本發(fā)明屬于基因擴(kuò)增領(lǐng)域，涉及一種解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法，具體涉及一種通過(guò)堿基錯(cuò)配解決多重pcr時(shí)等位基因擴(kuò)增不平衡的方法。

背景技術(shù)：

pcr技術(shù)即基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種可以特異放大擴(kuò)增特定基因片段的技術(shù)，可以使基因片段數(shù)萬(wàn)倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物與單鏈dna模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合雜交，形成部分雙鏈，在dna聚合酶的作用下進(jìn)行dna合成。而寡核苷酸引物與單鏈dna模板的結(jié)合是基于堿基配對(duì)原則：堿基配對(duì)遵循g(鳥嘌呤)：c(胞嘧啶)、a(腺嘌呤)：t(胸腺嘧啶)/u(尿嘧啶)的watson-crick堿基配對(duì)原則。

人體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有23對(duì)染色體，通?；?yàn)殡p等位基因。進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增時(shí)，兩個(gè)等位基因一般情況下沒(méi)有擴(kuò)增效率的差異。但在復(fù)雜基因時(shí)，影響pcr擴(kuò)增效率的因素會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增效率存在明顯擴(kuò)增差異，即等位基因擴(kuò)增不平衡，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)一個(gè)等位基因擴(kuò)增產(chǎn)量極少(擴(kuò)增失敗)，雜合的等位基因被錯(cuò)誤的檢測(cè)為純合等位基因。例如hla基因就是典型的復(fù)雜基因，具有高gc含量、高度同源性，高度多態(tài)性等特點(diǎn)。目前，hla基因總數(shù)已經(jīng)超過(guò)1萬(wàn)個(gè)，這些基因的有效擴(kuò)增是hla高分辨分型的重要基礎(chǔ)。但以上特點(diǎn)決定了hla基因的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)特別困難以及擴(kuò)增難度很高，容易出現(xiàn)hla基因非特異擴(kuò)增、等位基因丟失或等位基因擴(kuò)增不平衡等問(wèn)題，即相應(yīng)基因擴(kuò)增效率低或失敗(擴(kuò)增不平衡)使雜合基因位點(diǎn)丟失一個(gè)等位基因，分型錯(cuò)誤為純合基因位點(diǎn)。

在多重pcr中，因不同引物之間和相應(yīng)匹配的模板序列結(jié)合時(shí)有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，引物tm差異大等原因，不同引物結(jié)合等位基因模板序列能力存在差異。如果不同引物之間與模板序列結(jié)合能力差異較大，則導(dǎo)致不同的等位基因擴(kuò)增效率相差較大，即等位基因擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象。針對(duì)以上出現(xiàn)的等位基因擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象，現(xiàn)有技術(shù)一般采用如下策略進(jìn)行解決：對(duì)于多重pcr中不同引物結(jié)合等位基因模板序列能力的差異，除了常規(guī)的更換引物結(jié)合模板位置或調(diào)整引物長(zhǎng)度(tm值)等策略去平衡引物與模板序列結(jié)合能力的差異，還可以考慮在特異引物5’端引入通用的引物序列，在多重引物擴(kuò)增基礎(chǔ)上，進(jìn)行通用引物的pcr擴(kuò)增，平衡不同引物的最終擴(kuò)增產(chǎn)量。

然而現(xiàn)有的解決方案存在著如下弊端：通用引物多重pcr，在面臨高度復(fù)雜的基因，例如hla基因，因有大量的等位基因，只采用常規(guī)的多重pcr擴(kuò)增以及結(jié)合通用引物的多重pcr擴(kuò)增策略，并不能很好的解決等位擴(kuò)增不平衡問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法。

本發(fā)明所提供的解決等位基因擴(kuò)增不平衡的方法，是針對(duì)由于多重pcr而導(dǎo)致的等位基因擴(kuò)增不平衡的情況的，具體可包括如下步驟：通過(guò)對(duì)原有多重pcr引物中擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物序列人為引入錯(cuò)配堿基(即用其它堿基替換引物序列中匹配的堿基，形成堿基錯(cuò)配)，來(lái)削弱所述擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物與模板的結(jié)合能力，從而解決等位基因擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題；所述原有多重pcr引物為：對(duì)待測(cè)等位基因進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增，出現(xiàn)所述待測(cè)等位基因擴(kuò)增不平衡情況時(shí)所采用的多重pcr引物。

所述方法中，對(duì)所述擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物序列人為引入錯(cuò)配堿基具體可為在所述擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物序列的5’端或/和中段引入錯(cuò)配堿基。

所述5’端可認(rèn)為是將所述引物序列按照堿基數(shù)的多少自5’末端到3’末端進(jìn)行三等分后，位于5’端的1/3。所述中段可認(rèn)為是將所述引物序列按照堿基數(shù)的多少自5’末端到3’末端進(jìn)行三等分后，位于中間的1/3。

其中，對(duì)所述擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物序列人為引入錯(cuò)配堿基時(shí)，所引入的錯(cuò)配堿基的個(gè)數(shù)可為1個(gè)，也可為多個(gè)，如2-5個(gè)。當(dāng)所引入的錯(cuò)配堿基的個(gè)數(shù)為多個(gè)時(shí)，多個(gè)錯(cuò)配的堿基既可為連續(xù)存在，也可為間斷存在。

所述方法中，對(duì)所述擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物序列人為引入錯(cuò)配堿基，是為了調(diào)整對(duì)所述待測(cè)等位基因進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增時(shí)該引物與模板的結(jié)合能力，實(shí)現(xiàn)減少或消除與其它多重引物擴(kuò)增效率的差異。

在對(duì)所述擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物序列人為引入錯(cuò)配堿基時(shí)，具體可參照如下原則進(jìn)行：

(1)所引入的錯(cuò)配堿基的個(gè)數(shù)越多和/或越靠近引物3’末端，引物與模板的結(jié)合能力變得越弱；

(2)一般而言，堿基錯(cuò)配形式中t/g、a/g錯(cuò)配穩(wěn)定性最高，a/c、c/c錯(cuò)配穩(wěn)定性最低，其它錯(cuò)配形式穩(wěn)定性介于中間。引入人工錯(cuò)配堿基時(shí)，可以參考錯(cuò)配穩(wěn)定性去選擇錯(cuò)配形式。

在所述方法中，所述待測(cè)等位基因可為任意基因，特別是高度復(fù)雜的基因，例如hla基因，具體如hla-drb1基因。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述待測(cè)等位基因具體為基因型分別為drb1*01:01:01(imgt/hlaaccno:hla00664)和drb1*15:01:01:01(imgt/hlaaccno:hla00865)的hla-drb1基因。

相應(yīng)的，所述原有多重pcr引物中用于擴(kuò)增基因型為drb1*01:01:01的hla-drb1基因的引物對(duì)由上游引物a1和下游引物b組成，用于擴(kuò)增基因型為drb1*15:01:01:01的hla-drb1基因的引物對(duì)由上游引物a5和所述下游引物b組成；

上游引物a1：5’-cacagcacgtttcttgtggcagcttaagtt-3’(序列1)；

上游引物a5：5’-cacagcacgtttcctgtggcag-3’(序列2)；

下游引物b：5’-gctcacctcgccgctgcac-3’(序列3)。

在所述原有多重pcr引物中，所述擴(kuò)增效率相對(duì)較強(qiáng)的引物為用于擴(kuò)增所述基因型為drb1*01:01:01的hla-drb1基因的引物；所述方法中，將所述上游引物a1自5’末端起的5個(gè)堿基由“cacag”替換為“agaca”，其余堿基序列保持不變，從而解決了所述基因型分別為drb1*01:01:01和drb1*15:01:01:01的hla-drb1基因擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題。

進(jìn)一步，在引入錯(cuò)配堿基后，對(duì)所述基因型分別為drb1*01:01:01和drb1*15:01:01:01的hla-drb1基因進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系中所述上游引物a1、所述上游引物a5和所述下游引物b的摩爾濃度分別為0.2μm、0.2μm、0.3μm。

更加具體的，在引入錯(cuò)配堿基后，對(duì)所述基因型分別為drb1*01:01:01和drb1*15:01:01:01的hla-drb1基因進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)程序如下：96℃3min；96℃25s，66℃50s，72℃1min30s，10個(gè)循環(huán)；96℃25s，64℃50s，72℃1min30s，24個(gè)循環(huán)；72℃5min；12℃保存。

本發(fā)明針對(duì)由于多重pcr而導(dǎo)致的等位基因擴(kuò)增不平衡的情況，提供了通過(guò)堿基錯(cuò)配解決多重pcr時(shí)等位基因擴(kuò)增不平衡的方法。實(shí)驗(yàn)證明，該方法確實(shí)可以有效的解決由于多重pcr而導(dǎo)致的等位基因擴(kuò)增不平衡。

附圖說(shuō)明

圖1為drb1*01:01:01/drb1*15:01:01:01基因型樣品在向引物序列引入錯(cuò)配堿基前后的測(cè)序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、通過(guò)堿基錯(cuò)配解決多重pcr時(shí)等位基因擴(kuò)增不平衡

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)多重pcr引物間擴(kuò)增效率平衡，可以考慮多重?cái)U(kuò)增體系中一些引物序列引入人為突變，即用其它堿基替換引物序列中匹配的堿基，形成堿基錯(cuò)配。堿基不匹配時(shí)使雙螺旋骨架扭曲失去穩(wěn)定性而解旋，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，這就降低了雜交雙鏈的結(jié)合力。因dna聚合酶延伸機(jī)制，在引物的3’端引入突變對(duì)擴(kuò)增效率影響最大，可優(yōu)先考慮在引物中段及5’端引入突變堿基，調(diào)整相應(yīng)引物的擴(kuò)增效率；另外，一般而言，堿基錯(cuò)配形式中t/g、a/g錯(cuò)配穩(wěn)定性最高，a/c、c/c錯(cuò)配穩(wěn)定性最低，其它錯(cuò)配形式穩(wěn)定性介于中間。引入人工錯(cuò)配堿基時(shí)，可以參考錯(cuò)配穩(wěn)定性去選擇錯(cuò)配形式。

下面以具體實(shí)例對(duì)這種通過(guò)堿基錯(cuò)配解決多重pcr時(shí)等位基因擴(kuò)增不平衡問(wèn)題的方法進(jìn)行闡述。

一、hla-drb1多重pcr擴(kuò)增平衡性問(wèn)題的解決

將hla-drb1基因分為6大組(合計(jì)1285個(gè)等位基因，包括drb1*01:01:01和drb1*15:01:01:01)，但每個(gè)組內(nèi)一些等位基因的5'端、3'區(qū)域仍存在一定的差異。根據(jù)hla-drb1基因外顯子2的5'端及與內(nèi)含子1的交界處的多態(tài)性，分組設(shè)計(jì)相應(yīng)的6條上游引物和1條下游引物。使用常規(guī)的多重pcr擴(kuò)增以及結(jié)合通用引物的多重pcr擴(kuò)增策略后，仍有一些等位基因出現(xiàn)擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象。

為使這6大組基因型以及組內(nèi)等位基因都能有效平衡擴(kuò)增，避免多重引物間競(jìng)爭(zhēng)等多種因素所致的擴(kuò)增不平衡，在常規(guī)方法及通用引物的多重pcr擴(kuò)增基礎(chǔ)上，通過(guò)在特異性引物5’端引入堿基錯(cuò)配的引物設(shè)計(jì)(調(diào)節(jié)引物與基因序列的結(jié)合能力)，實(shí)現(xiàn)了等位基因有效擴(kuò)增與擴(kuò)增平衡，同時(shí)又保證了擴(kuò)增的特異性。

以下將具體闡述該多重pcr擴(kuò)增中是如何通過(guò)堿基錯(cuò)配解決基因型分別為drb1*01:01:01(imgt/hlaaccno:hla00664)和drb1*15:01:01:01(imgt/hlaaccno:hla00865)的hla-drb1基因擴(kuò)增不平衡的問(wèn)題的。

1、原有多重pcr引物及反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

(1)原有多重pcr引物

六條上游引物和一條共用的下游引物，分別記為上游引物a1、a2、a3、a4、a5、a6和下游引物b。其中所述上游引物a1和所述下游引物b用于擴(kuò)增基因型為drb1*01:01:01的hla-drb1基因，所述上游引物a5和所述下游引物b用于擴(kuò)增基因型為drb1*15:01:01:01的hla-drb1基因；其余上游引物與所述下游引物b的組合用于擴(kuò)增其他基因型的hla-drb1基因。

上游引物a1：5’-cacagcacgtttcttgtggcagcttaagtt-3’(序列1)；

上游引物a5：5’-cacagcacgtttcctgtggcag-3’(序列2)；

下游引物b：5’-gctcacctcgccgctgcac-3’(序列3)。

上游引物a2：5’-agacacacgtttcttggagcaggttaaac-3’；

上游引物a3：5’-accagcacgtttcttgaagcaggataagtt-3’；

上游引物a4：5’-aacagcacgtttcttggaggaggt-3’；

上游引物a6：5’-cacagcacgtttcttggagtactcta-3’。

(2)多重pcr反應(yīng)體系：

(3)多重pcr反應(yīng)程序：

96℃3min；96℃25s，66℃50s，72℃1min30s，10個(gè)循環(huán)；96℃25s，64℃50s，72℃1min30s，24個(gè)循環(huán)；72℃5min；12℃保存。

結(jié)果顯示：采用如上原有多重pcr引物及反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)蛐蜑閐rb1*01:01:01/drb1*15:01:01:01雜合型的hla-drb1基因進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增時(shí)，會(huì)產(chǎn)生等位基因擴(kuò)增不平衡的情況，drb1*01:01:01/drb1*15:01:01:01組合中drb1*15:01:01:01峰較低，表明drb1*15:01:01:01基因型擴(kuò)增效率明顯低于drb1*01:01:01。如圖1中“普通策略”所示。

2、引入錯(cuò)配堿基后的多重pcr引物及反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

(1)引入錯(cuò)配堿基后的多重pcr引物

根據(jù)步驟1的結(jié)果，可知drb1*15:01:01:01基因擴(kuò)增效率明顯低于drb1*01:01:01基因，因此需要人為降低多重pcr反應(yīng)體系中drb1*01:01:01基因型的擴(kuò)增效率，以平衡這兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增效率。

具體是將用于擴(kuò)增drb1*01:01:0基因型的原引物特異性序列(即上游引物a)中位于5’端的5個(gè)堿基替換(具體如下所示)，從而降低引物與drb1*01:01:01基因的結(jié)合能力，即降低多重pcr反應(yīng)體系中drb1*01:01:01基因的擴(kuò)增效率。其余引物與步驟1一致，保持不變。

(2)多重pcr反應(yīng)體系：同步驟1(2)。

(3)多重pcr反應(yīng)程序：同步驟1(3)。

結(jié)果顯示：采用如上引入錯(cuò)配堿基后的多重pcr引物及反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)蛐蜑閐rb1*01:01:01/drb1*15:01:01:01雜合型的hla-drb1基因進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增時(shí)，drb1*01:01:01和drb1*15:01:01:01兩等位基因峰型均明顯，擴(kuò)增效率接近。如圖1中“新策略”所示。

<110>北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司；成都博奧晶芯生物科技有限公司

<120>通過(guò)堿基錯(cuò)配解決多重pcr時(shí)等位基因擴(kuò)增不平衡的方法

<130>gncln170604

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cacagcacgtttcttgtggcagcttaagtt30

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cacagcacgtttcctgtggcag22

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gctcacctcgccgctgcac19