專利名稱：針對pla的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸在治療醫(yī)療狀況(medical condition)中的應(yīng)用的領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明描述了用于抑制磷脂酶A2(PLA2)以及治療與該分子激活關(guān)聯(lián)的狀況的新型反義寡核苷酸。
背景技術(shù)：
整個本申請?zhí)峒暗乃谐霭嫖锒纪ㄟ^引用被全部并入此處，包括其中引用的所有參考文獻(xiàn)。
炎癥是人體對損傷、感染或?qū)Ρ幻庖呦到y(tǒng)認(rèn)為是外來物質(zhì)的分子的反應(yīng)。缺少、過度或者不受控制的炎癥導(dǎo)致大量的一系列疾病，諸如哮喘、關(guān)節(jié)炎以及自身免疫性疾病、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、心血管炎癥以及胃腸炎癥。大量的研究證實，預(yù)致敏中性粒細(xì)胞(primedneutrophils)、單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞參與了這類炎性疾病。最近，也有文獻(xiàn)記載了由小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia cells)釋放的過氧化物在神經(jīng)退化性疾病的發(fā)病機理中的作用，所述神經(jīng)退化性疾病的實例包括阿茲海默氏癥(Alzheimer’s disease)(AD)、帕金森氏癥(Parkinson’s disease)(PD)和肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷。
由吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶產(chǎn)生的過氧化物和由磷脂酶A2產(chǎn)生的促炎脂質(zhì)介質(zhì)(proinflammatory lipid mediators)對宿主防御而言屬于最重要的功能之內(nèi)。然而，在改變的生理狀態(tài)下，過氧化物和脂介質(zhì)會促進(jìn)炎癥反應(yīng)并參與導(dǎo)致組織損傷的過程以及各種炎性疾病的病理生理學(xué)過程?，F(xiàn)今，非甾體抗炎藥物(NSAIDs)是用于治療炎性狀況的最廣泛的處方藥物中的一種。然而，它們具有不利的副作用，最常見的是胃腸道的潰瘍和出血。此外，這些藥物僅僅降低前列腺素的產(chǎn)生而不影響在將中性粒細(xì)胞聚集至炎癥位點的過程中起關(guān)鍵作用的白三烯(leukotrienes)的產(chǎn)生。因而，人們?nèi)栽诶^續(xù)尋求新的副作用更小的抗炎藥物的研究。人們對阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)的因子進(jìn)行了大量的試驗，諸如皮質(zhì)類固醇、抗內(nèi)毒素抗體、TNF拮抗劑、IL-1受體拮抗劑和其它因子，都沒有獲得顯著的成功。
本發(fā)明人開發(fā)了一種細(xì)胞系，該細(xì)胞系是缺乏胞液型磷脂酶A2(PLA2)表達(dá)的PLB-985細(xì)胞系的穩(wěn)定的克隆，并證實了cPLA2除了已知的在促炎脂質(zhì)介質(zhì)的產(chǎn)生中的作用外，還是吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶復(fù)合體組裝后的激活過程中的關(guān)鍵物質(zhì)。這兩個酶之間的關(guān)聯(lián)提供了cPLA2釋放的花生四烯酸(AA)激活組裝的NADPH氧化酶的分子基礎(chǔ)[Dana，R.等(1998)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)273441-5；Lowenthal，A.和Levy，R.(1999)生物化學(xué)雜志27421603-10；Levy，R等(2000)血液(Blood)95660-5；Pessach，I.等(2001)生物化學(xué)雜志27633495-503；Shmelzer，Z等(2003)細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)162683-692；Tarsi-Tsuk，D.和Levy，R(1990)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)；1442665-2670；Dana，R等生物化學(xué)雜志(Biochem.J)297217-223；Hazan-Halevy，I.等(2000)生物化學(xué)雜志27512416-12423]。由于氧化酶激活需要cPLA2，對其抑制應(yīng)該不僅能消除炎癥介質(zhì)的形成，而且應(yīng)該還能調(diào)節(jié)參與炎性疾病發(fā)病機理的氧自由基的不受控制的加速釋放。此外，發(fā)明人的研究顯示在體內(nèi)(in vivo)的炎癥或者在體外(in vitro)的炎癥狀況中，cPLA2和NADPH氧化酶兩者的水平和活性在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中都會升高[Levy，R等(1994)生物化學(xué)與生物物理學(xué)(Biochim.Biophys.Acta)1220261-265；Shaked，G.等(1994)創(chuàng)傷雜志(J.Trauma)3722-29；Levy，R等(2000)血液95660-665；Levy，R和Malech，H.(1991)免疫學(xué)雜志1473066-3071；Levy，R等(1994)生物化學(xué)與生物物理學(xué)1220253-260；Reizenberg，K.等(1997)歐洲臨床調(diào)查雜志(Eur.J.Clin.Invest.)27398-404]。令人驚訝的是，一份最近的報告報道，向中心粒細(xì)胞添加cPLA2抑制劑吡咯烷不會抑制NADPH氧化酶的活性[Rubin，B.B.等(2005)生物化學(xué)雜志2807519-29]，然而這個結(jié)果可能歸因于所應(yīng)用的方法學(xué)，該方法不能夠使藥物在中性粒細(xì)胞中得到足夠的積累(數(shù)據(jù)未示出)。盡管有關(guān)于通過抑制cPLA2而治療炎癥狀況的方法的報道，但這些方法涉及了使用諸如導(dǎo)致呼吸道炎癥的劑量依賴性衰減[美國專利申請?zhí)?0020165119，USSN 062730]的三氟甲基酮(trifuoromethylketone)(TFMK)，或抑制各種形式的PLA2[US6,797,708]的吲哚化合物之類的物質(zhì)，但用于治療炎癥的特異針對cPLA2的抑制劑至今未有報道。目前，還未有有效的胞液型PLA2抑制劑可供人和動物的臨床應(yīng)用。迄今針對cPLA2的所有抑制劑都被設(shè)計成與底物的競爭。由于所有類型的PLA2都在磷脂的順-2位切開脂肪酸，因此它們均被相同的抑制劑所抑制(盡管有時效率更低)。盡管有報道顯示數(shù)個化合物作為cPLA2的特異抑制劑，但發(fā)現(xiàn)它們也能抑制其它PLA2酶，反之亦然。因為缺少對于每一PLA2亞型的特異抑制劑，反義技術(shù)提供了一種抑制特定類型的PLA2的有效途徑。誠然，此處表明的結(jié)果提示，直接靶向cPLA2的藥物將特異性地抑制cPLA2的活性。此外，它也導(dǎo)致對產(chǎn)生促炎脂質(zhì)介質(zhì)和過氧化物的cPLA2和NADPH氧化酶兩者的調(diào)節(jié)。
過去已經(jīng)有報道靶向cPLA2mRNA序列的反義寡核苷酸能抑制cPLA2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[US6,008,344]。然而，這些寡核苷酸沒有證實不抑制cPLA2的蛋白表達(dá)的抑制，并且其在脂質(zhì)體lipofectin的存在下被導(dǎo)入細(xì)胞。
此外，已有文獻(xiàn)描述了靶向cPLA2的其它三個反義寡核苷酸P1(表1，序列8(SEQ.ID.No.8))[Roshak，A.(1994)生物化學(xué)雜志269(42)25999-26005；Muthalif，M.M.等(1996)生物化學(xué)雜志271(47)30149-30157；Marshall，L(1997)生物化學(xué)雜志272(2)759-765；Anderson，K.M.等(1997)生物化學(xué)雜志272(48)30504-30511]；P2(表1，序列9)[Li，Q.和Cathcart，M.K.(1997)生物化學(xué)雜志272(4)2404-2411；Zhao，X.等(2002)生物化學(xué)雜志277(28)25385-25392]；以及P3(5’-GTGCTGGTAAGGATCTAT-3’；序列12)[Locati，M.(1996)生物化學(xué)雜志271(11)6010-6016]，主要評估了抑制cPLA2在平滑肌細(xì)胞和人單核細(xì)胞功能中的影響。P1與lipofectin一起使用。P1和P2，其所有堿基都用硫代磷酸(phosphorothioate)修飾，僅在5μM使用時才會有顯著作用，而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這個濃度對細(xì)胞有毒性。P3在10μM下使用(或甚至更高的濃度下，比本發(fā)明人使用的濃度高10倍)因此，本發(fā)明的一個目的在于提供針對cPLA2mRNA的新型反義寡核苷酸，以及它們在抑制cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)生中的應(yīng)用，以抑制促炎過程。因而，本發(fā)明所權(quán)利要求的反義寡核苷酸也尋求作為抗炎劑。
隨著說明書的進(jìn)程，本發(fā)明其它的應(yīng)用和目的將得到闡明。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供了針對胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA序列的開放閱讀框(ORF)的反義寡核苷酸，以及其功能類似物(functionalanalogs)、衍生物或片斷，其中所述反義寡核苷酸的互補性(complementarity)在所述ORF的核苷145至400之間的區(qū)域內(nèi)，且其中所述反義寡核苷酸能抑制cPLA2蛋白的表達(dá)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸的長度從15至達(dá)30個核苷酸，優(yōu)選地長度為17至21個核苷酸。
所述針對cPLA2mRNA序列的開放閱讀框的5’區(qū)域的反義寡核苷酸的序列具有如序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6中的任一序列表示的序列，詳情見表1。
本發(fā)明的反義寡核苷酸的序列可以被化學(xué)修飾，以便于獲得更好的核酸內(nèi)切酶抗性。
從而，在本發(fā)明反義寡核苷酸的另一實施方案中，硫代磷酸化修飾可以存在于所述寡核苷酸的最前三個和/或最后三個核苷上。此外，可在所述寡核苷酸的第十個核苷上發(fā)現(xiàn)另一硫代磷酸化修飾，正如在如序列4和序列5表示的寡核苷酸中。
在本發(fā)明反義寡核苷酸序列的另一實施方案中，進(jìn)一步的修飾，諸如2-O-甲基化，可在所述寡核苷酸的最前三個和/或最后三個核苷上發(fā)現(xiàn)。
作為本研究所帶來的特性的結(jié)果，反義寡核苷酸可用于與cPLA2表達(dá)相關(guān)的炎癥過程的抑制劑。
從而，本發(fā)明反義寡核苷酸用作治療和/或預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷(trauma)、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病，以及神經(jīng)退化性疾病，諸如阿茲海默氏癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在發(fā)病機理中氧化脅迫(oxidative stress)具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸(eicosanoid)和過氧化物的加速釋放的所有疾病。
從而，本發(fā)明的反義寡核苷酸可以用于抑制過氧化物的產(chǎn)生和釋放。尤其是，所述抑制在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，優(yōu)選在中性粒細(xì)胞中實現(xiàn)。
可選地，本發(fā)明反義寡核苷酸可用熒光、放射性物質(zhì)、金屬顆粒，以及任何適用的標(biāo)記方法之一標(biāo)記。
在第二方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包括至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或其功能類似物、衍生物或片斷作為活性成分。
從而，本發(fā)明反義寡核苷酸大致以藥物組合物的形式提供。所述組合物用于通過注射、局部給藥，或者口服使用。
或者，本發(fā)明的藥物組合物可包括至少兩種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或其功能類似物、衍生物或片斷的組合作為活性成分。優(yōu)選地，所述組合包括下述寡核苷酸序列1與序列3，或序列1與序列2，或者序列1與序列6，或者序列1與序列2和序列3，或者序列4與序列6，或者序列2與序列6，或者序列2與序列3，或者序列3與序列6。
本發(fā)明的藥物組合物意在醫(yī)療應(yīng)用。
在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物意在治療表達(dá)和/或噬細(xì)胞NADPH氧化酶的自由基釋放的炎癥過程。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物意在治療炎癥狀況，其中所述炎癥狀況可以是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病，CNS相關(guān)的疾病諸如神經(jīng)退化性疾病AD、PD、ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在在發(fā)病機理中氧化脅迫具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸和過氧化物的加速釋放的所有疾病。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物意在治療與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況。所述狀況是通常的CNS相關(guān)的疾病，尤其是神經(jīng)退化性疾病阿茲海默氏癥、帕金森氏癥、ALS，或腦缺血性和創(chuàng)傷性頭部損傷。
本發(fā)明的藥物組合物可選地可進(jìn)一步包括緩沖液、添加劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑和/或賦形劑。
另一方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸在制備用于治療和/或預(yù)防炎癥狀況的藥物組合物中的應(yīng)用，其中所述炎癥狀況可以是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病，神經(jīng)退化性疾病諸如AD、PD和ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在發(fā)病機理中氧化脅迫具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸和過氧化物的加速釋放的所有疾病。
在另一方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸在與cPLA2激活相關(guān)的狀況治療中的應(yīng)用。
在另一方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸在與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。通常所述狀況是選自由阿茲海默氏癥、帕金森氏癥、ALS，腦缺血損傷和創(chuàng)傷性頭部損傷組成的CNS相關(guān)疾病，在另一方面，本發(fā)明提供了一種與cPLA2激活相關(guān)的狀況的治療方法；包括對所需受試者施以至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種炎癥狀況的治療方法，其中所述炎癥狀況是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病，神經(jīng)退化性疾病諸如AD、PD和ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在發(fā)病機理中氧化脅迫具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸和過氧化物的加速釋放的所有疾病中的任一種，包括對需要的受試者給藥治療學(xué)有效量的至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或包括它的組合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況的治療方法，包括對所需受試者施以至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。所述狀況是通常的神經(jīng)退化性疾病，尤其是阿茲海默氏癥和帕金森氏癥。
最后，本發(fā)明提供了一種在體內(nèi)、離體轉(zhuǎn)移(ex vivo)或體外抑制cPLA2表達(dá)和/或活性的方法，包括用本發(fā)明描述的反義寡核苷酸或含有它的組合物接觸細(xì)胞，優(yōu)選吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或小膠質(zhì)細(xì)胞，一段適宜量的時間。這些反義寡核苷酸在成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞(neuronal cell)和內(nèi)皮細(xì)胞中抑制cPLA2活性，但與吞噬細(xì)胞相比活性更低，很可能由于前者細(xì)胞對于反義寡核苷酸的滲透性更低(數(shù)據(jù)未示出)。


圖1cPLA2的cDNA序列(序列7)，其反義寡核苷酸的C2，C3，C4，C8，C9和C10的位置突出表示。
C2包括核苷347-366；C3包括核苷155-174；C4包括核苷379-399；C8包括核苷330-346；C9包括核苷183-202；以及C10包括核苷290-306。
圖2兩種抗-cPLA2抗體(Ab)之間的比較圖2ALevy’s Ab[Hazan等(1997)id ibid(同一著者，同一出處)]圖2B商業(yè)抗體。
Dil＝稀釋。
圖3A-圖3BcPLA2反義PPS寡核苷酸對人外周血單核細(xì)胞中的cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)量的影響。
圖3AWestern印跡分析顯示，與對照以及反義P1[Roshak，A等(1994)id ibid；Marshall，L等(1997)id ibid；Muthalif，M.M.等(1996)id ibid；Anderson，K.M.等(1997)id ibid]和P2[Li，Q和Cathcart，M.K.(1997)id ibid]相比，在用反義PPS寡核苷酸C2，C3，C4，C9，以及C2+C4(2+4)的組合處理后，經(jīng)抗-cPLA2抗體檢測，cPLA2表達(dá)得到抑制。不同處理中的cPLA2水平通過光密度分析法定量，并表示在Western印跡分析下方。Lev.＝水平；dens＝光密度分析。
圖3B直方圖顯示了與對照以及反義P1[Muthalif，M.M.等(1996)id ibid；Anderson，K.M.等(1997)id ibid]和P2[Li，Q和Cathcart，M.K.(1997)id ibid]相比，cPLA2反義PPS寡核苷酸C2，C3，C4，C9，以及C2+C4(2+4)對過氧化物產(chǎn)量(SO prod.)的抑制。
特別要注意，本發(fā)明反義PPS寡核苷酸(記為2，3，4和9)與前述的反義寡核苷酸P1和P2相比，具有更高的效率。
圖4A-圖4BcPLA2反義PPS寡核苷酸對外周血人單核細(xì)胞中的cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)量的影響。
圖4AWestern印跡分析顯示，與對照以及寡核苷酸IS1和IS2[US6,008,344]相比，在用反義的部分硫代磷酸化(PPS)的寡核苷酸C2，C8，C9，C10以及C3+C10的組合和C8+C10的組合處理后，經(jīng)抗-cPLA2抗體檢測，cPLA2表達(dá)得到抑制。不同處理中的cPLA2水平通過光密度分析法定量，并表示在Western印跡分析下方。Lev.＝水平；dens.＝光密度分析。
圖4B直方圖顯示了與對照(cont.)以及寡核苷酸IS1和IS2[US6,008,344]相比，cPLA2反義PPS寡核苷酸C2，C8，C9，C10以及C3+C10的組合和C8+C10的組合對過氧化物產(chǎn)量(SO prod.)的抑制。
特別要注意，本發(fā)明反義PPS寡核苷酸(記為2，3，4和9)與在US6,008,344中描述的反義寡核苷酸[IS1和IS2]相比，具有更高的效率。
圖5A-圖5CcPLA2反義PPS寡核苷酸對腹膜鼠巨噬細(xì)胞中的cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)量的影響。
圖5AWestern印跡分析顯示，在用反義PPS寡核苷酸C3和C4以及C3+C4的組合處理后，經(jīng)抗-cPLA2抗體檢測，cPLA2表達(dá)得到抑制。
圖5B直方圖顯示了cPLA2反義PPS寡核苷酸C3和C4以及C3+C4的組合對過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖5C直方圖顯示了cPLA2反義PPS寡核苷酸C2，C3，C4，C10和C2+C10組合，C3+C10組合，C4+C10組合，以及C3+C4組合對過氧化物產(chǎn)量的抑制。
縮寫cont.，對照；SO gen.，過氧化物產(chǎn)量。
圖6用cPLA2反義PPS寡核苷酸處理后，cPLA2表達(dá)(exp.)抑制和過氧化物產(chǎn)量(SO prod.)抑制之間的關(guān)聯(lián)性。Cont.＝對照。
圖7A-圖7CcPLA2反義PPS寡核苷酸對外周血人中性粒細(xì)胞中的cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)量的影響。
圖7AWestern印跡分析顯示，在用反義PPS寡核苷酸C2或C4以及C2+C4的組合處理后，經(jīng)抗-cPLA2抗體檢測，cPLA2表達(dá)得到抑制。
圖7B直方圖顯示了PMA處理后，cPLA2反義PPS寡核苷酸C2，C4或C10以及C2+C4的組合，C2+C10組合，C4+C10組合，C2+C4+C10組合，對過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖7C直方圖顯示了OZ處理后，cPLA2反義PPS寡核苷酸C2，C4或C10以及C2+C4的組合，C2+C10組合，C4+C10組合，C2+C4+C10組合，對過氧化物產(chǎn)量的抑制。
縮寫Lev.，水平；dens.，光密度分析；cont.，對照；SO gen.，過氧化物產(chǎn)量。
圖8A-圖8F中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞經(jīng)cPLA2反義PPS寡核苷酸處理后由生理激動劑刺激的過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖8A直方圖顯示了用cPLA2反義PPS寡核苷酸C3或C4孵育6小時后，經(jīng)PMA刺激的中性粒細(xì)胞中過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖8B直方圖顯示了用cPLA2反義PPS寡核苷酸C3或C4孵育4小時后，經(jīng)fMLP刺激的中性粒細(xì)胞中過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖8C直方圖顯示了用cPLA2反義PPS寡核苷酸C3或C4孵育4小時后，經(jīng)OZ刺激的中性粒細(xì)胞中過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖8D直方圖顯示了用cPLA2反義PPS寡核苷酸C3或C4孵育16小時后，經(jīng)PMA刺激的單核細(xì)胞中過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖8E直方圖顯示了用cPLA2反義PPS寡核苷酸C3或C4孵育16小時后，經(jīng)fMLP刺激的單核細(xì)胞中過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖8F直方圖顯示了用cPLA2反義PPS寡核苷酸C3或C4孵育16小時后，經(jīng)OZ刺激的單核細(xì)胞中過氧化物產(chǎn)量的抑制。
縮寫SO gen.，過氧化物產(chǎn)量；Act.，活性。
圖9A-圖9DcPLA2反義PPS寡核苷酸對刺激大鼠(rat)小膠質(zhì)細(xì)胞過氧化物產(chǎn)量的抑制。
圖9AWestern印跡分析顯示，在用反義PPS寡核苷酸C2或C4處理后，經(jīng)抗-cPLA2抗體檢測，cPLA2表達(dá)得到抑制。
圖9B曲線圖表明了經(jīng)PMA激活的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中用cPLA2反義寡核苷酸C2，C4，C8或C10，以及C2+C10組合或C4+C10組合處理后，過氧化物產(chǎn)量被抑制的動力學(xué)。
圖9C直方圖顯示了大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)PMA刺激后，cPLA2反義PPS寡核苷酸(C2，C4，C8和C10，以及C2+C10組合和C4+C10組合)對過氧化物產(chǎn)量的影響。
圖9D直方圖顯示了大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)β淀粉樣蛋白刺激后，cPLA2反義PPS寡核苷酸(C2，C4，C8和C10，以及C2+C10組合和C4+C10組合)對過氧化物產(chǎn)量的影響。
縮寫rest.，靜止的(resting)；act.，刺激的；as.，反義；kin.，動力學(xué)；T.，時間；min.，分鐘。
圖10A-圖10C膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的動物模型圖10A實驗性的惡化CIA與對照(cont.)小鼠的比較圖。
圖10BCIA小鼠與對照(cont.)相對比的整爪上的關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)代表性切片的組織學(xué)評估(X100)。
圖10CCIA小鼠中炎性細(xì)胞的滲透(X400)。
圖11A-圖11B采用3種cPLA2反義PPS寡核苷酸的組合(“混合物(Cocktail)”)治療致使關(guān)節(jié)炎的消退。
圖11ACIA小鼠腫脹的肢體(上方，art.＝關(guān)節(jié)炎)和用cocktail治療后的CIA小鼠肢體(下方，as＝反義治療)的照片。兩張照片都在相同的放大倍數(shù)下拍攝，且與動物距離相同。
圖11B用cocktail靜脈注射(i.v.)治療后，疾病嚴(yán)重性得分(dis.sev.sc.)、血清(ser.)IL-6和血清TNFα的降低(平均±SEM，來自每一組中的5只小鼠)。
圖12A-圖12B在無菌性腹膜炎誘導(dǎo)后腹膜細(xì)胞種群的數(shù)目和組成。
圖12A在無菌性腹膜炎小鼠中腹膜細(xì)胞計數(shù)的變化(平均±SEM，來自每一組中的6只小鼠)。
圖12B在無菌性腹膜炎小鼠中腹膜細(xì)胞種群組成的變化。
縮寫ce.no.，細(xì)胞數(shù)；T.，時間；h，小時；neu，中性粒細(xì)胞；mac，巨噬細(xì)胞；lymp，淋巴細(xì)胞。
圖13A-圖13B在無菌性腹膜炎誘導(dǎo)后LTB4(白三烯B4)的水平。
圖13A血清(ser.)中LTB4的水平。
圖13B腹膜腔(per.cav.)中LTB4的水平。
平均±SEM來自每一組中的5只小鼠，T.，時間；h，小時。
圖14A-圖14C誘導(dǎo)24小時后，反義PPS寡核苷酸cocktail治療對于腹膜細(xì)胞種群和活性的影響。
圖14A細(xì)胞種群(ce.pop.)組成的FACS(熒光激活細(xì)胞分選法)分析。Neu＝中性粒細(xì)胞。
圖14B表明細(xì)胞計數(shù)(ce.co.)的圖表。
圖14C對照健康小鼠(H)、無菌性腹膜炎小鼠(P)以及無菌性腹膜炎小鼠經(jīng)cocktail法靜脈(i.v.)注射24h后(P+AS)的激活腹膜細(xì)胞的過氧化物產(chǎn)量(SO prod.)。
圖15A-圖15B腹膜炎誘導(dǎo)24小時后，cPLA2反義PPS寡核苷酸cocktail治療減少了炎癥位點的中性粒細(xì)胞數(shù)目以及過氧化物產(chǎn)量。
圖15A表明經(jīng)過或未經(jīng)過反義治療的中性粒細(xì)胞(neu)的百分?jǐn)?shù)。
圖15B表示經(jīng)過或未經(jīng)過反義治療，從無菌性腹膜炎小鼠中分離的腹膜細(xì)胞的經(jīng)PMA刺激導(dǎo)致的過氧化物產(chǎn)量(SO prod.)。
圖16腹膜炎誘導(dǎo)24小時后，cPLA2反義PPS寡核苷酸cocktail治療減少了炎癥位點的靜止的腹膜細(xì)胞的未被刺激的過氧化物產(chǎn)量。
顯示的是經(jīng)過或未經(jīng)過反義治療，從無菌性腹膜炎小鼠中分離的靜止的腹膜細(xì)胞經(jīng)1μM二氫若丹明-123(dihydrorhodamine-123)評估，檢測其過氧化物產(chǎn)量的的一個實施例。(Co.＝計數(shù))。
圖17A-圖17BcPLA2反義PPS寡核苷酸cocktail治療對無菌性腹膜炎小鼠中腹膜細(xì)胞組成的影響。
圖17A在無菌性腹膜炎期間的腹膜細(xì)胞組成。
圖17B在反義治療后的腹膜細(xì)胞組成。
縮寫ce.no.，細(xì)胞數(shù)；T.，時間；h，小時；neu，中性粒細(xì)胞；mac，巨噬細(xì)胞；lymp，淋巴細(xì)胞。
縮寫Neu，中性粒細(xì)胞；mac，巨噬細(xì)胞；lymp，淋巴細(xì)胞(每一組中5只小鼠的平均值)。
圖18A-圖18BcPLA2反義PPS寡核苷酸cocktail治療對在無菌性腹膜炎期間的腹膜細(xì)胞的被刺激的過氧化物產(chǎn)量(SO prod.)的影響。
圖18A無菌性腹膜炎小鼠中腹膜細(xì)胞的被刺激的過氧化物產(chǎn)量。
圖18B無菌性腹膜炎且經(jīng)反義寡核苷酸治療的小鼠中腹膜細(xì)胞的受刺激的過氧化物產(chǎn)量。
平均±SEM來自每一組中的5只小鼠。T.，時間；h，小時。
圖19A-圖19BcPLA2反義PPS寡核苷酸cocktail治療降低了腹膜LTB4的水平。
圖19A無菌性腹膜炎小鼠腹膜中的LTB4的水平。
圖19B經(jīng)cocktail治療的無菌性腹膜炎小鼠腹膜中的LTB4的水平。
平均±SEM來自每一組中的5只小鼠。T.，時間；h，小時。
圖20A-圖20BcPLA2反義PPS寡核苷酸cocktail治療降低了腹膜中性粒細(xì)胞的計數(shù)。
圖20A無菌性腹膜炎小鼠腹膜中中性粒細(xì)胞的數(shù)目。
圖20B經(jīng)cocktail治療的無菌性腹膜炎小鼠腹膜中中性粒細(xì)胞的數(shù)目。
平均±SEM來自每一組中的5只小鼠。T.，時間；h，小時。
圖21A-圖21B在注射24小時后腹膜血細(xì)胞中的反義寡核苷酸的積聚。
圖21A腹膜血細(xì)胞，未治療。
圖21B用反義(as)寡核苷酸治療后的腹膜血細(xì)胞。
上方圖片光學(xué)顯微鏡；下方圖片共聚焦顯微鏡。
具體實施例方式
在本研究中，發(fā)明人設(shè)計了六種不同的針對胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA的反義寡核苷酸。如下述實施例所示，每一反義寡核苷酸自身對抑制cPLA2的表達(dá)作用非常有力，而不同的寡核苷酸組合完全抑制了不同的吞噬細(xì)胞以及來自人、小鼠和大鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞的cPLA2表達(dá)。此外，反義寡核苷酸對cPLA2表達(dá)的抑制和NADPH氧化酶產(chǎn)生過氧化物的抑制之間具有非常顯著的關(guān)聯(lián)性，這在以前沒有表明過。
從而，本發(fā)明提供了針對cPLA2mRNA序列開放閱讀框(ORF)的反義寡核苷酸以及其功能類似物、衍生物或片斷，其中所述反義寡核苷酸的互補性位于所述ORF的核苷145至400之間的區(qū)域內(nèi)，且其中所述反義寡核苷酸能抑制cPLA2蛋白的表達(dá)。
如下述實施例所示，本發(fā)明提供的反義寡核苷酸還能通過抑制NADPH氧化酶的活性而抑制過氧化物的產(chǎn)生。
如此處提及，序列7涉及相應(yīng)于cPLA2mRNA序列的cDNA序列[GenBank號M68874]。
所述在cPLA2mRNA的核苷145至400之間的區(qū)域?qū)τ诎邢蛴绕溆杏?，因為一旦蛋白合成過程開始，阻止蛋白合成比中斷蛋白合成更加高效(對于大部分的cPLA2反義序列，后者為US6,008,344中使用的策略)。因此，反義寡核苷酸設(shè)計為靶向翻譯點的區(qū)域(ORF的起始處)。
不過，有必要提起注意反義靶向仍然是非常經(jīng)驗性的，為了最有效靶向需要大量實驗來發(fā)現(xiàn)特定序列和的優(yōu)條件。例如，如此處描述的，本發(fā)明人原先設(shè)計了十四條靶向cPLA2序列核苷145-400之間的區(qū)域，即相應(yīng)于該ORF的開始的反義寡核苷酸，但僅僅其中的六條能有效地起作用，而并得到更詳細(xì)地研究。
所述針對cPLA2mRNA序列的開放閱讀框5’區(qū)域的反義寡核苷酸的序列具有如序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6中的任一序列表示的序列，這些序列在表1中詳細(xì)列出。
如上文提及的，本發(fā)明反義寡核苷酸可以被化學(xué)修飾，以獲得改進(jìn)的核酸內(nèi)切酶抗性?？梢圆捎萌魏螌怂醿?nèi)切酶提供抗性的化學(xué)修飾，諸如，但不限于硫代磷酸化或者2-O-甲基化。
這樣，硫代磷酸化修飾可以存在于本發(fā)明寡核苷酸的最前三個和/或最后三個核苷上。此外，可在所述寡核苷酸的第十個核苷，一個內(nèi)嘧啶(inner pyrimidine)，上發(fā)現(xiàn)另一硫代磷酸化修飾，正如在如序列4和序列5表示的寡核苷酸中。內(nèi)嘧啶的硫代磷酸化顯示出能增加穩(wěn)定性并防止被核酸內(nèi)切酶切斷[Pirollo，K.F.等(2003)藥理學(xué)和治療學(xué)(Pharmacology&Therapeutics)9955-77]。本發(fā)明的反義寡核苷酸被部分硫代磷酸化，因而比在所有核苷上都具有硫代磷酸化修飾的反義寡核苷酸毒性更小。
可在所述寡核苷酸的最前三個和/或最后三個核苷上仍然可發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的修飾，諸如2-O-甲基化[EP260,032]。
如實施例5至實施例7所示，本發(fā)明的反義寡核苷酸可以用做涉及cPLA2表達(dá)和活性的炎癥過程的抑制劑。
因而，本發(fā)明反義寡核苷酸適用于在治療和/或預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病、神經(jīng)退化性疾病，諸如AD、PD、ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在發(fā)病機理中氧化脅迫具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸和過氧化物的加速釋放的所有疾病中使用。
盡管有一個關(guān)于人單核細(xì)胞的研究表明對cPLA2表達(dá)的抑制也抑制NADPH氧化酶的活性[Li，Q和Cathcart，M.K.(1997)id ibid.]，另一報道顯示，在正常刺激下，來自cPLA2缺陷的小鼠的定植在腹膜的巨噬細(xì)胞釋放過氧化物[Gijon，M.A.等(2000)生物化學(xué)雜志27520146]。相對之下，本發(fā)明人證實在小鼠巨噬細(xì)胞中，能有效抑制cPLA2表達(dá)的反義寡核苷酸，也能有效抑制過氧化物產(chǎn)量，在單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中也一樣。這種不一致可以用這樣的事實解釋，即通常“敲除”動物模型具有正常的表型是由于，例如同功酶的過量表達(dá)和代償，從而不能精確地反映所研究基因(即蛋白或酶)缺失的影響。最重要的是，本結(jié)果是在使用1μM(終濃度)的低水平的寡核苷酸下獲得的。重要的是，本反義寡核苷酸在低、無毒性濃度下有效，這使其適于臨床目的的應(yīng)用，即作為用于治療如此處討論的，需要抑制cPLA2的狀況的治療劑。
此外，本發(fā)明反義寡核苷酸適用于在治療和/或預(yù)防小膠質(zhì)細(xì)胞被活化，例如被LPS，以及例如釋放活性氧(ROS)和/或促炎介質(zhì)的狀況中使用。所述狀況選自由炎癥、感染，以及缺血性疾病組成的組。
本發(fā)明反義寡核苷酸也可用于抑制過氧化物產(chǎn)生和釋放。通常，所述抑制在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，優(yōu)選在中性粒細(xì)胞中實現(xiàn)。
激活的中性粒細(xì)胞是最先到達(dá)炎癥位點的細(xì)胞，隨后其釋放高水平的加速炎癥進(jìn)程的類花生酸和過氧化物。因此，中性粒細(xì)胞是各種炎癥疾病的發(fā)病機理的直接效應(yīng)物(effector)，而直接抑制其功能是減少炎癥過程的有效途徑。單核細(xì)胞(和巨噬細(xì)胞)是到達(dá)炎癥位點的第二細(xì)胞種群，從而對其抑制對阻止炎癥也很重要。
另外，本發(fā)明反義寡核苷酸可用于抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的類花生酸和ROS的產(chǎn)生，所述釋放由β淀粉樣(Aβ)斑形成或其它因子諸如LPS或細(xì)胞因子誘導(dǎo)。有研究已顯示ROS形成是神經(jīng)元細(xì)胞功能障礙或死亡的原因，其在各種神經(jīng)疾病的發(fā)病機理中發(fā)揮作用。
“類似物和衍生物”意思是所述核酸分子的“片斷”、“變型”、“類似物”或“衍生物”。諸如本發(fā)明的反義寡核苷酸序列的任一個的分子的“片斷”，意思是指該分子的任一核苷子集(subset)。此類分子的“變型”意思是指一種基本類似于整個分子或其片斷的天然存在的分子。分子的“類似物”可以是但不限于旁系同源(paralogous)或同系同源(orthologous)，例如分別來自相同種(species)或不同種的同源(homologous)分子，即與不同種中基因的平行區(qū)域互補的反義寡核苷酸，因而可以在序列上具有細(xì)微差別。
本發(fā)明反義寡核苷酸的進(jìn)一步衍生物標(biāo)記有或配合(conjugate)有一個報告分子，以使本發(fā)明反義寡核苷酸可以在生物體內(nèi)被示蹤和/或被檢測?？梢赃m用任何可以被檢測的標(biāo)記或報告分子，諸如生物素、熒光蛋白、若丹明(rhodamine)，4-(4′-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(“Dabcyl”)；4-(4′-二甲基氨基疊氮苯)磺酸(磺酰氯)(“Dabsyl”)；5-((2-氨乙基)-氨基)-萘-1-磺酸(“EDANS”)；補骨脂素(Psoralene)衍生物、半抗原、青色素、吖啶、熒光對甲氨基酚衍生物、膽固醇衍生物、放射性標(biāo)記，以及金屬顆粒(例如金)。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或其功能類似物、衍生物或片斷。
從而，本發(fā)明反義寡核苷酸大致以藥物組合物的形式提供。所述組合物通過注射、局部給藥，或者口服使用。
或者，本發(fā)明的藥物組合物可包括至少兩種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或其功能類似物、衍生物或片斷的組合作為活性成分。優(yōu)選地，所述組合包括下述寡核苷酸序列1與序列3，或序列1與序列2，或者序列1與序列6，或者序列1與序列2和序列3，或者序列4與序列6，或者序列2與序列6，或者序列2與序列3，或者序列3與序列6。
在此處下文描述的實施例中，清楚表明，在同一反應(yīng)中，當(dāng)兩種或者三種反義寡核苷酸一起組合使用時，對cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)生兩者的抑制是如何更為有效。
在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物意在治療與cPLA2表達(dá)和/或通過吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶釋放自由基相關(guān)的炎癥過程。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物意在治療炎癥狀況，其中所述狀況可以是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病，神經(jīng)退化性疾病諸如AD、PD、ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在發(fā)病機理中氧化脅迫具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸和過氧化物的加速釋放的所有疾病。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物意在治療與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況。所述狀況是通常的神經(jīng)退化性疾病，優(yōu)選是阿茲海默氏癥、帕金森氏癥、ALS，或缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷。
本發(fā)明藥物組合物還意在在治療和/或預(yù)防一些狀況中使用，例如暴露在LPS中，其中小膠質(zhì)細(xì)胞被活化并釋放ROS和/或促炎介質(zhì)(類花生酸)。所述狀況選自由炎癥、感染，以及缺血性疾病組成的組。
本發(fā)明的藥物組合物通過注射的優(yōu)選應(yīng)用是皮下注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射和肌肉注射。
本發(fā)明的藥物組合物通常進(jìn)一步包括稀釋劑，和/或緩沖劑，即調(diào)節(jié)其克分子滲透壓濃度的因子，以及可選地，一種或多種載體、穩(wěn)定劑、賦形劑和/或本領(lǐng)域已知的添加劑，例如，用于在藥物組合物中增加風(fēng)味、顏色、潤滑性，或類似性質(zhì)。
優(yōu)選的緩沖劑是由10mM Tris，pH7.5-8.0組成的Tris，該溶液也用于調(diào)節(jié)克分子滲透壓濃度。
對于體內(nèi)應(yīng)用，反義寡核苷酸懸浮在無菌蒸餾水或無菌鹽水中。
載體可包括淀粉及其衍生物，纖維素及其衍生物，例如微晶纖維素、黃原膠，以及類似物。潤滑劑可包括氫化篦麻油以及類似物。
藥物組合物的制備在本領(lǐng)域是熟知的，且在許多論文和教科書中有描述，例如參見Remington’s制藥學(xué)，Gennaro A.R.編輯，Mack出版公司，伊斯頓(Easton)，賓夕法尼亞州，1990，尤其在其1521-1712頁。
用于局部給藥的藥物組合物可包括透皮貼劑(transdermal patches)、軟膏(ointment)、洗液、乳膏(creams)、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。常規(guī)的藥物載體，水、粉末或油基質(zhì)，增稠劑以及類似物是必需的或是合適的。
用于口服給藥的組合物包括粉末或粒劑、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液，膠囊、小袋(sachets)或片劑。最好具有增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑(dispensing aids)或粘合劑。
用于非腸道、鞘內(nèi)(intrathecal)或心室內(nèi)給藥的組合物和配方可包括無菌水溶液，所述無菌水溶液還可含有緩沖液、稀釋劑和其它適用的添加劑，諸如但不限于，滲透促進(jìn)劑(penetration enhancer)、載體化合物以及其它制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于，溶液、乳化液，以及含脂質(zhì)體(liposome-containing)的配方。這些組合物可產(chǎn)生于各種成分，包括但不限于，預(yù)制液體(preformed liquid)、自乳化固體和自乳化半固體。
本發(fā)明的藥物組合物可方便地以單位劑量形式提供，并可以依據(jù)制藥工業(yè)中熟知的常規(guī)技術(shù)制備。此類技術(shù)包括將活性成分與制藥載體或賦形劑聯(lián)合(association)的步驟。通常，配方的制備是通過均勻、緊密地將活性成分與液體載體或微細(xì)固體載體或兩者共同聯(lián)合，隨后，如果需要的話，形成產(chǎn)品。這類組合物可以配制成許多可能劑型的任何一種，諸如但不限于，片劑、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物也可配制成在含水、不含水或混合介質(zhì)中的懸浮液。含水懸浮液可進(jìn)一步含有增加懸浮液粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸浮液也可含穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物可配置成并作為泡沫使用。藥物泡沫(pharmaceutical foams)包括但不限于乳化液、微乳化液、乳膏、膠凍(jellies)和脂質(zhì)體配方。盡管其性質(zhì)基本類似，這些配方在終產(chǎn)物的成分和穩(wěn)定性上有所差別。
本發(fā)明的藥物組合物還可以進(jìn)一步包括其他活性因子，例如抗生素、止痛劑，以及類似物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸在用于制備治療和/或預(yù)防炎癥狀況的藥物組合物中的應(yīng)用，其中所述炎癥狀況可以是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病，神經(jīng)退化性疾病諸如AD、PD和ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在發(fā)病機理中氧化脅迫具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸和過氧化物的加速釋放的所有疾病。
此外，本發(fā)明提供了一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸在用于治療與cPLA2激活相關(guān)的狀況，以及用于治療和/或預(yù)防與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況中的應(yīng)用。通常所述狀況是神經(jīng)退化性疾病，選自由阿茲海默氏癥、帕金森氏癥、ALS，以及腦缺血和傷性腦損傷組成的組。
因此，本發(fā)明提供了一種治療與cPLA2激活相關(guān)的狀況的方法，包括對所需受試者施以至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
所述治療學(xué)有效量，或給藥劑量，依賴于待治療的疾病的嚴(yán)重程度和敏感度，治療的過程持續(xù)時間從數(shù)天至數(shù)月，或直至實現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的消退。最佳給藥進(jìn)度表可以從病人體內(nèi)的藥物積累的測量來計算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)頻率。最佳劑量可以根據(jù)各個寡核苷酸的相對效能而變化，通?？梢曰贓C50值估計，其在體外以及動物模型的體內(nèi)同樣有效。通常，劑量從0.01μg至10mg每kg體重，且可以每天、每周、每月或每年給藥一次或多次，或者甚至每2至20年一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于測量反義寡核苷酸在體液或組織中的停留時間(residence time)和濃度而容易地估計出重復(fù)頻率。
在進(jìn)行成功治療后，最好對病人進(jìn)行維持療法(maintainancetherapy)，以防止疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持劑量給藥，范圍在從0.01μg至10mg每kg體重，每天一次或多次。
如下述的實施例5至實施例7所示，用于治療炎癥狀況的最佳劑量是1-2mg/kg/天，每天給藥，共5至14天(實施例5)，或在發(fā)炎后1-2mg/kg/天的一或兩劑(實施例6和7)。
對于局部炎癥疾病而言應(yīng)用反義寡核苷酸抑制cPLA2表達(dá)是一種創(chuàng)新療法，因為它特異性地抑制在炎癥位點升高的cPLA2而不影響正常的cPLA2表達(dá)。當(dāng)同時影響在這類疾病的發(fā)病機理中涉及的激活的或預(yù)致敏的吞噬細(xì)胞的活性時，這種治療潛在性地甚至更加有效，因為這些細(xì)胞分泌高水平的加速炎癥過程的類花生酸和過氧化物。
從而，本發(fā)明還提供了一種治療炎癥狀況的方法，其中所述炎癥狀況可以是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病，神經(jīng)退化性疾病諸如AD、PD和ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷中的任一種，即在發(fā)病機理中氧化脅迫具有顯著作用，以及由于活性小膠質(zhì)細(xì)胞而具有類花生酸和過氧化物的加速釋放的所有疾病，包括對所需受試者施以至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效劑量。
此外，由于小膠質(zhì)細(xì)胞中的NADPH氧化酶的過氧化物產(chǎn)生的調(diào)節(jié)涉及cPLA2提示了cPLA2反義寡核苷酸可以用于神經(jīng)退化性疾病的治療，所述神經(jīng)退化性疾病選自由阿茲海默氏癥、帕金森氏癥、ALS，以及缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷組成的組。
同樣地，本發(fā)明還提供了一種用于治療和/或預(yù)防例如暴露在LPS中而引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，以及釋放ROS和/或促炎介質(zhì)的狀況，且其中所述狀況選自由炎癥、感染，以及缺血性疾病組成的組。所述方法包括對所需受試者施以至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
最后一方面，本發(fā)明提供了一種治療神經(jīng)退化性疾病，以及腦損害(例如由中風(fēng)或損傷引起)的方法，包括對所需受試者施以至少一種如本發(fā)明定義的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。所述狀況是通常的神經(jīng)退化性疾病，優(yōu)選是阿茲海默氏癥和帕金森氏癥，或缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷，其中具有通過活性小膠質(zhì)細(xì)胞的類花生酸和過氧化物的加速釋放。
可以用各種給藥方法對所需受試者施以本發(fā)明的反義寡核苷酸。寡核苷酸可以通過靜脈內(nèi)(i.v.)、肌肉內(nèi)(i.m.)、腹膜內(nèi)(i.p.)注射，口服(以液體形式或以例如膠囊、藥丸、錠劑等的劑量單位形式制備)而施藥。為了在治療學(xué)上更有效，寡核苷酸應(yīng)該以一種在注射后，或更優(yōu)選地在口服給藥后能使其在系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)定的形式制備。
或者，本發(fā)明的寡核苷酸也可通過使用貼劑、軟膏或乳膏的透皮施藥而釋放。
此外，包括以本發(fā)明描述的反義寡核苷酸的藥物組合物作為活性劑可以以許多方式給藥，取決于需要局部還是全身治療以及待治療的區(qū)域。給藥可以是局部的(topical)(包括眼睛以及包括陰道和直腸黏膜的給藥)，肺部的，例如通過吸入或吹入粉末和氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，表皮以及透皮)，口服的或腸胃外的。腸胃外給藥包括靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)，或心室內(nèi)，給藥。具有至少一個2’-O-甲氧乙基修飾的寡核苷酸據(jù)信對口服給藥尤其有益。
如下述實施例中所述，在用小鼠和大鼠中的三種不同的炎癥模型(關(guān)節(jié)炎、ARDS和腹膜炎)的初步試驗證實了特定的cPLA2反義寡核苷酸作為抗炎治療的有效性。
本發(fā)明由其權(quán)利要求限定，權(quán)利要求的內(nèi)容應(yīng)理解為說明書公開中所包括的內(nèi)容。
如此處所公開和描述的，應(yīng)該理解到，本發(fā)明不限于此處公開的特定的實施例、工藝步驟，以及原料，因為這些工藝步驟和原料可以在某種程度上變化。也應(yīng)該理解到，此處使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案的用途，而不意在限制，因為本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求和其等同物所限定。
必須注意，除非其內(nèi)容明顯地指明，如本說明書和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)的指代物。
除非其上下文要求其他情形，通篇本說明書和隨后的權(quán)利要求中的詞“包括(comprise)”，以及其諸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的變型，應(yīng)該理解成意指包括所述的整體或步驟，或整體或步驟的組，但不排除任何其它整體或步驟，或整體或步驟的組。
下述的實施例是本發(fā)明人在實施本發(fā)明各方面時采用的代表性技術(shù)。應(yīng)該理解，盡管這些技術(shù)對于實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是示例性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開，將認(rèn)識到可以進(jìn)行不偏離本發(fā)明預(yù)期范圍的大量修改。
實施例實驗步驟分子生物學(xué)的一般方法分子生物學(xué)領(lǐng)域的許多方法在此不再贅述，因為它們對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。這類方法包括PCR、cDNA表達(dá)、哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，以及類似的技術(shù)。描述這些方法的教科書為，例如Sambrook等(1989)分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室，ISBN0879693096；F.M.Ausubel(1988)分子生物學(xué)最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，ISBN047150338X，John Wiley&Sons公司。此外，一些免疫學(xué)技術(shù)在此處不是在每一情況下都得到詳細(xì)描述，例如Western印跡，因為它們對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。參見，例如，Harlow和Lane(1988)抗體技術(shù)實驗指南，冷泉港實驗室。
寡核苷酸表1下述實施例中使用的寡核苷酸

注意下劃線顯示的是硫代磷酸化的核苷。
實施例1抗-cPLA2反義寡核苷酸的合成原始合成了十四條針對cPLA2的部分硫代磷酸化[Stein等(1988)核酸研究163209-3221]的寡核苷酸。在使用前，寡核苷酸用HPLC純化并通過質(zhì)譜分析(Sigma，英國)測試純度。在選擇前，通過使用Blast程序篩選唯一性而分析序列，并同時使用Mulfold對沒有二級結(jié)構(gòu)和寡核苷酸配對進(jìn)行檢驗[Jaeger，J.A.(1989)酶學(xué)方法183281-306]。
初步實驗(未示出)表明，從這些十四條寡核苷酸中，發(fā)現(xiàn)僅有六條寡核苷酸能有效地抑制cPLA2的表達(dá)，它們的序列在上表1中詳細(xì)列出。
僅六條反義寡核苷酸顯示出顯著活性的事實提示它們具有對靶序列的更高的特異性。剩余的八條寡核苷酸在實驗中用作對照。
寡核苷酸在5’和3’兩個末端的最后3個堿基上都具有硫代磷酸化修飾(如表1中的下劃線所示)，并通過計算機基于采用RNADraw V1.1的方法對cPLA2mRNA的最先的400百堿基對(N端)進(jìn)行設(shè)計(表1)。
部分硫代磷酸化的寡核苷酸(PPS)毒性更小，且比硫代磷酸化的寡核苷酸特異性更好，但卻具有類似的穩(wěn)定性和細(xì)胞吸收。一些PPS含有已顯示為能增加細(xì)胞吸收的GGGG(C10)和GGG(C8和C9)(參見表1)。PPS C8、C9在內(nèi)嘧啶(t)上也含有已顯示為能增加穩(wěn)定性和保護(hù)核苷酸免于核酸內(nèi)切酶切斷的硫代磷酸化(表1，下劃線標(biāo)記)。反義寡核苷酸中的五條不含有已顯示為刺激免疫反應(yīng)的CpG。和已發(fā)表的，利用不同的給藥系統(tǒng)以增加反義寡核苷酸的吸收的體外研究形成對照，在此處所示的所有實驗中，施以裸露的PPS(naked PPS)，因為它們可以以這種形式用于體內(nèi)治療[Pirollo，K.F.等2003id ibid.]。因此，反義寡核苷酸的所有臨床試驗都用裸寡核苷酸進(jìn)行。例如，與在組織培養(yǎng)中進(jìn)行的實驗[Jansen，B.等(2000)柳葉刀3561728-1733]形成對照，針對癌癥病人的Bcl-2的體內(nèi)臨床試驗的寡核苷酸釋放不需要陽離子脂質(zhì)(cationic lipid)。在體內(nèi)分析中通常如此，且到目前為止還不是很清楚為什么不需要載體。一個假設(shè)是寡核苷酸與循環(huán)蛋白(circulating protein)相互作用，這既保護(hù)了它們免于降解，也以未知方式作為載體[Dias，N.和Stein.C.A.(2002)歐洲制藥學(xué)和生物制藥學(xué)雜志54263-269]。
如圖3-圖7所示，PPS反義寡核苷酸對cPLA2表達(dá)的抑制和受刺激的過氧化物產(chǎn)生的抑制之間具有明顯的關(guān)聯(lián)性。每種PPS寡核苷酸在不同的吞噬細(xì)胞類型中產(chǎn)生對cPLA2蛋白表達(dá)的顯著抑制，且它們的組合產(chǎn)生顯著增強的抑制。
如圖3和圖4所示，本發(fā)明PPS反義寡核苷酸遠(yuǎn)比以前報道的寡核苷酸更加有效[US6,008,344；Roshak等(1994)id ibid.；Muthalif等(1996)id ibid.；Marshall等(1997)id ibid.；Anderson等(1997)id ibid.；Li，Q.和Cathcart，M.K.(1997)id ibid.；Zhao，X等(2002)id ibid.]。此外，在先前的報道中，僅僅測試了這些反義寡核苷酸抑制mRNA合成的能力[US6,008,344]。
還評估了寡核苷酸兩端修飾的數(shù)量(和種類)的影響(數(shù)據(jù)未示出)。所觀察到的抑制cPLA2表達(dá)和NADPH氧化酶的效率排序如下具有3個修飾的PPS＞具有2個修飾的PPS＞具有1個修飾的PPS＞無修飾。
PPS反義寡核苷酸在吞噬細(xì)胞中，如所示的單核細(xì)胞，對cPLA2蛋白表達(dá)的抑制比在內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞中更加有效(數(shù)據(jù)未示出)。尤其是涉及直接影響炎癥位點的吞噬細(xì)胞，而不影響器官的炎癥治療的時候，這種現(xiàn)象具有優(yōu)勢。
實施例2cPLA2反義寡核苷酸在外周血人單核細(xì)胞中對cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)生的影響cPLA2蛋白的表達(dá)通過Western印跡分析，利用本發(fā)明人制備的抗cPLA2的抗體，該抗體比市場上商業(yè)可利用的抗體更為有效(圖2)。
在外周血人單核細(xì)胞(圖3和圖4)和鼠巨噬細(xì)胞(圖5)中研究了不同的PPS反義寡核苷酸和其組合物對cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)生的影響。將裸(無諸如lipofectin等的轉(zhuǎn)染溶液)PPS反義寡核苷酸(終濃度1μM)加入含10％FCS的RPMI中的細(xì)胞懸浮液中37℃下16h。分析這些細(xì)胞的由5ng/ml PMA刺激的過氧化物產(chǎn)量(通過細(xì)胞色素c還原)并分析細(xì)胞裂解液中的cPLA2的表達(dá)(通過Western印跡分析)。如所示，每一PPS反義寡核苷酸產(chǎn)生50-75％之間的過氧化物產(chǎn)量的抑制，這與它們抑制cPLA2表達(dá)的作用相符合。cPLA2的水平通過反射模式的光密度定量分析(Hoefer，Hoefer科學(xué)儀器公司，美國舊金山)。這兩個參數(shù)的相關(guān)性表示在圖6中。
分別如圖3和圖4所示，P1[Roshak等(1994)id ibid.；Muthalif等(1996)id ibid.；Marshall等(1997)id ibid.；Anderson等(1997)id ibid.]和P2[Li，Q.和Cathcart，M.K.(1997)id ibid.]，以及IS1和IS2[US6,008,344]對cPLA2表達(dá)或過氧化物產(chǎn)生沒有任何影響。最重要的是，在US6,008,344中報道的寡核苷酸IS1和IS2分別對mRNA表達(dá)產(chǎn)生100％和92％的抑制。然而，它們的影響的分析僅僅通過mRNA表達(dá)的抑制而不是cPLA2蛋白表達(dá)的抑制。
在其原始公布的文獻(xiàn)中，P1、P2、IS1和IS2合成時在所有堿基中都具有硫代磷酸化修飾。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這些寡核苷酸完全硫代磷酸化時，會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，且在16小時孵育后殺死大約60-70％的細(xì)胞(數(shù)據(jù)未示出)。這些結(jié)果與一個先前的報道是一致的，該報道顯示在所有堿基中都具有硫代磷酸化修飾的寡核苷酸的毒性大得多[Pirollo，K.F.等2003id ibid.]。因而，特別要注意，在本研究中，與其原始的寡核苷酸不同，P1、P2、IS1和IS2在其合成時僅在最前和最后三個堿基中有硫代磷酸化修飾，以為了與本發(fā)明人合成的PPS反義寡核苷酸的作用進(jìn)行更精確地比較。
顯示在圖2和圖3中的結(jié)果表明，本發(fā)明人合成的(和權(quán)利要求的)反義寡核苷酸要優(yōu)于文獻(xiàn)中描述的寡核苷酸。尤其是，要強調(diào)前者a.毒性更小b.抑制cPLA2蛋白表達(dá)更加有效。
與P1、P2、IS 1和IS2相比，本反義寡核苷酸尤其是優(yōu)選的，因為它們可以在不用像lipofectin這樣的細(xì)胞釋放系統(tǒng)(cell delivery system)的情況下導(dǎo)入細(xì)胞并發(fā)揮其活性。
實施例3cPLA2反義寡核苷酸在外周血人中性粒細(xì)胞中對cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)生的影響研究了不同的PPS反義寡核苷酸和其組合對在外周血人中性粒細(xì)胞中的cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)生的影響。在，將裸反義寡核苷酸(終濃度1μM)加入2×105個中性粒細(xì)胞中37℃下6h。中性粒細(xì)胞(純度95％)通過Ficoll/Hypaque離心、葡聚糖沉淀和紅細(xì)胞低滲裂解而分離[Levy，R.等(2000)血液95660-665]。如圖7所示，甚至在與中性粒細(xì)胞6小時孵育后，還是具有對過氧化物產(chǎn)生的少量但顯著(P＜0.05)的抑制。在另一實驗中，在16h孵育后表現(xiàn)出了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
當(dāng)細(xì)胞用生理激動劑刺激時，各種反義寡核苷酸對過氧化物產(chǎn)生的抑制得到了顯著的提高，所述生理拮抗劑的實例有fMLP、調(diào)理的酵母多糖(opsonized zymosan)(OZ)(圖8)、LTB4、血管緊縮素II或AGEs(糖化終末產(chǎn)物(advanced glycation end production))(數(shù)據(jù)未示出)，它們結(jié)合細(xì)胞膜上的特異性受體。
PPS對從炎癥疾病病人(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘活膿血癥，數(shù)據(jù)未示出)提純的中性粒細(xì)胞的作用要顯著高于從健康對照獲得的中性粒細(xì)胞。這種現(xiàn)象與本發(fā)明人的先前研究[Levy，R.等(2000)id ibid.]一致，該研究報道了在疾病期間中性粒細(xì)胞中的cPLA2水平更高，表明其合成的速率更高，從而更易于被靶向。
特別要注意，圖3至圖6描述的實驗采用了非生理刺激物PMA，一種極強的NADPH氧化酶激活劑，該酶繞過受體而作用于PKC。這使得能分析反義寡核苷酸直接對NADPH氧化酶的作用，因為在這種情況下，消除了不同受體的表達(dá)和其結(jié)合刺激物的影響。
實施例4cPLA2反義寡核苷酸在大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中對cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)生的影響研究了反義寡核苷酸和其組合對大鼠腦中分離的小膠質(zhì)細(xì)胞的作用。將PPS反義寡核苷酸(終濃度1μM)加入小膠質(zhì)細(xì)胞中16h(與用于單核細(xì)胞的條件類似)。對cPLA2蛋白表達(dá)具有顯著的抑制。細(xì)胞用2mg/ml PMA或用10μMβ淀粉樣蛋白刺激，其過氧化物產(chǎn)量用熒光探針安普萊克司紅(Amplex Red)分析。如圖9所示，反義寡核苷酸產(chǎn)生了對過氧化物產(chǎn)量的顯著抑制，與cPLA2蛋白表達(dá)相符。有趣的是，有1個堿基與大鼠序列不配對的反義寡核苷酸C8，不產(chǎn)生對過氧化物產(chǎn)量的抑制，顯示了反義寡核苷酸作用的高度特異性。當(dāng)細(xì)胞用β淀粉樣蛋白刺激時，抑制要強烈得多。將反義寡核苷酸與小膠質(zhì)細(xì)胞一起孵育48h產(chǎn)生cPLA2表達(dá)和過氧化物產(chǎn)量的更強抑制(數(shù)據(jù)未示出)。這個結(jié)果尤其重要，因為β淀粉樣蛋白在諸如阿茲海默氏癥的腦和神經(jīng)退化性疾病的發(fā)病機理中發(fā)揮了重要作用。
所有細(xì)胞類型在X150的反義寡核苷酸濃度時的孵育對細(xì)胞無毒性，且不影響不受cPLA2調(diào)節(jié)的細(xì)胞功能(數(shù)據(jù)未示出)。
實施例5炎癥的動物模型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是自免疫關(guān)節(jié)炎的實驗?zāi)Ｐ?，它與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)具有許多臨床和病理的類似之處。如文獻(xiàn)所述[Bendele，A.M.等(2000)關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病，432648-58]，由免疫敏感的(immunizingsusceptible)動物用II型膠原(CII)誘導(dǎo)CIA。所有小鼠都被維持在一特定的無膠原環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)的鼠食和水喂養(yǎng)。雞CII(Sigma-Aldrich，2mg/ml)在4℃下在10mM醋酸和等體積的CFA(完全弗氏佐劑(completeFreund′s adjuvant))的液體中過夜溶解。通過將100mg的熱滅活的結(jié)核分枝桿菌(heat-killed M.tuberculosis)(H37Ra，Difco，美國密歇根州底特律)與20ml不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich，美國密蘇里州圣路易斯)混和制備CFA。小鼠(7至10周齡)在尾巴的根部皮內(nèi)注射并在第7天或第21天加強注射(boost)。對照小鼠用無CII的CFA處理。關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性通過用一腳趾測徑器依據(jù)下述等級直接檢查監(jiān)視等級0，無腫脹；1，稍腫脹和紅斑；2，顯著發(fā)炎；以及3，關(guān)節(jié)僵直。評定每一肢，給出每一動物的最大可能分?jǐn)?shù)12。從動物爪吸取液體，以測定細(xì)胞因子(mRNA和蛋白水平)和白細(xì)胞。處死小鼠后，收集爪子、固定、脫鈣，并用石蠟包埋。切片用蘇木精和曙紅染色，并依據(jù)下述等級評分0，無炎癥；1，滑膜細(xì)胞層的稍微增厚和/或襯里下層(sublining)有一些炎性細(xì)胞；2，滑膜襯里層(synovial lining)增厚，襯里下層的滲透，以及局部軟骨腐蝕；以及3，滑液空間的滲透，關(guān)節(jié)翳形成，軟骨損壞，以及骨腐蝕。
抗CII抗體的檢測HRP結(jié)合的(HRP-conjugated)特異性抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgM和IgA的第二抗體用于對CII的抗體檢測的ELISA。
細(xì)胞分離利用特異的結(jié)合生物素的抗CD11b、CD3、CD4，和CD8的抗體，以及生物素結(jié)合物Dynabeads(biotin binder Dynabeads)進(jìn)行滑膜細(xì)胞脾細(xì)胞子集(splenocyte subsets of synovial cells)的正向選擇。在正向選擇CD11b+和CD3+后，用生物素CD45孵育滑膜細(xì)胞并用過量的抗生物素蛋白-磁珠反向選擇。剩余的CD45陰性細(xì)胞用作RNA提取?；喊准?xì)胞從滑液滲出物中獲得，并用Ficoll-Hypaque密度梯度離心純化。
本發(fā)明人成功地開發(fā)了CIA模型，例如對惡化的CIA小鼠的腫脹肢體與對照小鼠的肢體的比較所論證的(圖10A)。CIA小鼠肢體的組織學(xué)評估(圖10B)與如圖10A所示的對肢體的直接觀察監(jiān)視的關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性相關(guān)。在一CIA小鼠的關(guān)節(jié)切片中可見炎性細(xì)胞(尤其是中性粒細(xì)胞)的滲透(圖10C)。CIA小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的行走困難(數(shù)據(jù)未示出)。
基于用各種PPS濃度和組合進(jìn)行的初步實驗，對于3種不同的PPS的組合(2，4和10)，限定了最佳濃度為2mg/kg，所述組合在此處也稱之為cocktail。這個濃度處于用于人治療和動物模型的范圍內(nèi)。
在治療炎癥狀況下，無菌的反義寡核苷酸儲液(stock)(100μM)以合適的濃度溶解在無菌鹽水中，并在尾巴根部或在腫脹的關(guān)節(jié)處，通過靜脈注射或皮內(nèi)注射注入病鼠中。
如圖11所示，每天靜脈注射2mg/kg的“cocktail”共14天使關(guān)節(jié)炎顯著消退，這一點通過通過肢體腫脹度的減小(圖11A)，通過疾病嚴(yán)重性分?jǐn)?shù)的降低，通過小鼠自由運動和跑動能力的恢復(fù)(數(shù)據(jù)未示出)，以及通過血清IL-6和TNFα水平的降低而檢測到。
實施例6炎癥的動物模型腹膜炎如以前所述[Levy，R.等(1989)3生物調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)態(tài)劑雜志(J.Biol.Regul.Homeost.R Agents)5-12]，通過對CD1小鼠注射Candia建立小鼠腹膜炎模型，或者通過注射不同劑量的革蘭氏陽性菌，腹膜炎可以用致使動物死亡的致死劑量的或產(chǎn)生中度疾病的中等劑量的candida或細(xì)菌(表皮葡萄球菌(S.epidermitis))或革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)誘導(dǎo)。50％致死劑量確定為表皮葡萄球菌6×108CFU，大腸桿菌1.5×107CFU。感染和/或炎癥的標(biāo)志為腹膜炎區(qū)域的血細(xì)胞的數(shù)目和種群，血液中炎性細(xì)胞因子諸如TNFα、IL1和IL6的濃度，以及腹膜切片的組織學(xué)分析。注射了致死量細(xì)菌的小鼠在注射后2h用反義寡核苷酸處理，隨后在不同時間間隔注射反義寡核苷酸。在這些實驗中，評估了反義寡核苷酸對小鼠存活的影響。對注射更低劑量細(xì)菌的小鼠，通過感染和/或炎癥的標(biāo)志評估反義寡核苷酸對病理的作用(如所述注射)。
實施例7炎癥的動物模型無菌性腹膜炎如先前所述[Segal，B.H.等(2002)白細(xì)胞生物學(xué)雜志(JLeukoc Biol)71410]，無菌性腹膜炎的模型在ICR小鼠中通過腹膜內(nèi)注射3ml無菌4％硫乙醇酸鹽(thioglycollate)(TG)建立。炎癥的評估通過腹膜炎腔中的血細(xì)胞數(shù)目和種群、LTB4的濃度以及炎性細(xì)胞因子TNFα和IL6在無細(xì)胞的腹膜液和血清中的存在度確定。將10ml無菌PBS注射進(jìn)腹膜腔內(nèi)，以收集細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)在臺盼藍(lán)染色后通過顯微鏡方法測定。細(xì)胞種群的組成利用抗小鼠中性粒細(xì)胞(MCA771F)、抗小鼠巨噬細(xì)胞(F4/80)以及抗小鼠淋巴細(xì)胞(CD3)的抗體，通過FACS測定。細(xì)胞種群的組成還在姬姆色素(Giemsa)染色后在顯微鏡下確定。圖12A-圖12B表示了在無菌性腹膜炎4天期間血液白細(xì)胞計數(shù)(圖12A)和細(xì)胞種群(圖12B)的變化。在TG注射后24h檢測到高水平的中性粒細(xì)胞，隨后被單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞代替。在腹膜炎誘導(dǎo)后受刺激的吞噬細(xì)胞過氧化物產(chǎn)量具有顯著的提高，其最高速率在腹膜炎誘導(dǎo)后24h。
在無菌性腹膜炎24h期間，血清和腹膜腔中LTB4的水平顯示在圖13A-圖13B中。在腹膜炎誘導(dǎo)1小時后，LTB4水平在血液中具有顯著的提高。在5h期間LTB4保持高水平，隨后在8小時后降至一半。在腹膜炎誘導(dǎo)后16小時，不能在血液中檢測到LTB4。在腹膜腔內(nèi)觀察到類似的模式，但是衰減更慢，且僅在24h后不再檢測到LTB4。
依據(jù)本結(jié)果并與文獻(xiàn)一致，在腹膜炎模型中最先積聚的細(xì)胞是中性粒細(xì)胞。從而，在第一組實驗中，反義寡核苷酸的作用主要對無菌性腹膜炎誘導(dǎo)24h后中性粒細(xì)胞的積聚和活性進(jìn)行分析。將針對cPLA2的PPS反義寡核苷酸的特定組合(“cocktail”)的兩個劑量溶解在無菌水(0.2ml)中，并在腹膜炎誘導(dǎo)1h和4h后靜脈注射進(jìn)小鼠的尾巴中給藥。如圖14A-圖14c所示(兩只小鼠的結(jié)果)，這種處理使得腹膜腔內(nèi)存在的中性粒細(xì)胞數(shù)顯著減少(表示為通過FACS分析檢測的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞種群分布)，且在炎癥誘導(dǎo)24h后稍微抑制腹膜細(xì)胞的經(jīng)刺激的過氧化物的產(chǎn)生。Cocktail在34只小鼠中導(dǎo)致腹膜聚集的中性粒細(xì)胞和過氧化物產(chǎn)生的減少功效與34只未處理的無菌性腹膜炎小鼠的比較表示在圖15A-圖15B中。未受刺激的細(xì)胞的過氧化物釋放非常重要，因為它反映了腹膜腔內(nèi)的腹膜細(xì)胞的行為。因而，從靜止細(xì)胞釋放的過氧化物用熒光探針二氫若丹明-123(1mM)估定，該方法非常敏感，能檢測非常低水平的過氧化物。如圖16中的代表性結(jié)果所示，腹膜炎誘導(dǎo)后用cocktail處理24h后，顯著降低了腹膜細(xì)胞的過氧化物釋放。
研究了4天的無菌性腹膜炎期間反義寡核苷酸處理對腹膜細(xì)胞種群的影響。在4天的腹膜炎期間，在處理的小鼠的腹膜中聚集的中性粒細(xì)胞數(shù)大大減少且巨噬細(xì)胞數(shù)顯著降低(圖17A-圖17B)。在四天的腹膜炎期間，反義寡核苷酸處理的小鼠的腹膜細(xì)胞的受刺激的過氧化物產(chǎn)量顯著低于未處理小鼠(圖18A-圖18B)。
反義寡核苷酸cocktail處理降低了腹膜腔內(nèi)的在腹膜炎誘導(dǎo)后24小時期間測得的LTB4水平(圖19A-圖19B)，與聚集至腹膜腔的中性粒細(xì)胞的減少相符。
用熒光標(biāo)記的反義寡核苷酸(在最后的核苷酸上用FITC標(biāo)記)檢測了靜脈注射24小時后反義寡核苷酸在腹膜血液細(xì)胞中的積聚(圖21A-圖21B)。同時通過組織切片分析了熒光反義寡核苷酸在不同器官中的分布(數(shù)據(jù)未示出)。在進(jìn)一步的實驗中，進(jìn)行了不同的反義寡核苷酸過量用藥，以確定其毒性。X100的cocktail對于小鼠沒有毒性(數(shù)據(jù)未示出)。
實施例8炎癥的動物模型實驗性急性肺損傷，由1-LPS/酵母聚糖給藥誘導(dǎo)。
將小鼠麻醉并機械通風(fēng)。在實驗期間，向通風(fēng)系統(tǒng)持續(xù)供應(yīng)氧氣。在靜脈(i.v.)給藥前一分鐘，釋放兩次深吸氣(deep inhalation)(3×潮容量(tidal volume))，至標(biāo)準(zhǔn)化體積歷史(standardize volume history)并將測量設(shè)定為基線。然后通過靜脈注射使小鼠接受3mg/kg的來自大腸桿菌O111B4的LPS(Sigma化學(xué)公司，密蘇里州圣路易斯)。兩小時后，靜脈給藥10mg/kg的來自釀酒酵母(Sigma)的酵母聚糖A。在鹽水處理組，動物以相同的方式接受鹽水而不是LPS和酵母聚糖，并用作對照。在所有組中，測量以30分鐘的間隔進(jìn)行4小時。在一些動物中，觀察延長至達(dá)6小時。為了對肺損傷的發(fā)展進(jìn)行生理性評估，測量了EL(肺的順應(yīng)性(lung compliance)的倒數(shù))。并測量氣管壓(Ptr)、流量和容量(V)。EL和肺阻力(lung resistance)(RL，數(shù)據(jù)未示出)通過校正運動方程計算Ptr＝ELV+RL(dV/dt)+K，其中K是常數(shù)。EL的變化反映了肺實質(zhì)的改變和肺的硬化。
2-HCl吸入誘導(dǎo)。
在基線測量后，麻醉的、機械通風(fēng)的小鼠通過鞘內(nèi)注射(i.t.)接受2mg/kg的HCl(pH＝1.5)隨之以一個空氣藥丸(3mg/kg)。在鹽水處理組，動物以相同的方式接受鹽水而不是HCl，并用作對照。在所有組中，測量以30分鐘的間隔進(jìn)行2小時。在一些動物中，觀察延長至達(dá)5小時。為了評估急性肺損傷，EL測量值作為一個生理參數(shù)。
肺水腫的評估-在實驗結(jié)束時，計算了肺的干/濕質(zhì)量比，以評估肺水腫。對離體肺排干血液后，進(jìn)行肺濕重的測量。然后在重力對流爐(gravityconvection oven)中將肺在90℃加熱72h至恒重，對殘余物稱重作為肺的干質(zhì)量。
支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)-在實驗結(jié)束時，在每組進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)(用5×1ml磷酸鹽緩沖液)。在每一動物中，一致性地回收了90％(4.5ml)的總注射體積。BAL液在450g離心10分鐘后，從細(xì)胞組份中測定BAL液的總細(xì)胞計數(shù)和分類細(xì)胞計數(shù)(differential count)。在測定蛋白含量前將上清液儲存在-70℃。蛋白濃度以牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)物用Lowry法測定。
凝血噁烷(thromboxane)和白三烯的測量-用酶免疫分析(EIA)試劑盒測定。
序列表<110>莫爾伊薩姆研究有限公司<120>針對PLA2的反義寡核苷酸、組合物及其應(yīng)用<130>16790-WO-03<160>12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>P3<400>12gtgctggtaa ggatctat18
權(quán)利要求
1.一種針對胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA序列的開放閱讀框(ORF)的反義寡核苷酸，以及其功能類似物、衍生物或片斷，其中所述反義寡核苷酸的互補性在所述ORF的核苷145至400之間的區(qū)域內(nèi)，且其中所述反義寡核苷酸能抑制cPLA2蛋白的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述反義寡核苷酸還能夠抑制NADPH氧化酶的活性。
3.一種針對胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA序列的開放閱讀框5’區(qū)域的反義寡核苷酸，以及其功能類似物、衍生物或片斷，其特征在于，所述反義寡核苷酸具有如序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6中的任一序列表示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述反義寡核苷酸的長度從15至達(dá)30個核苷酸，優(yōu)選長度為17至21個核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的最前三個和/或最后三個核苷上具有硫代磷酸化修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的第十個核苷上具有硫代磷酸化修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸的最前三個和/或最后三個核苷被2-O-甲基化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，用于抑制過氧化物的產(chǎn)生和釋放。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述抑制發(fā)生在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的任一種中，優(yōu)選在中性粒細(xì)胞中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的反義寡核苷酸，用于治療與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，用于治療和/或預(yù)防與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)相關(guān)的疾病，其中，所述疾病選自由阿茲海默氏癥，或帕金森氏癥，肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)，腦缺血性損傷和創(chuàng)傷性頭部損傷組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至7之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，用作與cPLA2表達(dá)相關(guān)的炎癥過程的抑制劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的反義寡核苷酸，用于在治療和/或預(yù)防炎癥狀況中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述狀況是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病中的任一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至7之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，用于在治療和/或預(yù)防小膠質(zhì)細(xì)胞被活化以及釋放活性氧(ROS)和/或促炎介質(zhì)的狀況中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述狀況選自由炎癥、感染，以及缺血性疾病組成的組。
17.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸，可選地標(biāo)記有熒光、放射性物質(zhì)、金屬顆粒，以及任何適用的標(biāo)記方法中的一種。
18.一種藥物組合物，所述藥物組合物包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至9之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸作為活性劑。
19.一種藥物組合物，所述藥物組合物包括至少兩種根據(jù)權(quán)利要求1至9之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸的組合作為活性劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合包括下述寡核苷酸序列1與序列3，或序列1與序列2，或者序列1與序列6，或者序列1與序列2和序列3，或者序列4與序列6，或者序列2與序列6，或者序列2與序列3，或者序列3與序列6。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20之任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，用于醫(yī)療用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，用于治療與cPLA2表達(dá)和/或通過吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的自由基釋放相關(guān)的炎癥過程。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，用于治療炎癥狀況。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其特征在于，所述狀況是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病中的一種。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，用于在治療和/或預(yù)防小膠質(zhì)細(xì)胞被活化以及釋放活性氧(ROS)和/或促炎介質(zhì)的狀況中的應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其特征在于，所述狀況選自由炎癥、感染，以及缺血性疾病組成的組。
27.包括作為活性劑的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸的藥物組合物，用于治療與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物，用于治療和/或預(yù)防CNS相關(guān)的疾病，其中，所述疾病選自由阿茲海默氏癥、帕金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)，以及腦缺血損傷和創(chuàng)傷性頭部損傷組成的組。
29.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的藥物組合物，可選地進(jìn)一步包括緩沖液、添加劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑和/或賦形劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至7和12至14之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸在制備用于治療和/或預(yù)防炎癥狀況的藥物組合物中的應(yīng)用，其中所述狀況可以是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病中的任一種。
31.根據(jù)權(quán)利要求1至7、15和16之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸在制備用于治療和/或預(yù)防小膠質(zhì)細(xì)胞被活化以及釋放活性氧(ROS)和/或促炎介質(zhì)的狀況的藥物組合物中的應(yīng)用，其中所述狀況選自由炎癥、感染，以及缺血性疾病組成的組。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至7和12至14之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸在治療與cPLA2激活相關(guān)的狀況中的應(yīng)用。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至11之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸在治療/或預(yù)防與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況中的應(yīng)用。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用，用于治療/或預(yù)防神經(jīng)退化性疾病，尤其是阿茲海默氏癥和帕金森氏癥。
35. 一種治療與cPLA2激活相關(guān)的狀況的方法，包括對所需要的受試者施以給藥治療學(xué)有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至7和12至14之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
36. 一種治療炎癥狀況的方法，包括對所需受試者施以至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至7和12至14之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述炎癥狀況可以是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、ARDS、哮喘、鼻炎、先天性肺纖維化、腹膜炎、心血管炎癥、心肌缺血、再灌注損傷、動脈硬化癥、膿血癥、創(chuàng)傷、II型糖尿病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、胃腸炎癥、硬化和炎癥性腸病中的任一種。
38.一種用于治療和/或預(yù)防小膠質(zhì)細(xì)胞被活化以及釋放活性氧(ROS)和/或促炎介質(zhì)的狀況的方法，包括對所需受試者施以至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至7、1 5和16之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于所述狀況選自由炎癥、感染，以及缺血性疾病組成的組。
40.一種治療與Aβ斑積聚相關(guān)的狀況的方法，包括對所需受試者施以至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
41.一種治療神經(jīng)退化性疾病，優(yōu)選地是阿茲海默氏癥和帕金森氏癥的方法，包括對所需受試者施以至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之任一權(quán)利要求限定的反義寡核苷酸，或包括它的組合物的治療學(xué)有效量。
42.一種在體內(nèi)或體外抑制cPLA2表達(dá)的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1至8之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸或含有它的組合物接觸細(xì)胞一段適宜的時間量。
43.一種在體內(nèi)或體外抑制cPLA2活性的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1至8之任一權(quán)利要求所述的反義寡核苷酸或含有它的組合物接觸細(xì)胞一段適宜的時間量。
44.根據(jù)權(quán)利要求42和43所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是吞噬細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了針對cPLA
文檔編號C07H21/04GK101072788SQ200580012674
公開日2007年11月14日 申請日期2005年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月22日
發(fā)明者拉黑爾·利維 申請人:莫爾研究應(yīng)用有限公司, 內(nèi)蓋夫研究發(fā)展機構(gòu)本古里大學(xué)