專利名稱：利用雷帕霉素特異性甲基化酶標記雷帕霉素的制作方法
背景技術(shù)：
雷帕霉素是一種由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)產(chǎn)生的大環(huán)三烯抗生素，發(fā)現(xiàn)其不論是在體外還是在體內(nèi)均具有抗真菌活性，特別是抗白色假絲酵母(Candida albicans)[C.Vezina等人，J.Antibiot.28，721(1975)；S.N.Sehgal等人，J.Antibiot.28，727(1975)；H.A.Baker等人，J.Antibiot.31，539(1978)；美國專利號3,929,992；以及美國專利號3,993,749]。雷帕霉素的免疫抑制作用已經(jīng)得到闡述。另一種大環(huán)分子FK-506也已經(jīng)顯示為一種免疫抑制劑。這些化合物也已顯示出對各種其他治療適應(yīng)癥有用。雷帕霉素以Rapamune的名稱在商業(yè)上可以得到。
一種雷帕霉素酯，即3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸的雷帕霉素42-酯[美國專利號5,362,718中闡述]，也已知為CCI-779，已經(jīng)在各種腫瘤細胞系、體內(nèi)動物腫瘤模型以及I期臨床試驗中顯示出具有抗腫瘤活性。[Gibbons，J.，Proc.Am.Assoc.Can.Res.40301(1999)；Geoerger，B.，Proc.Am.Assoc.Can.Res.40603(1999)；Alexandre，J.，Proc.Am.Assoc.Can.Res.40613(1999)；和Alexandre，J.，Clin.Cancer.Res.5(November Supp.)Abstr.7(1999)]。
已經(jīng)闡述了利用標記前體化合物通過將這些化合物添加到發(fā)酵培養(yǎng)物中來標記雷帕霉素，所述標記前體化合物包括乙酸鹽、丙酸鹽或甲硫氨酸[N.L.Paive和A.L.Demain，J Natl Products，54(1)167-177(Jan-Feb 1991)]、或莽草酸[P.AS.Lowden，等人，Angew.Chem.Int.Ed.40(4)777-779(2001)]。在這些方法中，當細菌合成雷帕霉素時，某些標記的材料摻合到新產(chǎn)生的雷帕霉素中。標記的雷帕霉素從與其他分子的混合物中純化，其中某些分子也可能攜帶標記。然而，這些方法提供的結(jié)果不一致，因為不是每個被分離的雷帕霉素分子都標記至相同程度，或在相同位置標記。
所需要的是產(chǎn)生均一標記的分子的特異性標記雷帕霉素的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明所述方法利用特異性甲基化酶以均一的方式單獨標記雷帕霉素。存在于粗細胞提取物中的甲基化酶，在體外將標記的甲基基團添加到純化的去甲基雷帕霉素中。在這個系統(tǒng)中，雷帕霉素是唯一被標記的分子。它可以用同位素標記例如放射性進行標記。使用標準方法分離標記的材料是非常簡單的?；谄滟|(zhì)量和/或放射性標記易于鑒定標記的雷帕霉素。
本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點由于下文的詳述將是顯而易見的。
發(fā)明詳述已經(jīng)測序且分析了負責(zé)生物合成雷帕霉素的基因簇[Schwecke等人，PNAS USA 92，7839-43(1995)；Molnar等人，Gene 169，1-7(1996)；Aparicio等人，Gene 169，9-16(1996)]。核心多聚乙酰合成且環(huán)化后，對分子進行進一步修飾，所述合成及環(huán)化由rapA、rapB、rapC和rapP的蛋白產(chǎn)物介導(dǎo)。這些修飾中有氧化和甲基化。
rapI、rapM和rapQ這三個基因已被鑒定為S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶。RapI使C-41羥基甲基化，而RapM和RapQ使C-7和C-32羥基基團甲基化[Chung等人，J.Antibiotics 54，250-256(2001)]。
本發(fā)明方法利用這些雷帕霉素特異性甲基轉(zhuǎn)移酶(甲基化酶)在體外有效標記去甲基雷帕霉素。
本發(fā)明方法中使用由基因rapI、rapM和rapQ編碼的三種酶。本發(fā)明方法中可單獨使用這些酶，或使用其混合物。
如本文所定義的，術(shù)語“雷帕霉素”定義了一類包含下列雷帕霉素核的免疫抑制化合物。
雷帕霉素術(shù)語“去甲基雷帕霉素”是指一類包含所示的基本雷帕霉素核、但缺少一個或多個甲基基團的免疫抑制化合物。在一個實施方案中，雷帕霉素核在位置7、32或41，或者在其組合位置缺少甲基基團。其他去甲基雷帕霉素的合成可以進行基因工程改造，從而在雷帕霉素核的其他位置缺少甲基基團。去甲基雷帕霉素的產(chǎn)生已經(jīng)得到闡述。參見，例如，3-去甲基雷帕霉素[美國專利號6,358,969]以及17-去甲基雷帕霉素[美國專利號6,670,168]。
術(shù)語“去甲基雷帕霉素”和“-O-去甲基雷帕霉素”在文獻及本說明書中自始至終互換使用，除非另有說明。
根據(jù)本發(fā)明使用的雷帕霉素包括經(jīng)化學(xué)或生物學(xué)修飾為雷帕霉素核衍生物、且還保留免疫抑制特性的化合物。相應(yīng)地，術(shù)語“雷帕霉素”包括雷帕霉素的酯、醚、肟、腙及羥胺，以及其核上的官能團被修飾的雷帕霉素，例如通過還原或氧化進行修飾。術(shù)語“雷帕霉素”還包括藥物學(xué)上可接受的雷帕霉素鹽，其由于包含酸性或堿性部分，能夠形成此類鹽。
如本文所使用的，藥物學(xué)上可接受的鹽包括，但不限于，鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、氫氟酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、煙酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、磷酸鹽、丙二酸鹽、水楊酸鹽、苯乙酸鹽、硬脂酸鹽、嘧啶鹽、銨鹽、哌嗪鹽、二乙胺鹽、煙酰胺鹽、甲酸鹽、尿素鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋅鹽、鋰鹽、肉桂酸鹽、甲氨基鹽、甲磺酸鹽、苦味酸鹽、酒石酸鹽、三乙氨基鹽、二甲氨基鹽以及三(羥甲基)氨基甲烷鹽。其他藥物學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在一個實施方案中，雷帕霉素酯和醚是由雷帕霉素核的42-和/或31-位置的羥基基團形成的，在27-位置的羥基基團的酯和醚(27-酮化學(xué)還原后)，而肟、腙及羥胺是由雷帕霉素核的42-位置的酮(42-羥基基團氧化后)以及27-酮形成的。
在另一個實施方案中，下列專利中闡述了雷帕霉素42-和/或31-酯和醚雷帕霉素的烷基酯(美國專利號4,316,885)；氨烷基酯(美國專利號4,650,803)；氟化酯(美國專利號5,100,883)；酰胺酯(美國專利號5,118,667)；氨基甲酸酯(美國專利號5,118,678)；甲硅烷基醚(美國專利號5,120,842)；氨基酯(美國專利號5,130,307)；縮醛(美國專利號5,51,413)；氨基二酯(美國專利號5,162,333)；磺酸酯和硫酸酯(美國專利號5,177,203)；酯(美國專利號5,221,670)；烷氧基酯(美國專利號5,233,036)；O-芳基、-烷基、-鏈烯基及-炔基醚(美國專利號5,258,389)；碳酸酯(美國專利號5,260,300)；芳基羰基和烷氧羰基氨基甲酸酯(美國專利號5,262,423)；氨基甲酸酯(美國專利號5,302,584)；羥基酯(美國專利號5,362,718)；受阻酯(美國專利號5,385,908)；雜環(huán)酯(美國專利號5,385,909)；偕二取代酯(美國專利號5,385,910)；氨基鏈烷酸酯(美國專利號5,389,639)；磷酰氨基甲酸酯(美國專利號5,391,730)；氨基甲酸酯(美國專利號5,411,967)；氨基甲酸酯(美國專利號5,434,260)；脒基氨基甲酸酯(美國專利號5,463,048)；氨基甲酸酯(美國專利號5,480,988)；氨基甲酸酯(美國專利號5,480,989)；氨基甲酸酯(美國專利號5,489,680)；受阻N-氧化物酯(美國專利號5,491,231)；生物素酯(美國專利號5,504,091)；O-烷基醚(美國專利號5,665,772)；以及PEG酯(美國專利號5,780,462)。上文列出的專利闡述了這些酯和醚的制備。
在再一實施方案中，美國專利號5,256,790闡述了雷帕霉素27-酯和醚。上文列出的專利闡述了這些酯和醚的制備。
在又一實施方案中，美國專利號5,373,014、5,378,836、5,023,264以及5,563,145闡述了雷帕霉素肟、腙及羥胺。上文列出的專利闡述了這些肟、腙和羥胺的制備。美國專利號5,023,263闡述了42-氧雷帕霉素的制備。
在另一實施方案中，雷帕霉素包括雷帕霉素[美國專利號3,929,992]、3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸的雷帕霉素42-酯[美國專利號5,362,718]以及42-O-(2-羥基)乙基雷帕霉素[美國專利號5,665,772]。美國專利號5,362,718和6,277,983闡述了雷帕霉素羥基酯，包括CCI-779的制備及應(yīng)用。
雖然本文提供的實例闡述了7-O-去甲基雷帕霉素[美國專利號6,399,626]和32-O-去甲基雷帕霉素的甲基化，但這些化合物不是本發(fā)明的限制。
1.rapI、rapM和rapQ酶在一個實施方案中，本文定義的雷帕霉素甲基化酶以來自吸水鏈霉菌的粗酶提取物形式使用。在進一步的實施方案中，粗酶提取物從吸水鏈霉菌細胞[從美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)，保藏號ATCC29253，或從其他來源獲得]中制備。在一個實施方案中，使用如Kim等所述方法搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)這些細胞(Kim，W-S等人，2000，Antimicrob.Agents Chemother.442908-2910)。在另一實施方案中，為了制備無細胞提取物，通過離心收集細胞，并在約20mL適當?shù)木彌_液中重懸浮約1克的細胞材料。在再一實施方案中，緩沖液是pH約為6的50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)。在又一實施方案中，緩沖液是pH為7.5的50mM磷酸鉀。隨后破裂細胞并通過離心去除細胞碎片。在一個實施方案中，上清液在冷凍，例如在-70℃冷凍之前調(diào)整至～10％甘油。在其他實施方案中，從細胞培養(yǎng)物中制備粗酶提取物的替代方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
在再一實施方案中，通過經(jīng)典蛋白分離法，例如硫酸銨沉淀、柱層析等，進一步純化這些酶。
在又一實施方案中，通過重組技術(shù)利用經(jīng)典的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯方法合成這些酶。
在PubMed NCBI在線數(shù)據(jù)庫中，吸水鏈霉菌的登錄號X86780下可獲得rapI、rapM和rapQ酶基因的核酸序列。rapQ甲基化酶基因的核酸序列位于CDS的nt 90798-91433處；蛋白質(zhì)ID#CAA60463.1提供其氨基酸序列。rapM甲基化酶基因的核酸序列位于CDS的nt92992-93945的互補物處；蛋白質(zhì)ID#CAA60466.1提供其氨基酸序列。rapI甲基化酶基因的核酸序列位于CDS的nt 97622-98404處；蛋白質(zhì)ID#CAA604701提供其氨基酸序列。也參見T.Schwecke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(17)，7839-7843(1995)；I.Molnar等人，Gene 169(1)，1-7(1996)，以及J.F.Aparicio等人，Gene 169(1)，9-16(1996)。前述核酸和氨基酸序列特此引入作為參考。
在另一實施方案中，將本文所述編碼雷帕霉素甲基化酶的基因克隆至一個適當?shù)妮d體中，所述載體與控制其表達的調(diào)控序列可操作地連接。如本文所使用的，“可操作地連接”的序列包括與目的基因鄰接的表達控制序列和反式或相隔一段距離發(fā)生作用以控制目的基因的表達控制序列兩者。表達控制序列包括適當?shù)霓D(zhuǎn)錄起始(啟動子)和終止；增強翻譯效率的序列(例如，Shine-Dalgarno位點或核糖體結(jié)合位點)；以及需要時，增強編碼的產(chǎn)物分泌的序列。大量的表達控制序列，包括天然的、組成型和/或誘導(dǎo)型啟動子，是本領(lǐng)域已知的且可以被利用。
在一個實施方案中，調(diào)控序列包括一個可調(diào)節(jié)或可誘導(dǎo)的啟動子。許多此類可調(diào)節(jié)或可誘導(dǎo)的啟動子系統(tǒng)已經(jīng)被闡述且可以從各種來源獲得。誘導(dǎo)型啟動子使得能夠調(diào)節(jié)基因表達并可通過外源提供的化合物或環(huán)境因素例如溫度進行調(diào)節(jié)。誘導(dǎo)型啟動子和誘導(dǎo)型系統(tǒng)可從各種商業(yè)來源獲得，包括，例如且不限于，Invitrogen、Clontech和Ariad。許多其他系統(tǒng)也已經(jīng)被闡述且很容易被本領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇。例如，誘導(dǎo)型啟動子包括T7聚合酶啟動子系統(tǒng)[國際專利公開號WO 98/10088]。在一個實施方案中，選擇系統(tǒng)用于細菌系統(tǒng)。
在另一實施方案中，如下文所述，一個或多個編碼所述酶的基因被克隆至商業(yè)載體中，即，pET24誘導(dǎo)型質(zhì)粒表達載體[Novagen]，所述載體在誘導(dǎo)型啟動子下表達該酶。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易選擇另一種載體和/或另一個適當?shù)?、表達該酶的啟動子。
所述載體可以是本領(lǐng)域已知的或上述的任何載體，包括裸DNA、質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、附加體、病毒等。通過本領(lǐng)域已知的或上述的任何方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和電穿孔，可以實現(xiàn)將載體導(dǎo)入宿主細胞。利用熟練技術(shù)人員已知的并且如說明書自始至終討論的技術(shù)也可以實現(xiàn)將分子(如質(zhì)粒或病毒)導(dǎo)入宿主細胞。在一個實施方案中，使用標準轉(zhuǎn)化技術(shù)，例如，CaCl2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或電穿孔。
一旦克隆到適當?shù)谋磉_載體中，編碼該酶的核酸序列就被導(dǎo)入適當?shù)乃拗骷毎羞M行表達。在一個實施方案中，適當?shù)乃拗骷毎x自原核(即，細菌)細胞。在下文的實施例中，宿主細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地選擇另一種合適的宿主細胞用于表達所選擇的酶。
在一個實施方案中，如下文所述，利用重組技術(shù)制備粗酶提取物。[一般參見，Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY]例如，在允許甲基化酶表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)了雷帕霉素甲基化酶基因的細胞。在可誘導(dǎo)或可調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的情況下，這些條件包括提供誘導(dǎo)劑。培養(yǎng)后，細胞通過離心沉淀并在適當?shù)木彌_液中重懸浮，適當?shù)木彌_液包括還原劑以及磷酸鹽緩沖液，pH調(diào)整為中性pH。在一個實施方案中，緩沖液包括pH為7-7.5的50-100mM磷酸鉀緩沖液，其中包含1mM-2mM的β-巰基乙醇。在另一實施方案中，添加溶菌酶至終濃度為100μg/ml。在再一實施方案中，以0.5-2.0μL/mL細胞添加適當?shù)暮怂崦竅例如，BenzonaseTM核酸酶]。在又一實施方案中，使細胞懸浮液在30℃溫育例如15分鐘。在再一實施方案中，以終濃度為0.5-1.5mM向細胞添加蛋白酶抑制劑(例如，苯甲基磺酰氟(PMSF))。
在進一步的實施方案中，細胞通過適當方法破裂。在一個實施方案中，通過機械方法進行破裂，例如，在冰上通過超聲處理。去除細胞碎片并將所得到的上清液在冷凍前調(diào)整至5-15％甘油(v/v)。所得到的粗酶提取物現(xiàn)在可用于本發(fā)明的雷帕霉素特異性甲基化反應(yīng)。
在其他實施方案中，產(chǎn)生和分離所述酶的替代方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的[Sambrook J等人.2000.Molecular CloningA Laboratory Manual(Third Edition)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY]。
所述產(chǎn)生、純化及分離方法不是本發(fā)明的限制。
II.甲基化反應(yīng)利用如本文所述的雷帕霉素甲基化酶，或者作為粗提取物或者以另一種適當?shù)男问剑谆磻?yīng)進行如下。將大約45-65％v/v甲基化酶粗提取物加入反應(yīng)物中，所述反應(yīng)物包含約8-130μM去甲基雷帕霉素溶液、約0.2-0.4mM甲基化試劑、約4-10mM鎂(Mg，例如MgSO4)以及濃度約為50-100mM的適當?shù)木彌_液，pH調(diào)整為6.5-7.5。在另一實施方案中，一種更純化形式的甲基化酶所用體積更小，例如，約10-約45％v/v甲基化酶。
在一個實施方案中，甲基供體為S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)。當被選擇用于本發(fā)明時，SAM一般存在的終濃度為約0.2-0.4mM。
在另一實施方案中，雷帕霉素溶液是在適當?shù)娜軇┲杏屑s0.5mg/mL-約5mg/mL、約1mg/mL-3mg/mL或約1mg/mL雷帕霉素。對于所選擇的雷帕霉素適合的溶劑包括甲醇、乙醇和二甲基甲酰胺、四氫呋喃，或其混合物。
適當?shù)木彌_液可以容易地選自生理學(xué)相容的緩沖液，包括，例如磷酸緩沖鹽水、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)緩沖液或磷酸鉀緩沖液。
這些組分混合后，可以進行反應(yīng)。反應(yīng)溫度可以在20℃-約37℃之間變動約0.5-3小時，或約1-2小時。在一個實施方案中，反應(yīng)混合物在約34℃溫育約1小時。
在培養(yǎng)結(jié)束時，添加1-2體積的淬滅反應(yīng)物(quenchingreaction)終止反應(yīng)，例如，乙醇、甲醇或乙酸乙酯。
通過常規(guī)方法去除沉淀的材料。在一個實施方案中，通過離心去除沉淀的材料。在進一步的實施方案中，在14,000rpm進行10分鐘離心。然而，其他去除方法和/或離心條件是本領(lǐng)域已知的。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當?shù)姆椒梢詫崿F(xiàn)純化。適當?shù)姆椒òㄔ俳Y(jié)晶、硅膠柱層析、薄層層析(TLC)和高效液相層析(HPLC)。在一個實施方案中，使用C18柱(3.9×150mm)在45℃用包括60％二烷、0.05％乙酸和0.03％三乙胺的流動相進行HPLC分析。在另一實施方案中，使用C18柱(4.6×250mm)以在75分鐘期間從40％A∶60％B變?yōu)?5％A∶85％B的流動相梯度進行HPLC分析，其中溶劑A為10mM乙酸銨水而溶劑B為甲醇。
III.組合物及用途需要標記的雷帕霉素以研究和/或監(jiān)控雷帕霉素在體內(nèi)的代謝命運。在一個實施方案中，將標記的雷帕霉素用于鑒定與雷帕霉素結(jié)合的細胞/結(jié)構(gòu)?？梢杂妹芏然蛘叻派湫詷擞泚砭粯擞浝着撩顾?。用所述方式標記的雷帕霉素將具有未標記的、天然的雷帕霉素的構(gòu)象及特性，但由于一致地摻合的密度或放射性標記而易于檢測。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于雷帕霉素的特異性標記的試劑盒，其包括本文所述的一種或多種酶。該試劑盒可進一步包含附加組分，例如，陽性對照(例如，甲基化雷帕霉素)、陰性對照、試劑(例如，緩沖液、溶菌酶、核酸酶)、小瓶、管以及執(zhí)行本發(fā)明方法的使用說明書。
在特定情況下，需要在包含生理學(xué)相容載體的組合物中送遞根據(jù)本發(fā)明制造的標記的雷帕霉素。所述組合物是有優(yōu)勢的，因為使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，例如，尤其是，質(zhì)譜分析或閃爍計數(shù)，很容易追蹤(即，監(jiān)控)根據(jù)本發(fā)明制造的標記的雷帕霉素化合物。
下列實施例是用于雷帕霉素特異性甲基化的本發(fā)明方法的例證。閱讀了本發(fā)明詳細描述后很容易理解這些實施例不將本發(fā)明限于所闡述的反應(yīng)條件和試劑。
實施例A.擴增甲基化酶基因利用已公開的雷帕霉素基因簇序列設(shè)計的寡核苷酸引物從吸水鏈霉菌ATCC29253基因組DNA擴增所述基因(Schwecke，T.等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927839-7843)。隨后利用NovagenpET24誘導(dǎo)型質(zhì)粒表達載體在大腸桿菌菌株BL21(DE3)細胞中表達RapI、RapM和RapQ蛋白。在這個載體中，通過T7RNA聚合酶由T7啟動子表達被克隆的基因，并通過添加IPTG激活表達。
B.制備酶提取物為了建立體外甲基化反應(yīng)的最佳條件，從使用如Kim等所述方法搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的吸水鏈霉菌[ATCC29253]細胞制備粗酶提取物(Kim，W-S.等人，2000，Antimicrob.Agents Chemother.442908-2910)。通過離心收集細胞，用pH6.0的0.2M MES緩沖液洗滌，并將細胞沉淀在提取之前進行冷凍。約8g-10g解凍的細胞材料在20mL pH6.0的50mM MES緩沖液中重懸浮。對于克隆的甲基化酶蛋白的粗提取物，通過離心收集25mL誘導(dǎo)的細胞培養(yǎng)物并冷凍沉淀。在含有1mM β-巰基乙醇的10mL pH 7.5的50mM磷酸鉀緩沖液中重懸浮沉淀。其后，添加溶菌酶至終濃度為100μg/ml并添加BenzonaseTM核酸酶(1μL/mL細胞)。將細胞在冰上超聲處理1-2分鐘，并通過～30,000xg4℃離心15分鐘去除細胞碎片。將上清液在-70℃冷凍之前調(diào)整至～10％甘油。
C.甲基化7-去甲基雷帕霉素將約65μL甲基化酶粗提取物加入反應(yīng)物中，所述反應(yīng)物包含3μL 1mg/mL 7-去甲基雷帕霉素(7-dmr)溶液、5μL 4mM SAM、4μL0.1M MgSO4以及23μL 0.5M磷酸鹽緩沖液，pH調(diào)整為7.5。使用重組細胞提取物的甲基化反應(yīng)如上所述進行，只是除了使用50μL提取物和38μL緩沖液。包含RapM甲基化酶提取物和兩種去甲基雷帕霉素底物7-O-去甲基雷帕霉素(7-dmr和32-O-去甲基雷帕霉素的反應(yīng)物的HPLC層析譜顯示，只有當7-dmr為底物時RapM甲基化酶生成雷帕霉素(rapa)。該酶不修飾32-dmr，提示該克隆的酶在體外保留其底物特異性。此外，無SAM添加的樣品顯示沒有7-dmr轉(zhuǎn)化為雷帕霉素。
D.用含氚甲基SAM標記雷帕霉素為了標記雷帕霉素，利用了相同類型的體外反應(yīng)。例如，RapM甲基化反應(yīng)混合物包含下列物質(zhì)10μL pH 7.5的0.5M KPO4緩沖液、4μL 0.1M MgSO4、33μL 100μM S-腺苷-L-甲硫氨酸-(甲基-3H)、3μL 1mg/mL 7-去甲基雷帕霉素(溶于乙醇中)以及50μL粗提取物。下列方案顯示了標記的雷帕霉素分子的一個實例，所述分子通過RapM甲基化酶作用于7-dmr底物生成。
7-O-去甲基雷帕霉素 雷帕霉素通過HPLC分析由雷帕霉素標準無法區(qū)別含氚的材料。質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示標記的材料與含氚的雷帕霉素一致。
本發(fā)明不限于本文所述具體實施方案的范圍內(nèi)。實際上，由于前文所述及附圖
，除本文所述修改之外的本發(fā)明的各種修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。此類修改預(yù)期包括在附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
應(yīng)進一步理解值是近似的且提供用于進行說明。
本申請自始至終列出了專利、專利申請、出版物、方法等，其公開內(nèi)容在此整體引入本文作為參考。就本說明書和另一個文件可能存在的沖突而言，以本公開內(nèi)容的語言為準。
權(quán)利要求
1.一種特異性標記雷帕霉素的方法，其包括步驟在甲基化試劑存在下使去甲基雷帕霉素與雷帕霉素特異性甲基化酶反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述甲基化試劑為S-腺苷-L-甲硫氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述甲基化酶選自rapI甲基化酶、rapM甲基化酶和rapQ甲基化酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項的方法，其中所述甲基化酶為粗酶提取物的形式。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述粗酶提取物制備步驟包括(a)從細胞培養(yǎng)物表達雷帕霉素特異性酶，所述細胞培養(yǎng)物由與調(diào)控序列可操作地連接的編碼酶的核酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述酶選自rapI甲基化酶、rapM甲基化酶和rapQ甲基化酶；(b)濃縮細胞并在緩沖液中重懸浮所述細胞；(c)使混合物與溶菌酶和核酸酶溫育；(d)破裂細胞；并且(e)離心且收集上清液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)中的溫育進一步包括蛋白酶抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任何一項的方法，其中所述反應(yīng)混合物在約34℃溫育約1小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項的方法，其中甲醇在溫育結(jié)束時加入反應(yīng)物。
9.權(quán)利要求1-8任何一項的方法，其中在HPLC分析之前通過離心去除沉淀的材料。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在C18柱中在45℃用包括二烷、乙酸和三乙胺的流動相進行HPLC分析。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任何一項的方法制備的特異性標記的雷帕霉素。
12.包含根據(jù)權(quán)利要求1-10任何一項的方法制備的特異性標記的雷帕霉素和生理學(xué)相容的載體的組合物。
13.一種制備特異性標記的雷帕霉素的試劑盒，其包括甲基化雷帕霉素，所述甲基化雷帕霉素根據(jù)權(quán)利要求1-10任何一項的方法制備，以及選自陰性對照、甲基化試劑、小瓶、管以及使用說明書的一種或多種組分。
14.一種包含根據(jù)權(quán)利要求11的標記的雷帕霉素的試劑盒。
全文摘要
闡述了一種利用rapI、rapM和/或rapQ酶的雷帕霉素特異性標記方法。還闡述了生成對本發(fā)明方法有用的粗酶提取物的方法。提供了特異性標記的雷帕霉素作為診斷工具的用途。
文檔編號C07D491/14GK1946852SQ200580012901
公開日2007年4月11日 申請日期2005年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月27日
發(fā)明者M·E·魯彭, P·F·沙博諾 申請人:惠氏公司