001。
[0024]圖5是體內(nèi)試驗(yàn)給藥時(shí)間示意圖，左耳為實(shí)驗(yàn)組，右耳為對(duì)照組。
[0025]圖6是新霉素?fù)p傷致小鼠耳蝸組蛋白H3K4 二甲基化表達(dá)下調(diào)。A_C:新霉素?fù)p傷O分鐘、15分鐘和3小時(shí)組蛋白H3K4 二甲基化的免疫熒光強(qiáng)度變化。新霉素處理后毛細(xì)胞H3K4me2熒光強(qiáng)度明顯降低。其中綠色代表H3K4me2，紅色代表myosin7a標(biāo)記的毛細(xì)胞。藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。D:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組H3K4me2表達(dá)的Western blotting結(jié)果。E:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組H3K4me2表達(dá)的Western blotting灰度分析結(jié)果。
[0026]圖7是LSDl抑制劑致小鼠耳蝸組蛋白H3K4 二甲基化表達(dá)上調(diào)。A_C:對(duì)照組、S2101實(shí)驗(yàn)組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組組蛋白H3K4 二甲基化的免疫熒光強(qiáng)度變化。LSDl抑制劑處理后毛細(xì)胞H3K4me2熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。其中綠色代表H3K4me2，紅色代表myosin7a標(biāo)記的毛細(xì)胞。藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。D:對(duì)照組和S2101處理組H3K4me2表達(dá)的Western blotting結(jié)果及其灰度分析。E:對(duì)照組和CBB1007處理組H3K4me2表達(dá)的Westernblotting結(jié)果及其灰度分析。
[0027]圖8是LSDl抑制劑致凋亡標(biāo)記物Cleaved Caspase-3表達(dá)下調(diào)。A-C:對(duì)照組、S2101實(shí)驗(yàn)組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組Cleaved Caspase-3的免疫熒光強(qiáng)度變化；D:對(duì)照組和S2101實(shí)驗(yàn)組Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的Western blotting結(jié)果及灰度分析結(jié)果。E:對(duì)照組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的Western blotting結(jié)果及灰度分析結(jié)果。其紅色代表Myosin7a標(biāo)記的毛細(xì)胞,綠色代表Cleaved Caspase-3標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。
[0028]圖9是LSDl抑制劑S2101不影響毛細(xì)胞對(duì)FM1-43FX的攝取能力。A:對(duì)照組；B:S2101處理組。其中紅色代表FM1-43FX，藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。
[0029]圖10是LSDl抑制劑S2101和CBB1007對(duì)新霉素致小鼠毛細(xì)胞損傷的體內(nèi)保護(hù)作用。A-B:對(duì)照組和S2101 實(shí)驗(yàn)組的頂圈、中圈和底圈的毛細(xì)胞存活情況。其中色代表Myosin7a,:藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；C_D:對(duì)照組和S2101實(shí)驗(yàn)組的頂圈、中圈和底圈的毛細(xì)胞存活情況。其中紅色代表phalloidine，:藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；E:對(duì)照組和S2101實(shí)驗(yàn)組的頂圈、中圈和底圈的毛細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，n=9, **P〈0.001。F:對(duì)照組和S2101實(shí)驗(yàn)組的平均ABR閾值，η=16, *Ρ〈0.05。G-H:對(duì)照組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組的頂圈、中圈和底圈的毛細(xì)胞存活情況。其中紅色代表Myosin7a，:藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核對(duì)照組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組的頂圈、中圈和底圈的毛細(xì)胞存活情況。其中紅色代表phalloidine,:藍(lán)色代表DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；K:對(duì)照組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組的頂圈、中圈和底圈的毛細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，η=9，#Ρ〈0.001。L:對(duì)照組和CBB1007實(shí)驗(yàn)組的平均ABR閾值，η=13，*Ρ〈0.05。

【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)LSDl抑制劑新的藥用用途，用于防治感音神經(jīng)性聾。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0031]賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I (LSDl)抑制劑
[0032]LSDl是一種高度保守的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴(lài)、賴(lài)氨酸特異性脫甲基酶，能夠特異性地抑制組蛋白Η3Κ4的甲基表達(dá)水平。近期研究表明，LSDl抑制劑CBB1007通過(guò)選擇性調(diào)控Η3Κ4的甲基化狀態(tài)，促進(jìn)了 Gl期細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，從而抑制腫瘤發(fā)生。因此，特異性LSDl抑制劑——S2101, CBB1007等小分子藥物在具有特異性高、能夠通過(guò)血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)，其在抑制腫瘤發(fā)生及精神類(lèi)疾病領(lǐng)域的調(diào)控機(jī)制逐漸被人們所認(rèn)識(shí)和關(guān)注。
[0033]本發(fā)明以斑馬魚(yú)和小鼠兩種模式動(dòng)物，建立毛細(xì)胞損傷及保護(hù)研究的動(dòng)物模型，定量研究LSDl抑制劑能夠有效的降低耳蝸毛細(xì)胞Cleaved Caspase-3表達(dá)，從而抑制毛細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)感音神經(jīng)性聾的聽(tīng)力保護(hù)作用。
[0034]首先建立斑馬魚(yú)側(cè)線器神經(jīng)丘毛細(xì)胞損傷模型，采用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行初步藥物篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LSDl抑制劑(S2101和CBB1007)對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞具有凋亡保護(hù)作用。然后建立小鼠毛細(xì)胞藥物損傷模型，采用圓窗膜局部給藥的方法在小鼠耳蝸抑制LSDl表達(dá)，利用免疫熒光化學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)證實(shí)小鼠內(nèi)耳H3K4二甲基化及凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3表達(dá)水平；利用免疫熒光化學(xué)和耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法對(duì)耳蝸存活毛細(xì)胞進(jìn)行定量研究，利用親水脂膜探針FM1-43FX檢測(cè)耳蝸毛細(xì)胞的攝取功能，采用聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)的方法檢測(cè)小鼠聽(tīng)力；結(jié)果表明，通過(guò)自身對(duì)照比較，實(shí)驗(yàn)組組蛋白H3K4 二甲基化表達(dá)水平明顯上調(diào),Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào),凋亡活動(dòng)明顯減少，耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，利用ABR聽(tīng)力檢測(cè)進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)組聽(tīng)閾較對(duì)照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此證實(shí)LSDl抑制劑可減輕毛細(xì)胞損傷，達(dá)到聽(tīng)力保護(hù)的目的，從而為感音神經(jīng)性耳聾的防治提供新的手段。
[0035]本發(fā)明的目的通過(guò)下述方法和步驟實(shí)現(xiàn)
[0036]1、建立斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷模型
[0037]本研究采用的Brn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(美國(guó)哈佛大學(xué)眼耳醫(yī)院Eaton-Peabody實(shí)驗(yàn)室)。出生后5天(5days post fertilizat1n, 5dpf)的斑馬魚(yú)暴露于含400 μ M新霉素的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)水中I小時(shí)，去除新霉素后，MS-222麻醉5分鐘，4%PFA固定2小時(shí)，DAPI染色，熒光顯微鏡觀察斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷情況。
[0038]2、利用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行藥物篩選
[0039]本實(shí)驗(yàn)主要采用S2101和CBB1007兩種小分子作為L(zhǎng)SDl抑制劑進(jìn)行藥物篩選，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分組，保持相同飼養(yǎng)條件。分別將S2101 (美國(guó)Millipore公司，溶于DMS0，儲(chǔ)存濃度為50mM)和CBB1007 (美國(guó)Millipore公司，溶于DMS0，儲(chǔ)存濃度為10mM)溶于斑馬魚(yú)飼養(yǎng)用水配置成不同終末濃度，2小時(shí)后加入含400 μ M新霉素的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)用水I小時(shí)，洗去新霉素，MS-222麻醉5分鐘、4%PFA固定2小時(shí)，熒光顯微鏡觀察側(cè)線器毛細(xì)胞存活情況。
[0040]3、建立小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷模型
[0041]I)體外模型
[0042]作為氨基糖苷類(lèi)藥物，新霉素?fù)p傷模型是研究毛細(xì)胞損傷與保護(hù)的常見(jiàn)模型之一。新霉素?fù)p傷4小時(shí)，然后洗脫24小時(shí)后就能在體外培養(yǎng)的內(nèi)耳毛細(xì)胞檢測(cè)到毛細(xì)胞的缺失。本發(fā)明選用新霉素?fù)p傷模型來(lái)進(jìn)一步研究毛細(xì)胞損傷和保護(hù)。
[0043]首先將新生小鼠耳蝸聽(tīng)覺(jué)上皮進(jìn)行分離，貼壁2小時(shí)，標(biāo)本貼壁后，加入實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M藥物的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液共培養(yǎng)24小時(shí)，再加入含ImM新霉素的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液共培養(yǎng)4小時(shí)。最后加入無(wú)血清培養(yǎng)液共培養(yǎng)24小時(shí)(圖4)。
[0044]2)體內(nèi)模型
[0045]實(shí)驗(yàn)采用自身對(duì)照設(shè)計(jì)，將小鼠左耳作為實(shí)驗(yàn)組，右耳作為對(duì)照組。在出生后P5天時(shí)，左耳圓窗給藥，右耳作為空白對(duì)照。從出生后P7天開(kāi)始，皮下注射新霉素5天，具體流程見(jiàn)圖5。
[0046]4、組蛋白H3K4 二甲基化表達(dá)水平檢測(cè)
[0047]I)按照體外培養(yǎng)方案進(jìn)行小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)，分別對(duì)其用新霉素?fù)p傷處理O分鐘、15分鐘和3小時(shí)采用免疫熒光染色檢測(cè)組蛋白表達(dá)水平，并采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)進(jìn)行半定量檢測(cè)。
[0048]2)按照體外培養(yǎng)方案進(jìn)行小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)，取對(duì)照組、S2101處理組和CBB1007處理組耳蝸基底膜，采用免疫熒光染色檢測(cè)組蛋白表達(dá)水平，并采用Western blot進(jìn)行半定量檢測(cè)。
[0049]5、凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3表達(dá)水平檢測(cè)
[0050]按照體外培養(yǎng)方案進(jìn)行小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)，分別取對(duì)照組、S2101處理組和CBB1007處理組耳蝸基底膜，新霉素?fù)p傷4小時(shí)后，采用免疫熒光染色檢測(cè)CleavedCaspase-3表達(dá)水平,并米用Western blot進(jìn)行半定量檢測(cè)。
[0051]6、檢測(cè)毛細(xì)胞對(duì)FM1-43FX攝取能力
[0052]實(shí)驗(yàn)組或者對(duì)照組預(yù)處理24小時(shí)，PBS漂洗后加入FM1-43FX，培養(yǎng)3分鐘；PBS再次漂洗，PFA固定30分鐘后附染DAPI。
[0053]7、小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè)
[0054]動(dòng)物麻醉后， 將小鼠平穩(wěn)放置于BME-421A型動(dòng)物體溫控制儀上，溫度設(shè)定為38°C，全程恒溫。由前置放大器分別引出三根已消毒的電極置于動(dòng)物皮下。其中，顱頂為采集電極，測(cè)試同側(cè)耳耳后乳突為參考電極，鼻根為接地電極。內(nèi)置揚(yáng)聲器置于動(dòng)物外耳道口內(nèi)。放置內(nèi)置揚(yáng)聲器，并用PA5進(jìn)行衰減。刺激聲選用短純音(tone burst), Blackman包絡(luò)。具體參數(shù)如下:測(cè)試頻率為8kHz、16kHz、24kHz與32kHz ;刺激頻率為21.37次/秒；采集放大倍數(shù)為20 ;持續(xù)時(shí)間為5ms ；rise-fall時(shí)間為0.5ms ;采集帶寬為0.3~3.0kHz ;疊加次數(shù)為500-1000次。測(cè)試從90dB SPL左右開(kāi)始，1dB SPL遞減，靠近閾值時(shí)5dB SPL遞減。具體閾值判斷主要以III波為準(zhǔn)，兼考察波形重復(fù)性，選擇能引起聽(tīng)反應(yīng)的最低刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾值。因揚(yáng)聲器最高輸出為10dB,當(dāng)不能引起聽(tīng)反應(yīng)時(shí)，ABR反應(yīng)閾值記錄為100dB。閾值頻率重復(fù)采集I次。
[0055]結(jié)果:
[0056]I) LSDl抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
[0057]為了排除LSDl抑制劑的毒性作用，選擇適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?。免疫熒光組織化學(xué)及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S2101 (2(^]\0和0881007 (100 μ M)處理5dpf的fcn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)2小時(shí)，毛細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異，表明本研究所采用的的LSDl抑制劑濃度對(duì)毛細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用。
[0058]對(duì)神經(jīng)丘毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用不同濃度的S2101 (5“1、1(^11和2(^10處理5dpf的Brn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)2小時(shí)，再用新霉素處理I小時(shí)，對(duì)存活毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示不同濃度S2101處理組毛細(xì)胞的數(shù)量均高于對(duì)照組，且呈濃度依賴(lài)性(圖2，Ρ〈0.05, Kruskal - Wallis one-way ANOVA of ranks 和 Dunn，s test)。
[0059]進(jìn)一步用另一種LSDl抑制劑驗(yàn)證毛細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的有效性和特異性，使用不同濃度的CBB1007(20 μ Μ、50 μ M和100 μ Μ)進(jìn)行同樣的處理，結(jié)果顯示不同濃度CBB1007處理組毛細(xì)胞的數(shù)量均高于對(duì)照組，且呈濃度依賴(lài)性(圖2)。
[0060]2) LSDl抑制劑對(duì)小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的體外保護(hù)作用
[0061]將體外培養(yǎng)的耳蝸組織分為三組:即新霉素，S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組。從免疫熒光染色結(jié)果提示，S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組毛細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，尤其在中圈和底圈。計(jì)數(shù)結(jié)果也表明S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組的中圈、底圈毛細(xì)胞存活情況明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈0.01)(圖 4)。
[0062]3)損傷導(dǎo)致毛細(xì)胞Η3Κ4 二甲基化表達(dá)明顯下調(diào)
[0063]免疫組化結(jié)果提示:正常組耳蝸組蛋白H3K4me2有一定強(qiáng)度表達(dá)；新霉素?fù)p傷后耳蝸毛細(xì)胞H3K4me2表達(dá)強(qiáng)度明顯下調(diào)。為了半定量驗(yàn)證新霉素?fù)p傷對(duì)H3K4me2表達(dá)的影響，Western blot及灰度分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),新霉素?fù)p傷組組蛋白H3K4me2 (17kDa)表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)(圖6)。
[0064]4) LSDl抑制劑能夠有效抑制耳蝸毛細(xì)胞的凋亡
[0065]線粒體釋放細(xì)胞色素C后可激活CaSpaSe9/CaSpaSe3信號(hào)途徑引起傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組)和對(duì)照組(新霉素處理組)均出現(xiàn)Cleaved Caspase-3染色陽(yáng)性細(xì)胞，以中底圈表達(dá)尤為明顯。為了進(jìn)一步定量Cleaved Caspase-3的表達(dá)，Westernblot及灰度分析結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有Cleaved Caspase-3表達(dá),對(duì)照組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。小鼠耳蝸損傷后,Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著升高,并且在LSDl抑劑處理后Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著降低，表明LSDl抑制劑對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用可能通過(guò)Capase-3經(jīng)典內(nèi)源性凋亡通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的(圖8)。
[0066]5) LSDl抑制劑不影響毛細(xì)胞對(duì)氨基糖苷類(lèi)的攝取功能
[0067]FM1-43FX是用來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)吞和胞吐作用的苯乙烯基染料，目前在毛細(xì)胞研究中可以作為毛細(xì)胞功能的標(biāo)記物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LSDl抑制劑是否影響毛細(xì)胞的功能狀態(tài)，我們檢測(cè)LSDl抑制劑預(yù)處理后的毛細(xì)胞對(duì)FM1-43FX的攝取能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LSDl抑制劑不影響毛細(xì)胞對(duì)FM1-43FX的攝取能力(圖9)。
[0068]6) LSDl抑制劑對(duì)新霉素致小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的體內(nèi)保護(hù)作用
[0069]以Phaollidine缺失作為毛細(xì)胞纖毛缺失的標(biāo)準(zhǔn)，Phaollidine與DAPI共染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)胞纖毛損傷情況實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組。以Myosin7a缺失作為毛細(xì)胞缺失的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，整體觀上，實(shí)驗(yàn)組(S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組)Myosin7a陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(新霉素處理組)。我們將基底膜分為頂圈、中圈和地圈進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ABR結(jié)果顯示，高頻聽(tīng)力損傷明顯高于低頻聽(tīng)力損傷，對(duì)照組聽(tīng)力損傷明顯高于實(shí)驗(yàn)組。其中，S2101-新霉素處理組聽(tīng)閾在24kHz和32kHz上較對(duì)照組降低10_20dB，CBB1007-新霉素處理組聽(tīng)閾在24kHz和32kHz上較對(duì)照組降低10dB，差異顯著性差異(P〈0.05)(圖10)。
[0070] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0071]本發(fā)明所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料，其中:
[0072]本研究采用的Brn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)來(lái)自美國(guó)哈佛大學(xué)眼耳醫(yī)院Eaton-Peabody實(shí)驗(yàn)室。C57BL/6J小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；嚙齒類(lèi)動(dòng)物普通飼料(復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部XABR檢測(cè)采用復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室TDTSystem3apparatus 設(shè)備檢測(cè)(Tucker Davies Technologies, Gainesville, FL, USA);蛋白提取試劑盒(AllPr印DNA/RNA/Protein Mini Kit)購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司；麻醉藥MS-222、新霉素均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；S2101和CBB1007購(gòu)于Millipore公司；親水脂膜探針FM1-43FX 購(gòu)于 Eugene 公司；H3K4me2 抗體購(gòu)于 Abcam 公司；cleaved caspase-3 抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology 公司；rhodamine_phalloidin 購(gòu)于 Invitrogen 公司；myosinVila 抗體購(gòu)于 Proteus B1sciences 公司。
[0073]實(shí)施例1建立斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷模型
[0074]本研究采用的Brn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(美國(guó)哈佛大學(xué)眼耳醫(yī)院Eaton-Peabody實(shí)驗(yàn)室)。斑馬魚(yú)在28.5°C恒溫環(huán)境中生長(zhǎng)，光周期為14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗，養(yǎng)殖方案按照《Zebrafish Book》(http://www.zfin.0rg)常規(guī)進(jìn)行。具體操作如下:
[0075]①將出生后5天(5days post fertilizat1n, 5dpf )斑馬魚(yú)暴露于含400 μ M新霉素的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)水中I小時(shí)；
[0076]②在新鮮的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)水中漂洗3次；
[0077]③0.02% 的 MS-222 麻醉 5min ；
[0078]④4%多聚甲醛室溫固定2h ；
[0079]?0.011\^85漂洗511^11\3;
[0080]⑥1:800DAPI 室溫 20min ；
[0081]⑦封片，熒光顯微鏡觀察斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷情況，如圖1所示，新霉素?fù)p傷后斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞顯著減少，存活毛細(xì)胞數(shù)量為1.0±0.64。
[0082]實(shí)施例2利用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行藥物篩選
[0083]1)S2101-新霉素處理:斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至5dpf進(jìn)行加藥處理:包括對(duì)照組(DMS020yM)和S2101實(shí)驗(yàn)組(5 μ M、10 μ Μ、20 μ M)。藥物處理2h后加入新霉素?fù)p傷Ih(400 μ Μ),新鮮的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)水中漂洗3次，MS-222麻醉5min，4%多聚甲醛室溫固定2h ；0.01M PBS漂洗5minX 3 ; 1:800DAPI室溫20min ;封片，熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，觀察側(cè)線器毛細(xì)胞存活情況。其中η = 50-70，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析(圖2)。
[0084]2) CBB1007-新霉素處理:斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至5dpf進(jìn)行加藥處理:包括對(duì)照組(DMSOlOOyM)和CBB1007實(shí)驗(yàn)組(20 μ Μ、50 μ M、100 μ M)。藥物處理2小時(shí)后加入新霉素?fù)p傷Ih (400 μ Μ)，新鮮的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)水中漂洗3次，MS-222麻醉5min，4%多聚甲醛室溫固定2h ；0.01M PBS漂洗5minX3 ;1:800DAPI室溫20min ;封片，熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。其中η = 50-70，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析(圖2)。
[0085]實(shí)施例3建立小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷模型
[0086]I)體外模型
[0087]①新生小鼠耳蝸聽(tīng)覺(jué)上皮的分離
[0088]②新生小鼠聽(tīng)覺(jué)上皮的體外組織培養(yǎng)
[0089]③藥物處理
[0090]將新生小鼠耳蝸聽(tīng)覺(jué)上皮進(jìn)行分離，貼壁2小時(shí)，標(biāo)本貼壁后，加入含S2101或CBB1007的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液共培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入含ImM新霉素的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液共培養(yǎng)4小時(shí)。無(wú)血清DMEM/F12漂洗3次。最后加入無(wú)血清培養(yǎng)液共培養(yǎng)24小時(shí)，耳蝸基底膜毛細(xì)胞損傷模型呈現(xiàn)由底圈到頂圈的損傷梯度變化(圖3，底圈嚴(yán)重，頂圈輕微)。
[0091]2)體內(nèi)模型
[0092]實(shí)驗(yàn)采用自身對(duì)照設(shè)計(jì)，將小鼠左耳作為實(shí)驗(yàn)組，右耳作為對(duì)照組。在出生后P5天時(shí)，左耳圓窗給藥，右耳作為空白對(duì)照。從出生后P7天開(kāi)始，皮下注射新霉素5天，具體流程見(jiàn)圖5。
[0093]①手術(shù)給藥:P5天小鼠放置冰上麻醉2min，將麻醉好的小鼠放置在手術(shù)顯微鏡下，側(cè)臥位，使左耳朝向術(shù)者。術(shù)區(qū)用碘伏消毒后在周?chē)采w無(wú)菌巾(后部)及無(wú)菌紗布?jí)K(前、上、下方)。切開(kāi)耳后皮膚，注意勿損傷皮下的血管，切開(kāi)皮膚后可以看到面靜脈，將面靜脈推向一側(cè)，鈍性分離皮下肌肉和組織，直到看到聽(tīng)泡，將聽(tīng)泡上的軟組織鈍性剝離，用小的眼科剪刀，將聽(tīng)泡打開(kāi)，暴露圓窗龕，將浸有目的藥物的約Imm3大小明膠海綿放置在圓窗龕上，注意不要損傷中耳結(jié)構(gòu)，包括聽(tīng)小骨、鐙骨上動(dòng)脈等?？p合切口。切口表面涂安爾碘。
[0094]②新霉素皮下注射:使用新霉素干粉與注射用水配置濃度為20mg/ml的新霉素溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，充分混勻后使用微量注射器以lOul/g的劑量對(duì)P7天小鼠進(jìn)行背部皮下注射，以達(dá)到200mg/kg的新霉素注射濃度。每天早上10點(diǎn)注射I次,連續(xù)進(jìn)行5天。
[0095]實(shí)施例4組蛋白H3K4 二甲基化表達(dá)水平檢測(cè)
[0096]I)按照體外培養(yǎng)方案進(jìn)行小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)，分別對(duì)其用新霉素?fù)p傷處理O分鐘、15分鐘和3小時(shí)采用免疫熒光染色檢測(cè)組蛋白表達(dá)水平，并采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)進(jìn)行半定量檢測(cè)，新霉素組H3K4me2 (17kDa)表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組明顯減弱，如圖6所示。
[0097]2)按照體外培養(yǎng)方案進(jìn)行小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)，取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組、S2101處理組和CBB1007處理組耳蝸基底膜24小時(shí)，漂洗后新霉素?fù)p傷4小時(shí)，采用免疫熒光染色檢測(cè)組蛋白表達(dá)水平，并采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)進(jìn)行半定量檢測(cè),S2101處理組和CBB1007處理組H3K4me2 (17kDa)表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，如圖7所示。
[0098]實(shí)施例5毛細(xì)胞凋亡檢測(cè)
[0099]I)免疫突光標(biāo)記 Cleaved Caspase-3 和 DAPI (圖 8)；
[0100]①0.01]\^85漂洗5111丨11\3，放入？85+0.l%Triton X_10037°C通透 40min
[0101]②10% 的驢血清室溫下封閉 30min,加入一抗 Cleave Caspase-3 (1:200, Rabbit),4°C過(guò)夜；
[0102]③0.01M PBS 漂洗 5minX3 次，加入二抗:1:200Alexa Fluor533donkeyant1-rabbit,37°C Ih ；
[0103]④0.01M PBS 漂洗 5minX3 次，加入 1:1000DAPI, RT40min ；0.01M PBS 漂洗，5minX3次，抗淬滅劑封片。
[0104]2) Western blot 定量檢測(cè) Cleaved Caspase-3 表達(dá)(圖 8)；
[0105]①總蛋白提取(AllPrepDNA/RNA/Protein Mini Kit, QIAGEN, Hilden, Germany)
[0106]a.每組12個(gè)基底膜，用超聲勻漿器在冰上將組織充分研磨(350 μ I RLT+3.5 μ I β巰基乙醇)，4°C, 1200rpm,離心 3min。
[0107]b.上清液加入Allprep DNA spin column收集管(紫色柱子)中。1000rpm離心30s。
[0108]c.濾過(guò)液加入250ml無(wú)水乙醇，充分混勻，加入到RNeasy spin column中，1000rpm 離心 15s。
[0109]d.濾過(guò)液中加入通常Buffer ΑΡΡ600μ I。用力混勻，室溫中靜置1min,以使蛋白沉淀。1000rpm,離心10min。丟棄上清液。
[0110]e.在蛋白顆粒中加入500ul70%的乙醇，最大速度離心lmin，移除上清液。
[0111]室溫放置5至lOmin。
[0112]f.加入100 μ I buffer ALO,充分混勻溶解。
[0113]g.95°C加熱5min以使蛋白完全溶解及變性。隨后冷卻樣本。最大速度離心lmin。取上層-20°C保存。
[0114]h.用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。
[0115]②蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)
[0116]1.制備分離膠和濃縮膠。
[0117]b.調(diào)整蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100°C水浴5min ;將蛋白質(zhì)用微量加樣器在加樣孔內(nèi)加樣。
[0118]c.蓋好保護(hù)罩，接通電源，以80V的電壓電泳至溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，提d.高電壓為110V，直至溴酚藍(lán)電泳至膠底。
[0119]e.電泳結(jié)束后，切下目的蛋白所處凝膠區(qū)域，將其用轉(zhuǎn)膜緩沖液(2.9gGlycine+5.8g Tris+800ml ddH20+200ml 甲醇)漂洗；按“三明治法”裝好轉(zhuǎn)膜裝置，100V，2h。
[0120]f.轉(zhuǎn)膜后取下PVDF膜，在盛有封閉液(5%脫脂奶粉)的玻璃皿中室溫平緩搖動(dòng)1-2h。
[0121]g.用封閉液將兔抗一抗1:1500稀釋成1.5ml，加入塑料袋，放入PVDF膜，趕走氣泡，用封口機(jī)封口，4°C過(guò)夜。二抗(1:2000)室溫孵育lh，PBST漂洗4X15min ;
[0122]h.將PVDF在事先混合好的ECL試劑中孵育5min，然后將PVDF膜置于顯色暗盒，進(jìn)入暗室用X光膠片曝光、顯影，調(diào)節(jié)顯、定影時(shí)間以使顯影效果最佳。
[0123]實(shí)施例6毛細(xì)胞對(duì)FM1-43FX攝取能力檢測(cè)
[0124]I)實(shí)驗(yàn)組或者對(duì)照組預(yù)處理24h ；
[0125]2)溫的PBS漂洗2次，5min每次；
[0126]3 )加入 FM1-43FX，培養(yǎng) 3min ；
[0127]4) PBS漂洗5minX2次，PFA固定30min后附染DAPI，結(jié)果如圖9所示。
[0128]實(shí)施例7小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè)
[0129]動(dòng)物麻醉:氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(4:1) (25mg/kg)的混合麻藥腹腔注射以全身麻醉。待小鼠的角膜反射、疼痛反射均消失，呼吸緩慢平穩(wěn)后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0130]測(cè)量環(huán)境:安靜(環(huán)境噪聲小于20dB SPL)屏蔽室內(nèi)，外置揚(yáng)聲器ESl由TDT本身設(shè)備及程序校準(zhǔn)，并用PA5進(jìn)行衰減。
[0131]將小鼠平穩(wěn)放置于BME-421A型動(dòng)物體溫控制儀上，溫度設(shè)定為38°C，全程恒溫。由前置放大器分別引出三根已消毒的電極置于動(dòng)物皮下。其中，顱頂為采集電極，測(cè)試同側(cè)耳耳后乳突為參考電極，鼻根為接地電極。內(nèi)置揚(yáng)聲器置于動(dòng)物外耳道口內(nèi)。
[0132]刺激聲選用短純音(tone burst), Blackman包絡(luò)。具體參數(shù)如下:測(cè)試頻率為8kHz、16kHz、24kHz與32kHz ;刺激頻率為21.37次/秒；采集放大倍數(shù)為20 ;持續(xù)時(shí)間為5ms ；rise-fall時(shí)間為0.5ms ;采集帶寬為0.3~3.0kHz ;疊加次數(shù)為500-1000次。測(cè)試從90dB SPL左右開(kāi)始，1dB SPL遞減，靠近閾值時(shí)5dB SPL遞減。具體閾值判斷主要以III波為準(zhǔn)，兼考察波形重復(fù)性，選擇能引起聽(tīng)反應(yīng)的最低刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾值。因揚(yáng)聲器最高輸出為10dB,當(dāng)不能引起聽(tīng)反應(yīng)時(shí)，ABR反應(yīng)閾值記錄為100dB。閾值頻率重復(fù)采集I次。
[0133]實(shí)施例1-7實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
[0134]結(jié)果:
[0135]I) LSDl抑制劑對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
[0136]為了排除LSDl抑制劑的毒性作用，選擇適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?。免疫熒光組織化學(xué)及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S2101 (2(^]\0和0881007 (100 μ M)處理5dpf的fcn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)2小時(shí)，毛細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異，表明本研究所采用的的LSDl抑制劑濃度對(duì)毛細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用(圖2)。
[0137]對(duì)神經(jīng)丘毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用不同濃度的S2101 (5 4 11、1(^11和2(^10處理5dpf的Brn3c:mGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)2小時(shí)，再用新霉素處理I小時(shí)，對(duì)存活毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示不同濃度S2101處理組毛細(xì)胞的數(shù)量均高于對(duì)照組，且呈濃度依賴(lài)性(圖2，Ρ〈0.05, Kruskal - Wallis one-way ANOVA of ranks 和 Dunn，s test)。
[0138]進(jìn)一步用另一種LSDl抑制劑驗(yàn)證毛細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的有效性和特異性，使用不同濃度的CBB1007(20 μ Μ、50 μ M和100 μ Μ)進(jìn)行同樣的處理，結(jié)果顯示不同濃度CBB1007處理組毛細(xì)胞的數(shù)量均高于對(duì)照組，且呈濃度依賴(lài)性(圖2)。
[0139]2) LSDl抑制劑對(duì)小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的體外保護(hù)作用
[0140]將體外培養(yǎng)的耳蝸組織分為三組:即新霉素，S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組。從免疫熒光染色結(jié)果提示，S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組毛細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，尤其在中圈和底圈。計(jì)數(shù)結(jié)果也表明S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組的中圈、底圈毛細(xì)胞存活情況明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈0.01)(圖 4)。
[0141]3)損傷導(dǎo)致毛細(xì)胞Η3Κ4 二甲基化表達(dá)明顯下調(diào)
[0142]免疫組化結(jié)果提示:正常組耳蝸組蛋白H3K4me2有一定強(qiáng)度表達(dá)；新霉素?fù)p傷后耳蝸毛細(xì)胞H3K4me2表達(dá)強(qiáng)度明顯下調(diào)。為了半定量驗(yàn)證新霉素?fù)p傷對(duì)H3K4me2表達(dá)的影響，Western blot及灰度分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),新霉素?fù)p傷組組蛋白H3K4me2 (17kDa)表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)(圖6)。
[0143]4) LSDl抑制劑能夠有效抑制耳蝸毛細(xì)胞的凋亡
[0144]線粒體釋放細(xì)胞色素C后可激活CaSpaSe9/CaSpaSe3信號(hào)途徑引起傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組)和對(duì)照組(新霉素處理組)均出現(xiàn)Cleaved Caspase-3染色陽(yáng)性細(xì)胞，以中底圈表達(dá)尤為明顯。為了進(jìn)一步定量Cleaved Caspase-3的表達(dá)，Westernblot及灰度分析結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有Cleaved Caspase-3表達(dá),對(duì)照組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。小鼠耳蝸損傷后,CleavedCaspase-3表達(dá)顯著升高,并且在LSDl抑劑處理后Cleaved Caspase-3表達(dá)顯著降低，表明LSDl抑制劑對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用可能通過(guò)Capase-3經(jīng)典內(nèi)源性凋亡通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的(圖8)。
[0145]5) LSDl抑制劑不影響毛細(xì)胞對(duì)氨基糖苷類(lèi)的攝取功能
[0146]FM1-43FX是用來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)吞和胞吐作用的苯乙烯基染料，目前在毛細(xì)胞研究中可以作為毛細(xì)胞功能的標(biāo)記物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LSDl抑制劑是否影響毛細(xì)胞的功能狀態(tài)，檢測(cè)LSDl抑制劑預(yù)處理后的毛細(xì)胞對(duì)FM1-43FX的攝取能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LSDl抑制劑不影響毛細(xì)胞對(duì)FM1-43FX的攝取能力(圖9)。
[0147]6) LSDl抑制劑對(duì)新霉素致小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的體內(nèi)保護(hù)作用
[0148]以Phaollidine缺失作為毛細(xì)胞纖毛缺失的標(biāo)準(zhǔn)，Phaollidine與DAPI共染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)胞纖毛損傷情況實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組。以Myosin7a缺失作為毛細(xì)胞缺失的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，整體觀上，實(shí)驗(yàn)組(S2101-新霉素處理組和CBB1007-新霉素處理組)Myosin7a陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(新霉素處理組)。將基底膜分為頂圈、中圈和地圈進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ABR結(jié)果顯示，高頻聽(tīng)力損傷明顯高于低頻聽(tīng)力損傷，對(duì)照組聽(tīng)力損傷明顯高于實(shí)驗(yàn)組。其中，S2101-新霉素處理組聽(tīng)閾在24kHz和32kHz上較對(duì)照組降低10_20dB，CBB1007-新霉素處理組聽(tīng)閾在24kHz上較對(duì)照組降低15dB，差異顯著性差異(P〈0.05)(圖10)。
[0149] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑的用途，其特征在于，用于: (i)制備預(yù)防和/或治療感音神經(jīng)性聾的藥物或藥物組合物；或 (?)制備保護(hù)感音神經(jīng)性聾患者聽(tīng)力的藥物或藥物組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑提高耳蝸毛細(xì)胞中的組蛋白H3K4 二甲基表達(dá)水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑能夠降低耳蝸毛細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3表達(dá)水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述感音神經(jīng)性聾是氨基糖苷類(lèi)藥物致感音神經(jīng)性聾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑選自:小分子藥物S2101、小分子藥物CBB1007。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物或藥物組合物通過(guò)全身或圓窗局部給藥方式施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物包含所述賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶I抑制劑以 及藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61P27/16GK104042616SQ201410058438
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】李華偉, 于慧前, 何英姿, 孫珊, 黎奧, 柴人杰 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院