表達l-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒、工程菌及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒、工程菌及應用。該基因來自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032，用PCR從谷氨酸棒狀桿菌基因組DNA中擴增獲得。L-賴氨酸轉運蛋白基因的兩端分別添加EcoRI和HindIII限制性酶切位點，和用相同的限制性內切酶進行酶切后的pKk223-3連接并轉化，篩選，提質粒，電轉化到谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032中，實現了在谷氨酸棒狀桿菌中轉運蛋白基因的倍增，表達產物L-賴氨酸轉運蛋白分子量為25081.9Da。該重組L-賴氨酸轉運蛋白或表達該重組轉運蛋白的工程菌可以將L-賴氨酸由細胞內轉運到細胞外，具有轉運效率高，轉運速度快，提高L-賴氨酸產率的優(yōu)點。
【專利說明】表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒、工程菌及應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，尤其涉及表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒、工程菌及應用。
【背景技術】
[0003]L-賴氨酸,屬于天冬氨酸族氨基酸(L-aspartate family amino acids, AFAAS),包括L-賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸4種氨基酸，均為必需氨基酸)，是人類和動物必需氨基酸，自身不能合成的氨基酸之一，必須從體外攝取。具有多種生理功能，廣泛應用于食品、醫(yī)藥以及飼料添加劑等。L-賴氨酸是蛋白質組成中必不可少的一個組成部分。作為營養(yǎng)元素，對人體的成長和發(fā)展的作用是明顯的。它還是產生肉堿的一個重要組分，而肉堿可以將部分不飽和脂肪酸轉化為能量，進一步降低膽固醇水平。在人體中，L-賴氨酸的功能是多種的，可以組成膠原蛋白，膠原蛋白負責結締組織，肌肉，骨骼，肌腱，軟關節(jié)等的組成。在鈣的吸收方面，L-賴氨酸的作用也是明顯的。
[0004]合成方法主要有:提取法，以動物血粉為原料，再從蛋白質水解物中，用離子交換法或苦味酸沉淀法分離提取L-賴氨酸；化學合成法，以化學物質為原料合成L-賴氨酸。主要運用的工藝是DSM法和東麗法，使用原料是己內酰胺和環(huán)己烯；酶合成法，以己內酰胺或二氫呋喃為起始原料，借助于有機合成與生物化學工程相結合的生產技術來生產L-賴氨酸；微生物發(fā)酵法，常以淀粉、甘蔗或甜菜制糖后的廢糖蜜為原料，產生的L-賴氨酸都是L型，是目前工業(yè)上生產L-賴氨酸的最主要方法。
[0005]L-賴氨酸代謝工程`育種主要體現在大腸桿菌和棒狀桿菌(如谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌等)，而解析L-賴氨酸生物合成途徑和關鍵酶基因序列是構建高產L-賴氨酸工程菌的前提和基礎。
[0006]L-賴氨酸在細胞內部積累會對天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合酶產生反饋抑制。天冬氨酸激酶(簡稱AK)，可分為AK-1，AK-1I，AK-1II，這三種酶為同工酶，都具有將L-天冬氨酸轉化成L-天冬氨酸-β-磷酸的功效。其中AK-1 ,AK-1I為復合酶，均帶有高絲氨酸脫氫酶，高絲氨酸脫氫酶可將L-賴氨酸生物合成的前體物質天冬氨酸半醛轉化成L-高絲氨酸，與L-賴氨酸搶奪資源。AK-1II是單功能酶，為IysC基因的產物，受到L-賴氨酸產物抑制，是L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)中的第二限速酶。二氫吡啶二羧酸合酶(簡稱DDPS)，也有翻譯做二氫吡啶甲酸合酶，將天冬氨酸-β -半醛與丙酮酸脫水縮合生成二氫吡啶二羧酸，此酶負責L-賴氨酸合成系統(tǒng)中重要的調控位點，是L-賴氨酸生物合成的第一限速酶，受到L-賴氨酸反饋抑制與阻遏。
[0007]在發(fā)酵過程中，伴隨著菌體的大量生長和菌體代謝的加快，L-賴氨酸也在細胞內不斷地積累，加劇對天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合酶的反饋抑制。對合成途徑中從天冬氨酸到L-賴氨酸的代謝流進行了限制，也限制了 L-賴氨酸的進一步發(fā)酵積累。
【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于，克服現有技術的不足，提供了表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒、工程菌及應用。解決了現有技術存在的L-賴氨酸運送不足的問題。
[0009]表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒pkk-E，其氨基酸序列為SEQ ID N0.3所示。
[0010]一種工程菌，該菌株AT-pkk-E-DE為谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.8183，保藏時間為2013年9月13日，由表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒pkk_E轉化谷氨酸棒桿菌獲得。
[0011]表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒pkk-E在制備L-賴氨酸中的應用。
[0012]谷氨酸棒工程菌在制備L-賴氨酸中的應用。
[0013]利用PCR方法篩選克隆出谷氨酸棒狀桿菌L-賴氨酸轉運蛋白基因。
[0014]谷氨酸棒桿菌L-賴氨酸轉運蛋白基因，該基因的DNA序列為SEQ ID N0.1,全長702bp，來自保藏菌株編號為1.1886 (菌株別號為ATCC13032)的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum),在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏,該基因是一個已經報道的DNA序列，從NCBI數據庫獲得，其堿基組成特征如下表1所示:
表 I 谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 L-賴氨酸轉運蛋白基因組成特征:
【權利要求】
1.表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒pkk-E，其氨基酸序列為SEQID N0.3所示。
2.一種工程菌,該菌株AT-pkk-E-DE為谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8183，保藏時間為2013年9月13日，由表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒pkk-E轉化谷氨酸棒桿菌獲得。
3.權利要求1所述的表達L-賴氨酸轉運蛋白的重組質粒pkk-E在制備L-賴氨酸中的應用。
4.權利要求2所述的谷氨酸棒工程菌在制備L-賴`氨酸中的應用。
【文檔編號】C12N15/77GK103695454SQ201310694012
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權日:2013年12月18日
【發(fā)明者】高世軍, 劉德玉, 唐春輝, 朱艷敏 申請人:山東壽光巨能金玉米開發(fā)有限公司