本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記及其開發(fā)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
indel(insertion/deletion)又稱為插入缺失，通常是指相比于一個(gè)基因組，另一個(gè)基因組序列存在一定數(shù)量核苷酸的插入或缺失。根據(jù)基因組插入缺失位點(diǎn)設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增這些位點(diǎn)的引物就是indel分子標(biāo)記。該標(biāo)記能夠顯示擴(kuò)增序列的長(zhǎng)度差異，具有穩(wěn)定性高、共顯性等特點(diǎn)，可以用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、群體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)以及核心種質(zhì)篩選等。由于基因組中存在較豐富的indel變異，且indel變異可以在基因內(nèi)或基因調(diào)控區(qū)域發(fā)生，因此，indel變異具有發(fā)展成為功能性分子標(biāo)記的潛力。
藜麥(chenopodiumquinoawilld.)，是原產(chǎn)于南美安第斯地區(qū)一年生雙子葉草本植物，其在安第斯地區(qū)具有上千年的栽培歷史，具有出色的耐干旱、耐鹽堿的特性，是安第斯地區(qū)的主要食物來(lái)源。由于其種子營(yíng)養(yǎng)均衡，已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)定為單體即可滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的唯一植物。藜麥?zhǔn)袌?chǎng)需求逐年擴(kuò)大，種植地已經(jīng)擴(kuò)展到歐美、日本、中國(guó)等地。藜麥?zhǔn)钱愒此谋扼w物種(2n＝4x＝36)，含有兩個(gè)基因組亞組，其基因組大小約為1,448mb。由于關(guān)于藜麥的分子生物學(xué)研究并不深入，已報(bào)道的藜麥分子標(biāo)記并不豐富。常用的分子標(biāo)記為mason等(2005)和jarvis等(2008)鑒定的ssr(simplesequencerepeat)標(biāo)記，但總量只有數(shù)百個(gè)。特別是某些ssr分子標(biāo)記可檢測(cè)的等位基因多達(dá)數(shù)十個(gè)，在基因分型過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生混淆，造成基因分型的準(zhǔn)確性降低，不方便利用。因此，發(fā)展二態(tài)性indel分子標(biāo)記可大大提高四倍體藜麥基因分型的準(zhǔn)確性和可操作性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要提供了一種藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記及其開發(fā)方法與應(yīng)用，可以針對(duì)現(xiàn)有藜麥分子標(biāo)記在基因分型中的不足，利用這些分子標(biāo)記可極大的提高藜麥基因分型的準(zhǔn)確性。其技術(shù)方案如下：
一種藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記，包括如下38個(gè)位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的正向、反向
引物：
優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記對(duì)藜麥基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，在純合位點(diǎn)可以擴(kuò)增出一條等位基因，在雜合位點(diǎn)可以擴(kuò)增出兩條等位基因。
一種藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記的開發(fā)方法，該方法包括以下步驟：
(1)獲取藜麥基因組序列信息；
(2)利用mindel軟件對(duì)藜麥基因組序列進(jìn)行預(yù)處理、組裝、indel分析、引物設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)；
(3)篩選較好的二態(tài)性indel分子標(biāo)記pcr擴(kuò)增藜麥基因組dna進(jìn)行驗(yàn)證。
所述藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記在異源四倍體藜麥基因分型中的應(yīng)用，具體步驟如下：
(1)采用所述indel分子標(biāo)記的引物對(duì)藜麥基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
(2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；
(3)讀取凝膠電泳檢測(cè)的擴(kuò)增條帶確定基因型；
(4)基于基因型結(jié)果對(duì)藜麥種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)篩選的應(yīng)用。
采用上述分子標(biāo)記，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明提供的藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確地對(duì)異源四倍體藜麥進(jìn)行基因型分析，極大地降低了高多態(tài)性分子標(biāo)記在藜麥基因分型中的讀帶錯(cuò)誤率。該藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記是一種穩(wěn)定的遺傳變異，在藜麥基因組中數(shù)量豐富，可大規(guī)模開發(fā)。藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物可以用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用方便。
附圖說(shuō)明
圖1為藜麥群體的群體結(jié)構(gòu)圖；
圖2為藜麥群體的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊規(guī)定，均為常規(guī)方法，所涉及的實(shí)驗(yàn)試劑及材料如無(wú)特殊規(guī)定均為常規(guī)生化試劑和材料。
1、藜麥基因組序列的獲得
收集11份藜麥種質(zhì)的幼苗期地上部分植株用于dna提取。按照illumina公司提供的操作指南構(gòu)建基因組測(cè)序文庫(kù)。利用貝瑞和康公司的illuminahiseq2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因組paired-end測(cè)序如表1所示。
表1藜麥基因組測(cè)序種質(zhì)及其測(cè)序信息
2、藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
將藜麥基因組測(cè)序數(shù)據(jù)(fastq格式)導(dǎo)入mindel軟件，經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后，高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)用于基因組序列的denovo組裝。riobamba的讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，測(cè)序深度較深，組裝的序列質(zhì)量高。以riobamba的基因組組裝序列為參考序列進(jìn)行indel分析。對(duì)在11份藜麥基因組中只出現(xiàn)兩種長(zhǎng)度的indel片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，篩選出90個(gè)預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段差異較大的引物進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，共得到85個(gè)二態(tài)性indel分子標(biāo)記，其中38個(gè)可用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)差異(表2)，其它47個(gè)可用12％的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)差異。
表238個(gè)二態(tài)性indel分子標(biāo)記引物序列及其pcr產(chǎn)物預(yù)測(cè)長(zhǎng)度
3、藜麥的基因型分析
利用包括85個(gè)二態(tài)性indel分子標(biāo)記和62個(gè)ssr分子標(biāo)記共計(jì)147個(gè)分子標(biāo)記對(duì)收集到的129份藜麥種質(zhì)進(jìn)行基因型分析。利用karrotendna提取試劑盒提起試驗(yàn)材料的幼苗用于pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)總體系為25μl，含有2mmol/lmgcl2，100μmol/ldntp，0.2μmol/l引物，1utaq酶及50μngdna。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30s,58℃35s,72℃45s,38個(gè)循環(huán)；72℃3min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在3％瓊脂糖凝膠上以100v電壓電泳90min或12％聚丙烯酰胺凝膠上以120v電壓電泳120min,eb染色后在紫外透射儀上觀察結(jié)果。
4、藜麥的群體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)篩選
藜麥的基因型數(shù)據(jù)用于藜麥群體的相關(guān)分析。利用structure2.3.4軟件的admixture模型對(duì)129份藜麥種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過(guò)△k法可以將藜麥種質(zhì)分成兩個(gè)大群，并發(fā)現(xiàn)部分個(gè)體呈現(xiàn)混合血緣，如附圖1所示。
利用powermarker3.25軟件包將藜麥的基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成個(gè)體間的遺傳距離(nei，1983)，通過(guò)mega7.0.14軟件的nj法構(gòu)建藜麥種質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，如附圖2所示。該系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示的大群結(jié)果與structure分析的結(jié)果相似，可將藜麥群體分成g1和g2兩個(gè)群體，分別代表安第斯高原型和智利沿海型型。系統(tǒng)進(jìn)化樹還進(jìn)一步將g1分成兩個(gè)亞群，分別是g1s1(北部高原型)和g1s2(南部高原型)。
根據(jù)藜麥群體的分群結(jié)果，利用powermarker3.25軟件包對(duì)群體內(nèi)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)g1、g2、g1s1和g1s2的遺傳多樣性分別為0.33、0.38、0.27和0.32。結(jié)果表明與安第斯高原型藜麥群體相比，智利沿海型藜麥群體具有較高的多樣性。在安第斯高原型藜麥群體中，南部高原亞群比北部高原亞群具有更高的多態(tài)性。因此，可以推測(cè)藜麥可能是起源于智利沿海，并向北部高原擴(kuò)散。
藜麥群體的核心種質(zhì)是通過(guò)powermarker3.25軟件包的simulatedannealing算法篩選的。該方法能夠基于基因型數(shù)據(jù)篩選出代表最大遺傳多樣性的最小樣本數(shù)。參數(shù)設(shè)置如下：r＝3000，ρ＝0.95及t0＝1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)藜麥核心種質(zhì)即可代表88％的等位基因，16個(gè)藜麥核心種質(zhì)即可代表100％的等位基因，篩選結(jié)果如表3所示。
表3藜麥核心種質(zhì)篩選
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120>藜麥二態(tài)性indel分子標(biāo)記及其開發(fā)方法與利用
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