本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬背膘厚性狀的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明包括與豬背膘厚性狀相關(guān)的acoxl和lmna基因變異位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、檢測(cè)方法及其在豬背膘厚性狀中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，引進(jìn)的種豬包括杜洛克、長(zhǎng)白和大白占據(jù)了我國(guó)瘦肉豬市場(chǎng)，對(duì)于引進(jìn)品種仍需要不斷進(jìn)行測(cè)定和選種，才能保持其優(yōu)良特性不退化。生長(zhǎng)性狀和胴體性狀一直是育種改良的目標(biāo)性狀，對(duì)于生長(zhǎng)和胴體性狀除了采取經(jīng)典的blup育種方法進(jìn)行改良外，近些年通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇實(shí)施早期選擇也取得了一些進(jìn)展?；谌蚪M關(guān)聯(lián)分析(genome-wideassociationstudy,gwas)的結(jié)果篩選候選基因，然后在不同的群體中驗(yàn)證其效應(yīng)，為在不同群體中尋找有效的分子標(biāo)記，實(shí)施分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。
背膘厚作為一個(gè)重要的胴體性狀，與豬瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，且遺傳力高，又易于度量等特點(diǎn)，因此常被作為瘦肉率改良的一個(gè)間接性狀被用于瘦肉豬的遺傳改良中。同時(shí)探討豬產(chǎn)肉性狀的遺傳基礎(chǔ),降低bft也成為豬胴體性狀遺傳改良的研究重點(diǎn)。根據(jù)加拿大生豬改良中心(ccsi)的數(shù)據(jù)，從1994年到2014年中，100kg體重時(shí)的bft在1994年為13.6mm，2014年為10.6mm，總共變薄了22％，年遺傳進(jìn)展為-0.2毫米/年；100kg體重日齡在1994年為166天，在2014年為147天，總共縮短了12％，年遺傳進(jìn)展為-1天/年。
類(lèi)?；o酶a氧化酶基因(acyl-coenzymeaoxidase-like，acoxl)編碼類(lèi)?；o酶a氧化酶，是酰基輔酶a氧化酶家族成員之一，最早是cooper等于1969年在蓖麻籽胚乳中發(fā)現(xiàn)蛋白(coopert,beeversh.βoxidationinglyoxysomesfromcastorbeanendosperm.journalofbiologicalchemistry.1969,244:3514-3520)。sandra等人研究非裔美國(guó)人的ii型糖尿病時(shí)，通過(guò)全基因組掃描ii型糖尿病5個(gè)染色體區(qū)域的易感基因發(fā)現(xiàn)acoxl可能是一個(gè)ii型糖尿病關(guān)聯(lián)的候選基因，并且acoxl參與脂類(lèi)代謝(hasstedtsj,highlandhm,elbeinsc,haniscl,dassk.fivelinkageregionseachharbormultipletype2diabetesgenesintheafricanamericansubsetofthegennidstudy.journalofhumangenetics.2013,58:378-383)。suneel等用1433頭大白豬進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在ssc3上找到與第十肋骨處的背膘厚相關(guān)聯(lián)的區(qū)域marc0085867-alga0018683，并且在該區(qū)域把a(bǔ)coxl作為關(guān)聯(lián)背膘厚的候選基因(onterusk,gorbachdm,youngjm,garrickdj,dekkersjc,rothschildmf.wholegenomeassociationstudiesofresidualfeedintakeandrelatedtraitsinthepig.plosone.2013,8:e61756)。
lmna基因編碼a型核纖層蛋白(lamina/c)，它分為lamina和laminc兩個(gè)亞基，這兩個(gè)亞基是由同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼的，但通過(guò)選擇性的剪切產(chǎn)生2種不同的轉(zhuǎn)錄本，繼而翻譯成兩種不同的亞基。prigogine等人對(duì)于oji-creer和inuit人群的研究發(fā)現(xiàn)，lmna的一種常見(jiàn)變異lmna1908c/t多態(tài)性是影響肥胖相關(guān)特征的重要因素，與代謝綜合征相關(guān)(prigoginec,richardp,vandenberghp,groswasserj,deconinckn.novellmnamutationpresentingasseverecongenitalmusculardystrophy.pediatricneurology.2010,43:283-286)。broers通過(guò)對(duì)pima印第安人的基因掃描發(fā)現(xiàn)lmna基因所在的染色體lq21-23區(qū)域異常與肥胖、糖尿病相關(guān)(broersj,ramaekersf,bonneg,yaourb,hutchisonc.nuclearlamins:laminopathiesandtheirroleinprematureageing.physiologicalreviews.2006,86:967-1008)。choi等人在韓國(guó)本地豬×長(zhǎng)白豬產(chǎn)生的f2代群體研究位于ssc4的約89cm區(qū)域與脂肪沉積相關(guān)的qtl，并且在該區(qū)域比較豬和人的圖譜，從而把lmna作為背膘厚的潛在候選基因(choibh,leejs,leesh,kimsc,kimsw,kimks,leejh,seonghh,kimth.porcinelmnaisapositionalcandidategeneassociatedwithgrowthandfatdeposition.asian-australasianjournalofanimalsciences.2012,25:1649)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，克隆檢測(cè)豬背膘厚性狀的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。根據(jù)acoxl和lmna兩個(gè)基因已知序列，利用混池測(cè)序和pcr-rflp方法，尋找這兩個(gè)基因中與豬第十肋骨處背膘厚性狀關(guān)聯(lián)的snp位點(diǎn)，并將snp與目標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而獲得兩個(gè)與背膘厚性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供新的分子標(biāo)記資源。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
首先利用14頭大白豬和4頭長(zhǎng)白豬的重測(cè)序數(shù)據(jù)分析得到acoxl基因和lmna基因可能存在的snp位點(diǎn)。然后將snp所在外顯子序列克隆下來(lái)，進(jìn)行混池測(cè)序和pcr-rflp來(lái)酶切分型，最后獲得snp。所述的acoxlc.8c/t，位于第一外顯子上，堿基突變?nèi)鐖D2所示，引起蘇氨酸到異亮氨酸的改變。lmnac.741g/c，位于第四外顯子上，堿基突變?nèi)鐖D3所示，引起谷氨酸到天冬氨酸的改變。
一種豬背膘厚性狀的分子標(biāo)記acoxlc.8c/t，其核苷酸序列如下所示：
agggatgtactcacatcatatggaagttcccaggctaggggtcgaatcagagctgcagctgccagcctgcacaatagccacagcaatgcaggatctgagccttgtctgtgacctacaccacagttctttaacccactgagtgaagccagggatcgaacccacaacctcatggttcctagtcagatttgtttccgctgtgccaagatgggaactccctcaatcaaacatcttaacacccactttgtatccattcatcacaggtatgatttaagtctggatgaaatgagaar(c/t)ctgacacttcagagagtgaagtttaccatgggcctacctttgttaaagcgtgcaattcaggaacaggtaaggttcattgttattttggtgtgtgtgagtgaatgagagagagacagagacagagggagcaagaagatttcgttttgcttgtttttgtgacttgtggaaggaagctcatgaattttgtcctgtggtgtgggggagggcctccttcaccctccctttctgccccccccaatataattgacattcacttttcccaagcccacaggcttaggaataagggagtcaacagaggtaatgaaatatttgttcacaaaacaaatgtaatttggggtataaaatgcaaatatctgagaaatgtaatgacatcactttataggctcttcaagaattttaaacttgcccc
上述序列的290位堿基處的r是c或t(即堿基c與堿基t發(fā)生替換)，該突變引起蘇氨酸至異亮氨酸的改變。
一種豬背膘厚性狀的分子標(biāo)記lmnac.741g/c，其核苷酸序列如下所示：
gtcagagctggggctgggacattggctgtgtgcagagctcccctgcctgactcccttgtactagtggatggggagttgggtctggggggacggggagtggccagccctcaggttaaaggggggctcacagtggctccattcgcggttaggattgggtcgggagctcagccacctgcctgggtcccatcctcagaggactagttctgattttggtttctgggtccaacccttccaggagcttcgggagaccaagcgccgccatgagacgcggctggtggagattgataatgggaagcagcgcgagtttgagagccggccggctggcagatgccctgcaggar(g/c)
tgcgggcccagcacgaggaccaggtggtgctcgctctcctgtggctccctcgctgcctctgaccctggcacccctccccccacctctgccaccctgatacgtcccttgcgggatcgggtggatgatagcaggagccccgggtgcccaggacctgaggctgcagcagagatgccgttcccaggtcccttccggcccctgcatccctaaccccgcgtcttcccctccag
上述序列的341位堿基處的r是g或c(即，由堿基g與堿基c發(fā)生替換)，該突變引起谷氨酸至天冬氨酸的改變。
申請(qǐng)人制備了一種擴(kuò)增acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外顯子序列和lmnac.741g/c所在的lmna第四外顯子序列的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示：
(1)擴(kuò)增acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外顯子序列(同時(shí)也是酶切時(shí)所用引物)如下：擴(kuò)增片段為501bp，退火溫度為61℃
正向引物：caggatctgagccttgtctgtg
反向引物：cctctgttgactcccttattccta
(2)擴(kuò)增lmnac.741g/c所在lmna第四外顯子序列的引物如下：
擴(kuò)增片段：855bp，退火溫度：60℃
正向引物：cccctggacctgtttgtg
反向引物：cctgggaacggcatctct
(3)lmnac.741g/c在pcr-rflp時(shí)pcr所用引物如下：
擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：441bp，退火溫度：59℃
正向引物：ttctcctgaacgtgtctggattaccactgttgagagccggctggca
gatgccctgcagca
反向引物：ctgagctgggccgagaggctgtcgatg
本發(fā)明的分子標(biāo)記可在豬背膘厚性狀檢測(cè)中應(yīng)用
附圖說(shuō)明
圖1：是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2：acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外顯子序列。括號(hào)內(nèi)顯示該等位基因的突變。
圖3：acoxlc.8c/t的混池測(cè)序的結(jié)果。
圖4：acoxlc.8c/t的酶切分型膠圖。
圖5：lmnac.741g/c所在的lmna第四外顯子序列。括號(hào)內(nèi)顯示該等位基因的突變。
圖6：lmnac.741g/c的混池測(cè)序的結(jié)果。
圖7：lmnac.741g/c的酶切分型膠圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
acoxl和lmna基因snps的篩選
1.引物設(shè)計(jì)
根據(jù)重測(cè)序數(shù)據(jù)分析得到的可能snp位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物將acoxl基因(geneid:100520554)第一外顯子和lmna基因(geneid:100126859)第四外顯子克隆出來(lái)，用于混池測(cè)序，擴(kuò)增該基因的特異引物的序列如下：
擴(kuò)增acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外顯子序列:
正向引物：caggatctgagccttgtctgtg
反向引物：cctctgttgactcccttattccta
擴(kuò)增lmnac.741g/c所在的lmna第四外顯子序列:
正向引物：cccctggacctgtttgtg
反向引物：cctgggaacggcatctct
2.pcr擴(kuò)增條件
樣品基因自dna從大白豬耳樣和長(zhǎng)白豬精液(樣本來(lái)自湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng))提取獲得(按常規(guī)方法提取基因組dna，例如采用商購(gòu)的試劑盒)，用于pcr程序的dna樣品均稀釋成20ng/μl。引物濃度為10um，購(gòu)自(武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司)。mix為2×pcrmix，購(gòu)自(北京艾德萊生物科技有限公司)，loadingbuffer自己配置(稱取4.4gedta，0.25g二甲苯菁ff，0.25g溴酚藍(lán)，溶于200mlddh2o，加熱攪拌溶解。加入180mlglycerol后，用naoh調(diào)節(jié)ph7.0，ddh2o定容至500ml，-20℃保存)，為6×的濃度。
acoxlc.8c/t:10μlpcr體系，取5μl2×pcrmix，3.6μl滅菌水，取濃度為10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna樣品1μl。95℃預(yù)變性5分鐘，35個(gè)循環(huán)(95℃30s，61℃30s，72℃30s)，72℃延伸5分鐘。所得的產(chǎn)物長(zhǎng)度為501bp，用1.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
lmnac.741g/c:10μlpcr體系，取5μl2×pcrmix，3.6μl滅菌水，取濃度為10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna樣品1μl。95℃預(yù)變性5分鐘，35個(gè)循環(huán)(95℃30s，60℃52s，72℃30s)，72℃延伸5分鐘。所得的產(chǎn)物長(zhǎng)度為855bp，用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
然后隨機(jī)選擇10個(gè)樣品，將10個(gè)樣品混在一塊送交測(cè)序公司測(cè)序，是為混池測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用軟件seqman查看和編輯。
3.acoxl和lmna基因pcr-rflp
(1)引物序列(設(shè)計(jì)引物用于酶切分型)
acoxlc.8c/t:
正向引物：caggatctgagccttgtctgtg
反向引物：cctctgttgactcccttattccta
lmnac.741g/c酶切時(shí)所用引物如下：
正向引物：ttctcctgaacgtgtctggattaccactgttgagagccggctggca
gatgccctgcagca
反向引物：ctgagctgggccgagaggctgtcgatg
(2)pcr擴(kuò)增條件
acoxlc.8c/t：10μlpcr體系，取5μl2×pcrmix，3.6μl滅菌水，取濃度為10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna樣品1μl。95℃預(yù)變性5分鐘，35個(gè)循環(huán)(95℃30s，61℃30s，72℃30s)，72℃延伸5分鐘。所擴(kuò)得產(chǎn)物長(zhǎng)度為501bp。用1.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
lmnac.741g/c：10μlpcr體系，取5μl2×pcrmix，3.6μl滅菌水，取濃度為10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna樣品1μl。95℃預(yù)變性5分鐘，35個(gè)循環(huán)(95℃30s，59℃30s，72℃30s)，72℃延伸5分鐘。所擴(kuò)得產(chǎn)物長(zhǎng)度為441bp。用1.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
(3)pcr-rflp檢測(cè)條件
酶切體系：10μl體系，內(nèi)切酶取0.1μl，10×buffer取1μl，滅菌水取3.9μl，pcr產(chǎn)物取5μl。樣品混合離心后，在37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜酶切(約12h)。酶切后取5μl產(chǎn)物在1.8％的瓊脂糖凝膠低壓長(zhǎng)時(shí)間電泳(105v，1h)
acoxlc.8c/t三種基因型：cc型(501bp)，ct型(501bp，300bp，201bp)，tt型(300bp，201bp)。所用內(nèi)切酶為ecori。
lmnac.741g/c三種基因型：cc型(331bp，110bp)，cg型(331bp，271bp，110bp，60bp)，gg型(271bp，110bp，60bp)。所用內(nèi)切酶為pvuii。
(4)分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)分析
試驗(yàn)以369頭大白豬和157頭長(zhǎng)白豬為研究對(duì)象。利用混合線性模型
表1大白豬acoxl基因c.8c/t位點(diǎn)與3個(gè)性狀關(guān)聯(lián)結(jié)果
表1的說(shuō)明：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；note：*meanp＜0.05，**meanp＜0.01。
lmnac.741g/c在大白豬和長(zhǎng)白豬中均與背膘厚顯著關(guān)聯(lián)(p＜0.05)。其中在大白豬中，cc型有90個(gè)個(gè)體，cg型有184個(gè)個(gè)體，gg型有76個(gè)個(gè)體。cc型與cg型和gg型差異顯著(p＜0.05)，cc型是優(yōu)勢(shì)基因型。在長(zhǎng)白豬中，cc型有90個(gè)個(gè)體，cg型有43個(gè)個(gè)體，gg型有8個(gè)個(gè)體。cc型與cg型和gg型差異顯著(p＜0.05)，cg型是優(yōu)勢(shì)基因型。
表2大白豬lmna基因c.741g/c位點(diǎn)與3個(gè)性狀關(guān)聯(lián)結(jié)果
表2的說(shuō)明：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；note：*meanp＜0.05，**meanp＜0.01。
表3長(zhǎng)白豬lmna基因c.741g/c位點(diǎn)與3個(gè)性狀關(guān)聯(lián)結(jié)果
表3的說(shuō)明：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；note：*meanp0.05，**meanp＜0.01。