一種利用o-甲基轉(zhuǎn)移酶生物合成紫檀芹的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用O-甲基轉(zhuǎn)移酶生物合成紫檀芹的方法，屬于代謝工程【技術領域】。本發(fā)明是單獨表達O-甲基轉(zhuǎn)移酶或表達O-甲基轉(zhuǎn)移酶的同時融合表達4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶，構建了能夠以p-香豆酸或白藜蘆醇為底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了原料和氣候條件的制約，在可控條件下實現(xiàn)紫檀芹的生產(chǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)紫檀芹奠定基礎。
【專利說明】—種利用O-甲基轉(zhuǎn)移酶生物合成紫擅芹的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用O-甲基轉(zhuǎn)移酶生物合成紫檀芹的方法，屬于代謝工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]紫檀芹是一種在藍莓和葡萄中發(fā)現(xiàn)的與白藜蘆醇相關的二苯乙烯類化合物，屬于植物用于抗傳染病的植物抗毒素。動物實驗表明，紫檀芹有抗癌、抗高膽固醇血癥、抗高甘油三酯血癥的特性，還能夠抵御認知能力下降。除此之外，盡管鮮有研究，但紫檀芹還是被認為具有抗糖尿病的作用。
[0003]Schmidlin等的研究表明白藜蘆醇O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)可以催化白藜蘆醇直接轉(zhuǎn)化為紫檀芹(Schmidlin等，2008 Accession No:FM178870)。如圖1所示，紫檀芹可以由4-香豆酸-輔酶A-連接酶(4CL)、芹合酶(STS)以及O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)催化生成。
[0004]本發(fā)明的目的是在細胞系統(tǒng)中同時表達R0MT、4CL及STS，以實現(xiàn)白藜蘆醇向紫檀芹的轉(zhuǎn)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供能利用O-甲基轉(zhuǎn)移酶合成紫檀芹的基因工程菌，是單獨表達O-甲基轉(zhuǎn)移酶或表達O-甲基轉(zhuǎn)移酶并融合表達4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的基因工程菌。
[0006]所述基因工程菌可以是以下4種:
[0007](I)表達了源自擬南芥(Arabi`dopsis thaliana)的4_香豆酸-輔酶A連接酶(4CL)、源自葡萄(Vitis vinife)的芹合酶(STS)的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄(Vitis vinife)的O-甲基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌基因工程菌。所述大腸桿菌基因工程菌是以E.coli BL21 (DE3)為宿主，攜帶重組質(zhì)粒pETDuet_4CLSTS和Sumo-ROMT。所述pETDuet-4CLSTS是攜帶編碼4CL:: STS的融合基因的pETDuet-Ι重組載體，所述Sumo-ROMT是攜帶編碼ROMT基因的pETite N-His SUMO Kan重組載體。
[0008](2)表達了源自葡萄(Vitis vinife)的O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)的大腸桿菌基因工程菌。所述大腸桿菌基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)為宿主，攜帶重組質(zhì)粒Sumo-ROMT ;所述Sumo-ROMT是攜帶編碼ROMT基因的pETite N-His SUMO Kan重組載體。
[0009](3)表達了源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的4_香豆酸-輔酶A連接酶(4CL)、源自葡萄(Vitis vinife)的芹合酶(STS)的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄(Vitis vinife)的O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酵母基因工程菌。酵母基因工程菌是以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll 為宿主，攜帶重組質(zhì)粒 pAG304GPD_4CLSTS 和PAG305GPD-R0MT。所述pAG304GPD_4CLSTS是攜帶編碼融合基因的pAG304GPD_ccdB重組載體；所述PAG305GPD-R0MT是攜帶編碼ROMT的基因的pAG305GPD_ccdB重組載體。
[0010](4)表達了源自葡萄(Vitis vinife)的0_甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)的酵母基因工程菌。所述酵母基因工程菌是以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll為宿主，攜帶pAG305GPD-R0MT重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pAG305GPD_R0MT是攜帶編碼ROMT的基因的pAG305GPD-ccdB 重組載體。
[0011]所述4-香豆酸-輔酶A連接酶是由來自擬南芥(Arabidopsis thaliana,生態(tài)型哥倫比亞-O)的4CL基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。上述兩個基因融合獲得編碼4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的融合蛋白4CL:: STS的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012]所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll的構建方法參照文獻 Urban P,Mignotte C，Kazmaier M, Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeastexpression,and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73A5.J BiolChem272(31):19176-19186。 [0013]本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供利用所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，包括以下4種具體方法:
[0014](I)以改良M9培養(yǎng)基在200rpm、37°C條件下培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒pETDuet_4CLSTS和 Sumo-ROMT 的 E.coliBL21 (DE3)至 OD6tltl=0.6，添加終濃度 ImM 的 IPTG 誘導培養(yǎng) 2h，添加P-香豆酸乙醇溶液至終濃度為0.5g/L，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)以合成紫檀芹。所述P-香豆酸乙醇溶液是以純乙醇為溶劑，P-香豆酸濃度為0.5g/mL。
[0015](2 )以改良M9培養(yǎng)基在200rpm、37 °C條件下培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒Sumo-ROMT的E.coliBL21 (DE3)至OD600=0.6，添加終濃度ImM的IPTG誘導培養(yǎng)2h，將白藜蘆醇DMSO溶液添加到培養(yǎng)物中至白藜蘆醇終濃度為0.228g/L，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)以合成紫檀芹。所述白藜蘆醇DMSO溶液是以DMSO為溶劑，白藜蘆醇的濃度為0.228g/mL。
[0016](3)以SD drop-out培養(yǎng)基在30 °C條件下培養(yǎng)攜帶pAG304GPD_4CLSTS和PAG305GPD-R0MT的S.cerevisiae WATll細胞至0D_=0.2，然后添加p-香豆酸乙醇溶液至終濃度為0.5g/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4天以合成紫檀芹。所述P-香豆酸乙醇溶液是以純乙醇為溶劑，P-香豆酸濃度為0.5g/mL。
[0017](4)以SD drop-out培養(yǎng)基在30 °C條件下培養(yǎng)攜帶pAG305GPD_R0MT的
S.cerevisiae WATll細胞至0D_=0.2，將白藜蘆醇DMSO溶液添加到培養(yǎng)物中至白藜蘆醇終濃度為0.228g/L，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。所述白藜蘆醇DMSO溶液是以DMSO為溶劑，白藜蘆醇的濃度為0.228g/mL。
[0018]所述改良M9培養(yǎng)基是在標準M9培養(yǎng)基的基礎上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%(v/v)甘油得到的。
[0019]本發(fā)明還提供了能夠以P-香豆酸為底物生物合成白藜蘆醇的基因工程菌，包括(I)融合表達4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶(SEQ ID N0.3)的E.coliBL21 (DE3)，(2)融合表達4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶(SEQ ID N0.3)的S.cerevisiae WATll細胞。
[0020]4-香豆酸-輔酶A連接酶是由來自擬南芥(Arabidopsis thaliana,生態(tài)型哥倫比亞-O)的4CL基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。將上述兩個基因融合獲得編碼4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。4-香豆酸-輔酶A連接酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.5所示，芹合酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)的氨基酸序列如SEQID N0.8 所示。
[0021]目前，紫檀芹的獲得方法主要是依賴從少數(shù)幾種植物中提取，還沒有微生物合成紫檀芹的方法。本發(fā)明構建了能夠以P-香豆酸或白藜蘆醇為底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了原料和氣候條件的制約，在可控條件下實現(xiàn)紫檀芹的生產(chǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)紫檀芹
奠定基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1紫檀芹的生物合成途徑。
[0023]圖2p-香豆酸、白藜蘆醇和紫檀芹三種物質(zhì)的標樣的HPLC圖譜。
[0024]圖3融合表達了 4CL和STS的E.coil細胞提取物的HPLC圖譜。
[0025]圖4表達了 ROMT的E.co i I細胞提取物的HPLC圖譜。
[0026]圖5共表達了 4CL、STS和ROMT的E.coil細胞提取物的HPLC圖譜。
[0027]圖6融合表達了 4CL和STS的酵母細胞提取物的HPLC圖譜。
[0028]圖7表達了 ROMT的酵母細胞提取物的HPLC圖譜。
[0029]圖8共表達了 4CL、STS和ROMT的酵母細胞提取物的HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0030]4-香豆酸-輔酶A連接酶是由來自擬南芥(Arabidopsis thaliana,生態(tài)型哥倫比亞-O)的4CL基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。將上述兩個基因融合獲得編碼4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。4-香豆酸-輔酶A連接酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.5所示，芹合酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)的氨基酸序列如SEQID N0.8 所示。
[0031]一種制備紫檀芹的方式是在細胞系統(tǒng)中表達白藜蘆醇O-甲基轉(zhuǎn)移酶，以含有白藜蘆醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞系統(tǒng)產(chǎn)紫檀芹。
[0032]一種制備白藜蘆醇的方式是在細胞系統(tǒng)中表達4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶，以含P-香豆酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞系統(tǒng)產(chǎn)白藜蘆醇。
[0033]另一種制備紫檀 芹的方式是在第一細胞系統(tǒng)中表達4-香豆酸-輔酶A-連接酶(4CL)、芹合酶(STS)，以含P-香豆酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)該第一細胞系統(tǒng)產(chǎn)白藜蘆醇。在第二細胞系統(tǒng)中表達O-甲基轉(zhuǎn)移酶(R0MT)，以含有白藜蘆醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)該第二細胞系統(tǒng)產(chǎn)紫檀芹。
[0034]菌種、質(zhì)粒
[0035]H1-ControllOG和DH5a用于質(zhì)粒擴增，BL21 (DE3)用于在大腸桿菌中重組表達蛋白，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll用于在酵母中表達蛋白。P-香豆酸、白藜蘆醇和紫檀芳:標樣均從Sigma購買獲得。pETite N-His SUMO Kan載體從Lucigen (Middleton, WI)購買。pETDuet-Ι從Novagen購買獲得，并用于重組蛋白表達。pAG304GPD-ccdB、pAG305GPD_ccdB 從 Addgene (Boston, MA)獲得。
[0036]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll的構建方法參照文獻Urban P,Mignotte C，Kazmaier Μ,Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeastexpression,and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73A5.J BiolChem272(31):19176-19186。
[0037]改良M9培養(yǎng)基是在標準M9培養(yǎng)基的基礎上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%(v/V)甘油得到的。
[0038]DNA 操作
[0039]所有DNA操作均參照標準程序。限制性酶和T4DNA連接酶均從New EnglandBiolabs購買。所有PCR擴增和克隆反應均采用Phusion高保真DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)。
[0040]RNA提取和cDN A合成
[0041]ROMT (O-甲基轉(zhuǎn)移酶)、4CL (4-香豆酸-輔酶A-連接酶)、STS (芹合酶)克隆于不同的植物。用于克隆ROMT和STS的葡萄RNA，以及用于克隆4CL的擬南芥RNA均采用TrizolPlus RNA 純化試劑盒(Invitrogen)。cDNA 的合成是利用 Promega Inc.的 Im Prom-1I ?反向轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，按照其使用說明完成的?；驍U增是利用表1所示引物借助New EnglandBiolabs PhusionPCR試劑盒完成的。
[0042]產(chǎn)物的提取
[0043]發(fā)酵培養(yǎng)液(400 μ L)用800 μ L乙酸乙酯進行萃取，然后將提取物用EppendorfVacufuge (Eppendorf Scientific Westbury, NY)在室溫下進行蒸發(fā)干燥,然后再復溶于200 μ L80% (v/v )的甲醇中。
[0044]HPLC 分析
[0045]利用Dionex Ultimate3000系統(tǒng)對所提取的產(chǎn)物中的白藜蘆醇和紫檀芹進行分析。中間產(chǎn)物通過反相色譜Kinetex C18 (粒徑為2.6 μ m ;150X4.6mm)進行分離,洗脫液為0.1% (v/v)的蟻酸(溶液A)和100%的乙腈(溶液B)。樣品用80%的甲醇進行稀釋，梯度洗脫程序如下:10%的溶液B洗脫2min，10%-70%的溶液B線性洗脫18min，70%-30%的溶液B線性洗脫lmin，30%-10%的溶液B線性洗脫2min，10%的溶液B洗脫以流速0.8ml/min洗脫5min。為了定量分析，所有中間體都通過外標法測定?；衔锿ㄟ^HPLC系統(tǒng)的二極管陣列檢測器檢測的滯留時間和相應的光譜進行定性。3個標準樣品(P-香豆酸、白藜蘆醇和紫檀芹)經(jīng)HPLC分析得到了 3個分離效果良好的峰(圖2)。
[0046]實施例1在E.coliBL21 (DE3)中融合表達4CL、STS產(chǎn)白藜蘆醇
[0047]為融合表達4CL及STS，兩個基因通過PCR擴增策略融合在一起。4CL的終止子被敲除，并在4CL和STS的開放閱讀框之間插入一個由3個氨基酸組成的連接肽(Gly-Ser-Gly),以此獲得了一個大小為2.87kb的編碼4CL、3肽連接子和STS的融合基因，融合基因4CL: =STS的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。4CL: =STS融合基因通過pCR8/Gff/TOPO TA克隆試劑盒連接到入門載體(Gateway entry vector)然后轉(zhuǎn)化進入One Shot大腸桿菌感受態(tài)細胞，并測序驗證。4CL::STS融合基因通過擴增、BamH I和Hind III雙酶切連接到pETDuet-Ι載體上，得到重組質(zhì)粒pETDuet-4CLSTS，轉(zhuǎn)化進入E.coliBL21 (DE3)。
[0048]挑選E.coli BL21單菌落到3mL含100 μ L/mL氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50mL含有100 μ L/mL氨芐霉素的改良M9培養(yǎng)基中在200rpm、37°C條件下培養(yǎng)至OD6tltl=0.6，添加ImM的IPTG誘導培養(yǎng)2h，添加p-香豆酸乙醇溶液(純乙醇為溶劑)至終濃度為0.5g/L，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，間歇取樣用HPLC進行分析。
[0049]我們檢測了以改良M9培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)攜帶pETDuet_4CLSTS質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3 )時白藜蘆醇的產(chǎn)量，如圖3所示，P-香豆酸可被成功轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。
[0050]實施例2 在 E.coliBL21 (DE3)中表達 ROMT
[0051]編碼O-甲基轉(zhuǎn)移酶(ROMT)的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，將ROMT的基因擴增產(chǎn)物按照pETite N-His SUMO Kan載體的使用說明連接到pETite N-His SUMOKan載體上。通過測序驗證正確插入基因的重組質(zhì)粒命名為Sumo-ROMT,并將該該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)中進行異源表達。
[0052]將攜帶Sumo-ROMT質(zhì)粒的E.coliBL21 (DE3)以改良M9培養(yǎng)基在37°C條件下培養(yǎng)至0D_=0.6，添加ImM的IPTG誘導培養(yǎng)2h，將白藜蘆醇溶解于DMSO添加到培養(yǎng)物中至終濃度為0.228g/L，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，間歇取樣用HPLC分析。
`[0053]如圖4所示，搖瓶培養(yǎng)時，將白藜蘆醇添加到表達ROMT的E.coli培養(yǎng)物中，白藜蘆醇可轉(zhuǎn)化為紫檀芹，轉(zhuǎn)化率為30%。HPLC分析結果也證明了這一點，然而，出現(xiàn)了一個未知的峰，可能是原白藜蘆醇上的甲基。
[0054]實施例3在E.coliBL21 (DE3)中融合表達4CL: =STS并同時表達ROMT
[0055]攜帶pETDuet-4CLSTS 和 Sumo-ROMT 質(zhì)粒的 E.coliBL21 (DE3)以改良 M9 培養(yǎng)基在200rpm、37°C條件下培養(yǎng)至OD6tltl=0.6，添加ImM的IPTG誘導培養(yǎng)2h，添加p-香豆酸乙醇溶液(純乙醇為溶劑)至終濃度為0.5g/L，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，間歇取樣用HPLC進行分析。
[0056]向共表達了 4CL: =STS融合蛋白和ROMT的E.coli培養(yǎng)物中添加p_香豆酸，如圖5的HPLC圖譜所示，24h時P-香豆酸成功轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇和紫檀芹，P-香豆酸到紫檀芹的轉(zhuǎn)化率為20%。樣品在96h內(nèi)進行HPLC檢測。
[0057]實施例4在酵母中融合表達4CL: =STS
[0058]將核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的4CL: =STS融合基因連接到載體pAG304GPD-ccdB (Addgene, Boston, MA)上，得到重組質(zhì)粒 pAG304GPD_4CLSTS，并將該重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入S.cerevisiae WAT11。酵母轉(zhuǎn)化借助Frozen-EZ酵母轉(zhuǎn)化II試劑盒(ZymmoResearch, Orange, CA)進行。陰性對照質(zhì)粒為 pAG304GPD_ccdB。
[0059]攜帶pAG304GPD-4CLSTS 的 S.cerevisiae WATll 細胞以 SD drop-out 培養(yǎng)基在30°C條件下培養(yǎng)至OD6tltl=0.2，然后添加P-香豆酸(0.5g/L)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4天，間歇取樣用HPLC進行分析。
[0060]將攜帶pAG304GPD_4CLSTS的新鮮酵母菌落以3ml含0.5g/Lp-香豆酸的drop-out培養(yǎng)基在30°C條件下培養(yǎng)4天。細胞提取物經(jīng)HPLC分析，如圖6所示，幾乎所有的p-香豆酸在4天內(nèi)都被轉(zhuǎn)化為了白藜蘆醇。與E.coli相比，酵母的轉(zhuǎn)化效率更高。
[0061]實施例5在酵母中表達ROMT
[0062]將核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的ROMT基因通過LR Clonase II酶混合試劑盒替換連接到pAG305GPD-ccdB (Addgene),得到重組質(zhì)粒pAG305GPD_R0MT，轉(zhuǎn)入S.cerevisiae WATll細胞用于發(fā)酵。
[0063]將攜帶pAG305GPD-R0MT 的 S.cerevisiae WATll 細胞以 SD drop-out 培養(yǎng)基在30°C條件下培養(yǎng)至0D_=0.2，然后添加白藜蘆醇(0.228g/L)，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，間歇取樣用HPLC進行分析。
[0064]如圖7所示，搖瓶培養(yǎng)時，將白藜蘆醇添加到表達ROMT的S.cerevisiae WATll細胞培養(yǎng)物中，白藜蘆醇可轉(zhuǎn)化為紫檀芹，轉(zhuǎn)化率30%。HPLC分析結果也證明了這一點，然而，出現(xiàn)了一個未知的峰，可能是原白藜蘆醇上的甲基。
[0065]實施例6在酵母中融合表達4CL::STS并同時表達ROMT
[0066]將核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的4CL: =STS融合基因連接到載體pAG304GPD-ccdB。將核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的ROMT基因通過LR Clonase II酶混合試劑盒替換連接到pAG305GPD-ccdB (Addgene)0上述兩步得到的重組質(zhì)粒分別命名為PAG304GPD-4CLSTS和pAG304GPD-R0MT。這些質(zhì)粒含有組成型啟動子GPD。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入S.cerevisiae WATll 細胞用于發(fā)酵。陰性對照質(zhì)粒為 pAG304GPD_ccdB和 pAG305GPD_ccdB。
[0067]將攜帶pAG304GPD-4CLSTS 和 pAG305GPD_R0MT 的 S.cerevisiae WATll 以 SDdrop-out培養(yǎng)基在30 °C條件下培養(yǎng)至OD6tltl=0.2,然后添加p-香豆酸(0.5g/L),相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，間歇取樣用HPLC進行分析。
[0068]向共表達了 4CL: =STS融合蛋白和ROMT的S.cerevisiae WATll的培養(yǎng)物中添加P-香豆酸，如圖8的HPLC圖譜所示，24h時P-香豆酸成功轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇和紫檀芹，P-香豆酸到紫檀芹的轉(zhuǎn)化率為30%。樣品在96h內(nèi)進行HPLC檢測。
[0069]表1引物序列
[0070]
【權利要求】
1.一種利用O-甲基轉(zhuǎn)移酶合成紫檀芹的基因工程菌，是單獨表達O-甲基轉(zhuǎn)移酶或表達O-甲基轉(zhuǎn)移酶的同時表達4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的融合蛋白的基因工程菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述4-香豆酸-輔酶A連接酶是由來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的4CL基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示；所述芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；將上述兩個基因融合獲得了編碼4-香豆酸-輔酶A連接酶和芹合酶的融合蛋白4CL:: STS的基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；所述O-甲基轉(zhuǎn)移酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因編碼的，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是表達了SEQ ID N0.3所示融合基因以及 SEQ ID N0.4 所示 ROMT 基因的 E.coli BL21 (DE3)。
4.根據(jù)權利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，是以E.coli BL2KDE3)為宿主，攜帶重組質(zhì)粒 pETDuet-4CLSTS 和 Sumo-ROMT ;所述 pETDuet_4CLSTS 是攜帶 SEQ ID N0.3 所示融合基因的pETDuet-Ι重組載體；所述Sumo-ROMT是攜帶SEQ ID N0.4所示基因的pETiteN-His SUMO Kan 重組載體。
5.根據(jù)權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是表達了SEQ ID N0.3所示融合基因以及 SEQ ID N0.4 所不基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WAT11。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，是以S.cerevisiae WATll為宿主，攜帶重組質(zhì)粒 pAG304GPD-4CLSTS 和 pAG305GPD_R0MT ;所述 pAG304GPD_4CLSTS 是攜帶 SEQID N0.3所示融合基因的pAG304GPD-ccdB重組載體；所述pAG305GPD_R0MT是攜帶SEQ IDN0.4所示基因的pAG305GPD-ccdB重組載體。
7.根據(jù)權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表達了SEQ IDN0.4 所示基因的 E.coli BL21 (DE3)。`
8.根據(jù)權利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，是以E.coli BL21 (DE3)為宿主，攜帶重組質(zhì)粒Sumo-ROMT ;所述Sumo-ROMT是攜帶SEQ ID N0.4所示基因的pETite N-HisSUMO Kan重組載體。
9.根據(jù)權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表達了SEQ IDN0.4 所不基因的 S.cerevisiae WATlI。
10.根據(jù)權利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，是以S.cerevisiae WATll為宿主，攜帶重組質(zhì)粒PAG305GPD-R0MT ;所述pAG305GPD_R0MT是攜帶SEQ ID N0.4所示基因的pAG305GPD-ccdB 重組載體。
11.一種利用權利要求3-6任一所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，是以P-香豆酸為底物生物合成紫檀芹。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征在于，是以改良M9培養(yǎng)基在200rpm、37°C條件下培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒 pETDuet-4CLSTS 和 Sumo-ROMT 的 E.coliBL21 (DE3)至 0D_=0.6，添加ImM的IPTG誘導培養(yǎng)2h，添加p-香豆酸乙醇溶液至終濃度為0.5g/L，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)以合成紫檀芹。
13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征在于，以SDdrop-out培養(yǎng)基在30°C條件下培養(yǎng)攜帶 PAG304GPD-4CLSTS 和 pAG305GPD_R0MT 的 S.cerevisiae WATll 細胞至 0D_=0.2，然后添加0.5g/L P-香豆酸，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4天以合成紫檀芹。
14.一種利用權利要求7-10任一所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，是以白藜蘆醇為底物生物合成紫檀芹。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其特征在于，是以改良M9培養(yǎng)基在200rpm、37°C條件下培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒Sumo-ROMT的E.coliBL21 (DE3)至OD6tltl=0.6，添加ImM的IPTG誘導培養(yǎng)2h，將白藜蘆醇溶解于DMSO添加到培養(yǎng)物種至終濃度為0.228g/L，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)以合成紫檀芹。
16.根據(jù)權利要求14所述的方法，其特征在于，是以SDdrop-out培養(yǎng)基在30°C條件下培養(yǎng)攜帶 PAG305GPD-R0MT 的 S.cerevisiae WATll 細胞至 OD6tltl=0.2，然后添加 0.228g/L白藜蘆醇，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，間歇取樣用HPLC進行分析。
17.根據(jù)權利要求12或15所述的方法，其特征在于，所述改良M9培養(yǎng)基是在標準M9培養(yǎng)基的基礎上添加1.25g/L酵母提取物和0.5% (v/v)甘油得到的。
18.權利要求1所述基`因工程菌在紫檀芹生產(chǎn)中的應用。
【文檔編號】C12R1/865GK103773704SQ201310723683
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權日:2013年12月25日
【發(fā)明者】汪業(yè)春, 穆罕默德·瓦杜·慧婭, 余曉丹 申請人:無錫新和源發(fā)酵技術研究院有限公司