含有6-n-甲基賴氨酸殘基的抗原在制備輔助診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了含有6-N-甲基賴氨酸殘基的抗原在制備輔助診斷或篩查系統(tǒng)性紅斑狼瘡試劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明人IgM可以識別6-N-甲基賴氨酸，人IgM可以結(jié)合含6-N-甲基賴氨酸殘基的任意多肽或蛋白質(zhì)，6-N-甲基賴氨酸對識別6-N-甲基賴氨酸的IgM具有抑制作用，但是非甲基化修飾的賴氨酸卻無抑制作用，大多數(shù)健康人存在較高水平的此種IgM抗體，而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中此種IgM抗體水平明顯降低。含有6-N-甲基賴氨酸殘基的抗原可用于制備輔助診斷或篩查系統(tǒng)性紅斑狼瘡試劑或試劑盒。
【專利說明】含有6-N-甲基賴氨酸殘基的抗原在制備輔助診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含有6-N-甲基賴氨酸(又名Ne-甲基-L-賴氨酸，N6-甲基-L-賴氨酸)殘基的多肽或蛋白質(zhì)抗原的新用途，特別涉及含有6-N-甲基賴氨酸殘基的抗原在制備輔助診斷或篩查系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)翻譯后修飾如糖基化、磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化、SUMO化等等是重要的生命現(xiàn)象，影響著基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞的活化與抑制、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能各個方面。和本發(fā)明相關(guān)的是賴氨酸的甲基化修飾，該修飾主要發(fā)生在細(xì)胞核的組蛋白中，少量的其他一些蛋白如p53，NFkB, STAT3等也會發(fā)生賴氨酸甲基化修飾。賴氨酸甲基化修飾有三種形式，即其側(cè)鏈ε氨基的一、二、三甲基化，這些修飾與基因的沉默和活化密切相關(guān)，是近些年來表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。各種組蛋白，即連接組蛋白(Η1)，形成核小體的核心組蛋白(Η2Α、Η2Β、Η3和Η4)以及一些組蛋白變體都可以發(fā)生賴氨酸甲基化修飾，其中組蛋白Η3的第4、9、27、36和79位，Η4的第20位賴氨酸甲基化修飾最為常見。
[0003]盡管蛋白質(zhì)翻譯后修飾具有重要的作用，但是各種修飾也帶來蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，可為自身抗體提供新的表位。這些新表位可被T細(xì)胞或者B細(xì)胞的抗原受體識別,進(jìn)而產(chǎn)生自身反應(yīng)。不過迄今為止蛋白質(zhì)翻譯后修飾誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體的研究報(bào)道非常少。Plaue等發(fā)現(xiàn)泛素化的組蛋白Η2Α和Η2Β是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的自身抗原。van derVlag等報(bào)道凋亡相關(guān)的組蛋白修飾產(chǎn)生優(yōu)勢抗原H2BK12ac、H3K27me3、H4K8ac3、H4K12ac3和H4K16ac3，可被SLE患者和狼瘡鼠的自身抗體識別。在一例患有盤狀紅斑狼瘡和慢性淋巴細(xì)胞白血病的患者中發(fā)現(xiàn)了針對H3K9me3S10ph的抗體。至于蛋白質(zhì)翻譯后修飾在正常人群中是否能產(chǎn)生抗體以及所產(chǎn)生抗體的性質(zhì)幾乎沒有報(bào)道。
[0004]免疫球蛋白M (IgM)是重要的免疫分子，參與了 B細(xì)胞的發(fā)育、體液免疫反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)各種過程。除了參與常規(guī)的免疫防御，IgM還有一個重要的功能，即阻止機(jī)體產(chǎn)生病理性的自身免疫反應(yīng)。動物實(shí)驗(yàn)表明缺乏分泌型IgM但是可以分泌其他類型抗體的小鼠將自發(fā)產(chǎn)生IgG抗DNA抗體，且腎臟出現(xiàn)IgG和補(bǔ)體沉積。用IgM自身抗體處理的狼瘡鼠產(chǎn)生蛋白尿的時間較晚，且腎臟受累較輕，生存期明顯延長。僅含高水平的自身反應(yīng)性IgMdM是缺乏自身反應(yīng)性的IgG的狼瘡鼠腎小球的病理狀況可得到明顯改善，小鼠生存期明顯延長。在人類，已知IgM抗dsDNA抗體水平與腎小球腎病呈負(fù)相關(guān)。具有高水平的IgM多反應(yīng)性抗體和IgM抗磷脂酰膽堿抗體的SLE患者癥狀往往較輕。IgM抗心磷脂抗體和抗dsDNA抗體在腎臟未損傷的患者中水平較高。由此可見，健康人表達(dá)的自身反應(yīng)性IgM不僅不傷害反而有益于機(jī)體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供含有6-N-甲基賴氨酸殘基的抗原的新用途。[0006]本發(fā)明所提供的新用途是含有6-N-甲基賴氨酸殘基的抗原在輔助診斷或篩查SLE試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0007]其中，所述的抗原可為含有6-N-甲基賴氨酸殘基的多肽或蛋白質(zhì)。當(dāng)所述抗原為含有6-N-甲基賴氨酸殘基的多肽時，該多肽可交聯(lián)到載體蛋白上。
[0008]上述應(yīng)用中，所述抗原為含有6-N-甲基賴氨酸殘基的多肽或蛋白質(zhì)或所述多肽與載體蛋白結(jié)合形成的交聯(lián)物。
[0009]上述應(yīng)用中，所述的含有6-N-甲基賴氨酸的多肽包括但是不限于表1中SEQ IDN0.1-4中任一所示的多肽。
[0010]在本發(fā)明的實(shí)施方式敘述中，含有6-N-甲基賴氨酸殘基的多肽為SEQ ID N0.1-4中任一所不的多肽。
[0011]上述應(yīng)用中，用于交聯(lián)的所述載體蛋白可為不與人IgM特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白(BSA)等。
[0012]上述應(yīng)用中，所述輔助診斷或篩查SLE試劑或試劑盒可為酶聯(lián)免疫試劑或酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0013]SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 [0014]其中，SEQ ID N0.1是由14個氨基酸殘基組成的多肽，名稱為GGKme，其第3位為6-N-甲基賴氨酸殘基。SEQ ID N0.2是由20個氨基酸殘基組成的多肽，名稱為^3^1(91^，其第9位為6-N-甲基賴氨酸殘基。SEQ ID N0.3是由20個氨基酸殘基組成多肽，名稱為!13^1(91^，其第9位為6-N-甲基賴氨酸殘基。和!13^1(91^的氨基酸組成一致但序列不同。SEQ ID N0.4是由20個氨基酸殘基組成多肽，名稱為其第4位為6-N-甲基賴氨酸殘基。
[0015]本發(fā)明還提供了輔助診斷或篩查SLE試劑或試劑盒。
[0016]本發(fā)明所提供的輔助診斷或篩查SLE試劑或試劑盒為含有6-N-甲基賴氨酸殘基的的多肽或蛋白質(zhì)以及所述多肽與載體蛋白結(jié)合形成的交聯(lián)物，包括SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽與載體蛋白結(jié)合形成的交聯(lián)物。
[0017]其中，所述載體蛋白為不與人IgM特異結(jié)合的BSA，交聯(lián)物用多肽-BSA表示。
[0018]在本發(fā)明工作中比較了健康人和SLE患者的IgM針對組蛋白H3氨基末端1_19位多肽的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)大部分健康人存在針對第4位和第9位的賴氨酸一甲基化多肽
HS^^me)的IgM自身抗體，進(jìn)一步研究顯示其表位實(shí)際上是6-N-甲基賴氨酸殘基。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明人IgM可以識別6-N-甲基賴氨酸,人IgM可以結(jié)合含6-N-甲基賴氨酸殘基的任意多肽。6-N-甲基賴氨酸對識別含6-N-甲基賴氨酸殘基表位的IgM具有抑制作用，但是非甲基化修飾的賴氨酸卻無抑制作用。此種與含6-N-甲基賴氨酸殘基結(jié)合的IgM不與二甲基化或三甲基化賴氨酸反應(yīng)。大多數(shù)健康人存在較高水平的此種IgM抗體，而在SLE患者中此種IgM抗體水平明顯降低。因此,含有6-N-甲基賴氨酸的抗原可用于制備輔助診斷或篩查SLE試劑或試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為ELISA方法檢測兒童和成人血清樣本中IgM針對HSw9Mme和的反應(yīng)。[0020]圖中，Η3η9Κ4ι?θ表示包被的是HS^^me-BSA, Η3η9Κ9ι?θ表示包被的是!KuKgme-BSA。pHC表示兒童健康對照血清(n=62), pSLE表示兒童SLE患者血清(n=62),aHC表示成人健康對照血清(n=75)，aSLE表示成人SLE患者血清(n=75)。各組中的橫線表示均值。健康對照與SLE患者間的P值以Student’ s t檢驗(yàn)計(jì)算。
[0021]圖2為ELISA檢測抗IgM抗體針對各種多肽的交叉反應(yīng)。
[0022]圖中，表示包被的是ro^-BSA，HSw9K^e表示包被的是HS^19Mme-BSA,H31_19K4me2 表示包被的是 HSuMn^-BSA，HSw9K^eS 表示包被的是 ro^MmeS-BSA，HS1^19Kgme 表示包被的是 HS^Kgme-BSA，H31_19K9me2 表示包被的是 HS^Kgn^-BSA，Η3η9Κ9ι?θ3 表示包被的是 H3H9K9me3-BSA，H3H9K9ac 表示包被的是 H3h9K9_BSA，sH3h9 表示包被的是sro^g-BSA，SHS1^19Kgme表示包被的是sHS^Kgme-BSA。
[0023]圖3為ELISA檢測用6_N_甲基賴氨酸或賴氨酸競爭IgM針對!^,1(911^和SHS1^19KQme 的反應(yīng)。
[0024]圖中，HS1^19Kgme表示包被的是HS^Kgrne-BSA，SHS1^19Kgme表示包被的是sro^Kgme-BSA。Kme表示的是用6-N-甲基賴氨酸抑制IgM抗體的反應(yīng)，K表示的是用未修飾的賴氨酸抑制IgM抗體的反應(yīng)。橫坐標(biāo)表示的是不同的賴氨酸或6-N-甲基賴氨酸的濃度。
[0025]圖4為ELISA檢測比較IgM針對叫_19、HS1^19Kgme和GGKme多肽的反應(yīng)。
[0026]圖中，表示包被的是ro^-BSA，HSw9Kgme表示包被的是HS^19Kgme-BSA,GGKme表示包被的是GGKme_BSA。橫坐標(biāo)表示的是珠純化的IgM不同的稀釋度。
[0027]圖5為ELISA檢測血清樣本中IgM針對!13^1(911^和GGKme的反應(yīng)。
[0028]圖5中A包被的是HSp19Kgme-BSA,圖5中B包被的是GGKme-BSA。aHC表示成人健康對照血清(n=25),aSLE表示成人SLE患者血清(n=25)。各組中的橫線表示均值。健康對照與SLE患者間的P值以Student’ s t檢驗(yàn)計(jì)算。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的所有數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism軟件(Version 5.01)分析。P值以Student’s t檢驗(yàn)計(jì)算，P〈0.05時被認(rèn)為數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。
[0030]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031]實(shí)施例1.用 HSH9Mme-BSA 和 HSH9Kgme-BSA 輔助診斷 SLE
[0032]1.多肽及其多肽-BSA交聯(lián)物的制備
[0033]該步驟制備了含有6-N-甲基賴氨酸殘基的多肽和。
與氨基酸序列相同但是賴氨酸甲基化修飾位置不同，HSh19Mme是第4位賴氨酸甲基化修飾，HS 1^19Kgme是第9位賴氨酸甲基化修飾。
[0034]上述多肽由北京中科亞光公司米用固相多肽合成法合成，純度3 90%。其序列如表I所示。每個多肽末端均包含一個半胱氨酸殘基，并通過這個半胱氨酸殘基與BSA交聯(lián)形成交聯(lián)物，即HSh19Mme-BSA和ro^Kgme-BSA。交聯(lián)方法如下:2mg BSA溶于反應(yīng)液(0.1MNaH2PO4, NaCl 0.15M, pH 7.2)，終濃度為 8.3mg BSA/ml。0.5mg Sulfo-SMCC (貨號 22322，美國Pierce公司)加入BSA溶液，室溫放置I小時。加到PDlO柱(貨號17-0851-01，美國GE公司)上，用含5mM EDTA的反應(yīng)液洗脫，接收BSA組分。將活化的BSA加到2mg多肽中，室溫放置3個小時。最后透析至PBS中，-80°C保存。
[0035]表1.多肽序列
[0036]
【權(quán)利要求】
1.含有6-N-甲基賴氨酸殘基的抗原在制備輔助診斷或篩查系統(tǒng)性紅斑狼瘡試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述抗原為含有6-N-甲基賴氨酸殘基的多肽或蛋白質(zhì)或所述多肽與載體蛋白的交聯(lián)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述含有6-N-甲基賴氨酸殘基的多肽為SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述載體蛋白為不與人IgM特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述輔助診斷或篩查系統(tǒng)性紅斑狼瘡試劑或試劑盒為酶聯(lián)免疫試劑或酶聯(lián)免疫試劑盒。
6.SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽。
7.輔助診斷或篩查系統(tǒng)性紅斑狼瘡試劑或試劑盒，其特征在于:所述試劑或試劑盒含有SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽或所述多肽與載體蛋白結(jié)合形成的交聯(lián)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑或試劑盒，其特征在于:所述載體蛋白為不與人IgM特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。
【文檔編號】G01N33/68GK104007266SQ201310061233
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月27日
【發(fā)明者】張偉, 郭莎, 劉瑩, 馬友楠, 趙青, 邵躍虎, 吳鳳岐, 高瑞通 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 北京愛博生生物技術(shù)有限公司, 首都兒科研究所