本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和基因工程技術(shù)，具體涉及一種苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬖缙诎l(fā)現(xiàn)苯乙烯中毒易感者，并據(jù)此進(jìn)行預(yù)防方面的方向指導(dǎo)。

背景技術(shù)：

苯乙烯是一種重要的化工原料及產(chǎn)品，在職業(yè)環(huán)境及生活環(huán)境中廣泛存在，長(zhǎng)期接觸苯乙烯可以導(dǎo)致苯乙烯中毒，中毒癥狀包括；神經(jīng)衰弱、粘膜刺激、造血系統(tǒng)損害。苯乙烯中毒可嚴(yán)重降低接觸人群的生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)苯乙烯生產(chǎn)及下游行業(yè)中，接觸工人已超過50萬。由于苯乙烯為各種艇類、高速列車、地鐵車廂生產(chǎn)中主要的交聯(lián)劑及稀釋劑，隨著我國(guó)有關(guān)行業(yè)的高速發(fā)展，苯乙烯職業(yè)接觸工人數(shù)量在近幾年處于持續(xù)增長(zhǎng)中。因此，對(duì)苯乙烯引起的職業(yè)性危害的防治應(yīng)引起重視。細(xì)胞色素p4502e1（cyp2e1）基因編碼的氧化酶是環(huán)境毒物活化的關(guān)鍵酶之一，是體內(nèi)重要的i相代謝酶，在苯乙烯代謝過程中，主要催化苯乙烯生成毒性更強(qiáng)的中間代謝產(chǎn)物環(huán)氧苯乙烯，后者繼續(xù)代謝，最后主要生成代謝終產(chǎn)物苯乙醇酸和苯乙醛酸，隨尿排出。因此，在接觸苯乙烯濃度相同或相似條件下，cyp2e1酶活性越強(qiáng)，生成的環(huán)氧苯乙烯量越多，代謝終產(chǎn)物含量也相應(yīng)增多?，F(xiàn)有檢測(cè)遺傳易感性的方法多為采集靜脈血淋巴細(xì)胞中dna進(jìn)行基因易感性檢測(cè)，具有有創(chuàng)傷、可能造成交叉感染等缺點(diǎn)?，F(xiàn)在尚未見苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒的研制。

綜上所述，開展苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒的研制，在前期的研究基礎(chǔ)上，通過口腔黏膜細(xì)胞采樣，檢測(cè)與苯乙烯中毒發(fā)生密切相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性，從基因水平來評(píng)估苯乙烯中毒發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性，從而早期發(fā)現(xiàn)苯乙烯中毒易感者，保護(hù)易感人群。并可以減少采樣痛苦、避免交叉感染。對(duì)于降低苯乙烯中毒發(fā)病率，提高勞動(dòng)者職業(yè)健康水平具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于cyp2e1基因上5^，端上游調(diào)節(jié)區(qū)rsai（rs2031920）、ephx1基因上t/c（rs1051740）及a/g（rs2234922）的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可用來評(píng)估苯乙烯中毒的遺傳易感性，本發(fā)明提供一種苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明旨在提供苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，所述苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒包括：檢測(cè)cyp2e1基因上5^，端上游調(diào)節(jié)區(qū)rsairs2031920、ephx1基因上t/crs1051740及a/grs2234922的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)、2×pcrmix、pcr反應(yīng)緩沖液、fastdigest-rsai核酸內(nèi)切酶、fastdigest-ecorv核酸內(nèi)切酶、ddh2o。

進(jìn)一步，所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)cyp2e1基因上5^，端上游調(diào)節(jié)區(qū)rsairs2031920、ephx1基因上t/crs1051740及a/grs2234922的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，通過pcr反應(yīng)特異性擴(kuò)增出包含這3個(gè)snps位點(diǎn)dna片段的引物對(duì)。

進(jìn)一步，所述的pcr產(chǎn)物酶切組件是針對(duì)cyp2e1基因上5^，端上游調(diào)節(jié)區(qū)rsairs2031920、ephx1基因上t/crs1051740及a/grs2234922的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而配置，通過pcr-rflp技術(shù)特異性地檢測(cè)出上述3個(gè)snps位點(diǎn)的基因型。

進(jìn)一步所含的3對(duì)特異性引物序列如下：

cyp2e序列seqidno：1

正向引物序列：5′-ttcattgtgtcttctaactgg-3′

反向引物序列：5′-ccagtcgagtcttacattgtca-3′

ephx1序列seqidno：2

正向引物序列：5′-gatcgataagttccgtttcacc-3′

反向引物序列：5′-aatcttagtcttgaagtgagggt-3′

ephx1序列seqidno：3

正向引物序列：5′-acatccacttcatccacg-3′

反向引物序列：5′-atgcctctgagaagccat-3′

進(jìn)一步，試劑盒的組分和含量包括：

pcr反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為總體積25μl，內(nèi)含正、反向引物濃度20μm各0.25μl、2×pcrmix12.5μl，dna模板1μl，ddh2o15μl；

pcr產(chǎn)物酶切體系：反應(yīng)體系為總體積30μl，其中pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為15μl、fastdigest-rsai核酸內(nèi)切酶、fastdigest-ecorv核酸內(nèi)切酶各1.5μl，10×buffer3μl，ddh2o9μl。

進(jìn)一步，所述試劑盒的保存溫度為-20℃。

本發(fā)明通過檢測(cè)這些相關(guān)基因單核苷酸位點(diǎn)基因型從基因?qū)用鎭砗Y查易患苯乙烯中毒的高危人群，從而有針對(duì)性地預(yù)防，保護(hù)易感人群，對(duì)于保護(hù)勞動(dòng)者健康具有重要和積極的意義。本發(fā)明采樣方法為口腔黏膜細(xì)胞采樣，無創(chuàng)無痛，并可避免交叉感染?；蛐蜋z測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法簡(jiǎn)便易推廣。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的適用范圍。

除非另行說明，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的意義形同。此外，任何與所記載內(nèi)容相同或相似的方法及材料皆適用于本發(fā)明。文中所述的實(shí)施方法與材料僅作示范用。

實(shí)施例1：檢測(cè)試劑盒的使用。

1、抽提dna模板

用棉試子用力刮取受檢者口腔內(nèi)皮膚黏膜，采集上皮細(xì)胞后，用酚氯仿法提取基因組dna。

2、pcr擴(kuò)增反應(yīng)

使用本試劑盒中的pcr反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì)：

（1）cyp2e(rsai)seqidno：1

正向引物序列：5′-ttcattgtgtcttctaactgg-3′

反向引物序列：5′-ccagtcgagtcttacattgtca-3′

（2）ephx1(t/c)seqidno：2

正向引物序列：5′-gatcgataagttccgtttcacc-3′

反向引物序列：5′-aatcttagtcttgaagtgagggt-3′

（3）ephx1(a/g)seqidno：3

正向引物序列：5′-acatccacttcatccacg-3′

反向引物序列：5′-atgcctctgagaagccat-3′

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為總體積25μl，內(nèi)含正、反向引物（濃度20μm）各0.25μl、2×pcrmix12.5μl，dna模板1μl，ddh2o10μl。

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

3、pcr擴(kuò)增產(chǎn)物酶切

使用本試劑盒中的pcr產(chǎn)物酶切組件，反應(yīng)體系為總體積30μl，其中pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為15μl、fastdigest-rsai核酸內(nèi)切酶、fastdigest-ecorv核酸內(nèi)切酶各1.5μl，10×buffer3μl，ddh2o9μl。短時(shí)離心后于37℃恒溫水浴箱內(nèi)消化30分鐘后，取10μl酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳50min。

4、基因型分析

酶切產(chǎn)物電泳后，放入紫外凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行成像，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過觀察電泳圖譜確定所檢測(cè)的snp位點(diǎn)的基因型。

實(shí)施例2：為苯乙烯職業(yè)接觸人群進(jìn)行預(yù)防苯乙烯中毒遺傳易感性檢測(cè)的服務(wù)。

1、抽提dna模板

由檢驗(yàn)科醫(yī)師用棉試子用力刮取受檢者口腔內(nèi)皮膚黏膜，采集上皮細(xì)胞后，用酚氯仿法提取基因組dna。

2、基因型檢測(cè)

使用本發(fā)明提供的試劑盒，采用實(shí)施例1中所述方法對(duì)受檢者cyp2e1基因上5^，端上游調(diào)節(jié)區(qū)rsai（rs2031920）、ephx1基因上t/c（rs1051740）及a/g（rs2234922）的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型進(jìn)行檢測(cè)。

3、苯乙烯中毒接觸者遺傳易感性分析

通過對(duì)苯乙烯職業(yè)接觸人群snps基因型的檢測(cè)，出具苯乙烯中毒遺傳易感性分析報(bào)告單。報(bào)告單中詳細(xì)說明了受檢者cyp2e1基因上5^，端上游調(diào)節(jié)區(qū)rsai（rs2031920）、ephx1基因上t/c（rs1051740）及a/g（rs2234922）的3個(gè)snps位點(diǎn)基因檢測(cè)信息及遺傳易感性評(píng)估結(jié)果，并由主檢醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明基因檢測(cè)結(jié)果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院

<120>苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒

<160>3

<210>1

<211>66

<212>dna）

<213>cyp2e(rsai)

<400>核苷酸序列

5′-ttcattgtgtcttctaactgg一3′

5′-ccagtcgagtcttacattgtca一3′

<210>2

<211>67

<212>dna）

<213>ephx1(t/c)

<400>核苷酸序列

5′--gatcgataagttccgtttcacc一3′

5′-aatcttagtcttgaagtgagggt一3′

<210>3

<211>53

<212>dna

<213>ephx1(a/g)

<400>核苷酸序列

5′-acatccacttcatccacg一3′

5′-atgcctctgagaagccat一3′

<110>山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院

<120>苯乙烯中毒遺傳易感性無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒

<160>3

<210>1

<211>66

<212>dna）

<213>cyp2e(rsai)

<400>核苷酸序列

5′-ttcattgtgtcttctaactgg一3′

5′-ccagtcgagtcttacattgtca一3′

<210>2

<211>67

<212>dna）

<213>ephx1(t/c)

<400>核苷酸序列

5′--gatcgataagttccgtttcacc一3′

5′-aatcttagtcttgaagtgagggt一3′

<210>3

<211>53

<212>dna

<213>ephx1(a/g)

<400>核苷酸序列

5′-acatccacttcatccacg一3′

5′-atgcctctgagaagccat一3′