專利名稱：一種多重巢式甲基化特異性pcr檢測(cè)試劑盒及其使用方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測(cè)試劑盒及其使用方法，以及在檢測(cè)卵巢癌，特別是早期卵巢癌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌癥死亡女性患者3%。卵巢癌90%以上為上皮性卵巢癌，發(fā)病隱匿，臨床確診時(shí)約80%患者疾病已為晚期，預(yù)后差。晚期卵巢癌(FIGO II -IV期)患者5年生存率僅為30 45%，而早期卵巢癌(FIG0 I期)患者5年生存率高達(dá)90%以上。因此，除積極尋找新的有效的治療方式外，探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，研發(fā)新型卵巢癌早期診斷技術(shù)迫在眉睫。
現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)簡(jiǎn)便有效的、精確的、可常規(guī)用于卵巢癌早期診斷的檢測(cè)方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌標(biāo)志物，但僅有50 60%的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特異性較差，卵巢癌陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅有109^35%?？傮w而言，對(duì)于血清CA125檢測(cè)、經(jīng)陰道超聲探查等傳統(tǒng)的早期診斷方法單一或聯(lián)合應(yīng)用，目前均無(wú)證據(jù)顯示可降低人群的卵巢癌發(fā)病率和(或)病死率。其主要原因在于這些方法的假陰性或假陽(yáng)性率均過(guò)高，敏感性和特異性達(dá)不到臨床需要。DNA甲基化即未甲基化胞卩密唳-憐酸-鳥(niǎo)嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine，CpG) 二核苷酸發(fā)生甲基化，是重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，是腫瘤抑制基因失活的關(guān)鍵機(jī)制之一，在某些情況下可能是唯一的機(jī)制。目前研究已證實(shí)原發(fā)性卵巢癌可有多種抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌顯示出CpG島甲基化表型。作為癌癥發(fā)生的早期事件，抑癌基因DNA異常甲基化檢測(cè)可以在患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)或者影像學(xué)證據(jù)之前做到分子診斷，為卵巢癌的早期診斷提供了新的途徑。目前，研究已證實(shí)癌癥患者血清富含腫瘤DNA (Serum free circulating DNA,SfcDNA)，可用于癌癥分子生物學(xué)診斷。使用體液標(biāo)本(血清、尿液等)檢測(cè)其中游離腫瘤特異DNA在其他癌癥如肺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等已被證實(shí)可行。更為重要的是，腫瘤游離DNA不僅在晚期轉(zhuǎn)移癌癥患者血清內(nèi)存在，對(duì)于早期患者，血清內(nèi)同樣可檢測(cè)到腫瘤游離DNA，研究認(rèn)為其來(lái)源于侵入體內(nèi)循環(huán)但無(wú)浸潤(rùn)機(jī)體實(shí)質(zhì)器官能力的腫瘤細(xì)胞，或是由凋亡腫瘤細(xì)胞釋放進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)。因此，利用血清游離DNA (SfcDNA)進(jìn)行癌癥的早期分子生物學(xué)診斷是當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)。雖然國(guó)內(nèi)外研究者利用卵巢癌患者血清游離DNA甲基化檢測(cè)，在卵巢癌早期診斷中的研究取得了令人振奮的進(jìn)步，但是在實(shí)際操作過(guò)程中存在以下局限性1、血清游離DNA微量(正常人濃度平均為0. 03ug/ml，腫瘤患者濃度平均為0. 18ug/ml )，并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的難度，降低了臨床檢測(cè)的敏感性和特異性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法為甲基化特異性PCR (Methylation Specific PCR，MSP)，其操作繁瑣，DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后丟失嚴(yán)重，一般只用于單個(gè)基因檢測(cè)，特異性和敏感性均較低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不確定性及血清游離DNA的局限性，導(dǎo)致單一卵巢癌甲基化標(biāo)記物檢測(cè)無(wú)法滿足臨床要求。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測(cè)試劑盒及其使用方法，以及其在檢測(cè)卵巢癌，特別是早期卵巢癌中的應(yīng)用。本發(fā)明的多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測(cè)技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外首次將多重PCR (Multiplex PCR)、巢式PCR (Nested PCR)與甲基化特異性PCR (MSP)相結(jié)合，利用課題組開(kāi)發(fā)的引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)全新的PCR引物，并模擬整個(gè)PCR過(guò)程，避免PCR過(guò)程中引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等的形成，同時(shí)創(chuàng)新性的應(yīng)用兩步爬坡緩慢退火(Ramping anneal)的方法,保證引物與模板結(jié)合的特異性，最大限度地克服了血清游離DNA微量及單一甲基化標(biāo)記物敏感性、特異性不高的缺點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)最低達(dá)l/8000ug DNA (約相當(dāng)于19個(gè)基因組DNA)中7個(gè)目的基因甲基化狀態(tài)的高效檢測(cè)，并經(jīng)臨床標(biāo)本反復(fù)驗(yàn)證，對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)提供了有力補(bǔ)充，成為一種有效的早期卵巢癌診斷檢測(cè)手段。 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種多重巢式甲基化特異性PCR檢測(cè)試劑盒，由以下物質(zhì)組成①針對(duì)7 種目的基因 APC, RASSF1A, CDHl, RUNX3, TFPI2, SFRP5 和 OPCML 的引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 42所示，如表I所示；每條引物的濃度為lmmol/L，用量為Iul ；②常規(guī)PCR 工作液，比如PCR 工作液 2X(MIX):2U AmpliTaqt 360DNA Polymerase ；40mM Tris-HCL (pH8. 8) ；20mM KCL ；20mM (NH4)2SO4 ；4mM MgSO4 ；1. 6mM dNTPs。表I.多重巢式甲基化特異性PCR (MN-MSP)檢測(cè)引物(說(shuō)明引物中存在簡(jiǎn)并位點(diǎn)(degeneration)，即Y=C/T,R=G/A)
權(quán)利要求
1.ー種多重巢式甲基化特異性PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于由以下物質(zhì)組成 ①針對(duì)7種目的基因APC,RASSF1A, CDHl, RUNX3, TFPI2, SFRP5和OPCML的引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 42所示； ②常規(guī)PCR工作液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種多重巢式甲基化特異性PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在干所述每條引物的濃度為lmmol/L，用量為Iul ;所述PCR工作液為PCR工作液2X:·2U AmpIiTaq* 360DNA Polymerase ；40mM Tris-HCL ；20mMKCL ；20mM(NH4)2SO4 ；4mM MgSO4 ；·I.6mM dNTPs。
3.權(quán)利要求I或2所述的多重巢式甲基化特異性PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于 步驟如下 (1)血清游離DNA的提取取患者血清，提取DNA，得DNA溶液； (2)血清游離DNA甲基化修飾取DNA溶液，進(jìn)行甲基化修飾，得修飾后DNA溶液； (3)PCR 檢測(cè) Stepl PCR 反應(yīng)體系------Outside 模板lul------修飾后DNA溶液； 引物lul------7種目的基因Outside Primer按照等比例混合；MIX 10ul ；Enhancer 2ul ；ddH20 6ul ； PCR反應(yīng)條件------Outside · 95 °CSmin·95 0C30sI ·50*0Imin·50*C-60pC0.2*C/s V 35 循環(huán)·60V10s··72 °C45s j ·ITCIOmin ·4°CForever St印2 PCR反應(yīng)體系------Inside 模板lul------取St印I產(chǎn)物DNAlul ； 引物lul------7種目的基因Inside Primer按照等比例混合；MIX 10ul ；Enhancer 2ul ；ddH20 6ul ； PCR反應(yīng)條件------Inside ·95 °CSmin ·95 0C30s、 ·50 °CImin ·50V-60V O.rC/s I 25 循環(huán) ·60 0C15s ·72 "C30sj ·72 °CIOmin ·4°CForever； (4)PCR結(jié)果判斷取St印2所得產(chǎn)物10ul，4%瓊脂糖凝膠中150v電泳90min，凝膠放置凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析，肉眼判斷反應(yīng)結(jié)果 ①若M體系中出現(xiàn)任ー陽(yáng)性條帶，判定結(jié)果為陽(yáng)性； ②若M體系中無(wú)陽(yáng)性條帶，U體系中出現(xiàn)任ー陽(yáng)性條帶，判定結(jié)果為陰性； ③若M、U體系中均無(wú)陽(yáng)性條帶，判定送檢血清不合格，重新送檢。
4.權(quán)利要求I或2所述的多重巢式甲基化特異性PCR檢測(cè)試劑盒在早期上皮性卵巣癌診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種多重巢式甲基化特異性PCR檢測(cè)試劑盒，由以下物質(zhì)組成①核苷酸序列如SEQ ID NO.1～42所示的引物；②PCR工作液。所述多重巢式甲基化特異性PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，步驟如下(1)取患者血清提取DNA；(2)取DNA溶液，進(jìn)行甲基化修飾；(3)使用試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)；(4)結(jié)果判斷取所得產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠放置凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析，肉眼判斷反應(yīng)結(jié)果。本發(fā)明的多重巢式甲基化特異性PCR(MN-MSP)檢測(cè)技術(shù)，最大限度地克服了血清游離DNA微量及單一甲基化標(biāo)記物敏感性、特異性不高的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)7個(gè)目的基因甲基化狀態(tài)的高效檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種有效的早期上皮性卵巢癌診斷檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102732637SQ20121024864
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者孔北華, 張青 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院