專利名稱：一種c端特異的人dna錯配修復(fù)蛋白mlh1多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品，具體是一種C 端特異的人DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1多肽及其抗體制備方法，屬于生 物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
MLH1 ( MutL protein homolog 1)是一種DNA錯配修復(fù)蛋白。錯配DNA的修復(fù)是維持不同時相遺傳信息完整性的必須環(huán)節(jié)。DNA復(fù)制過程中 鏈間錯配而滑落會造成一個微小重復(fù)的改變，這被稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。目 前已有研究將這種DNA修復(fù)功能的缺陷和人類的致癌作用聯(lián)系在一起。隨 著遺傳性非息肉直腸癌(HNPCC)遺傳基礎(chǔ)的闡明，錯配修復(fù)基因的重要 性越來越來明顯。MSHS2參與復(fù)制錯配修復(fù)過程中錯配核苷酸的起始識別 過程，研究表明，當(dāng)MSH2與錯配的DNA二聚體結(jié)合后，即與MLH1和 PMSH形成的異源二聚體相連，三者一同輔助錯配修復(fù)的后期步驟。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為解決通過免疫實(shí)驗(yàn)特異性檢測人DNA錯配修復(fù)蛋白 MLH1的表達(dá)與天然存在，并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品 的問題，而提供的一種能特異性針對人MLH1的C端的合成多肽、相應(yīng) 抗體及其制備方法。本發(fā)明還可同時解決目前使用的類似抗體價格高， 親和力低，抗體結(jié)合蛋白的位置不特異且抗原性較差等問題。本發(fā)明所 述的抗人MLH1合成多肽、相應(yīng)抗體，按照以下步驟制備抗原表位分析與拮抗位置確定利用多種表位預(yù)測軟件，如 DNAstar， OMIGA， UWGCG等進(jìn)行綜合分析，主要考量指標(biāo)包括親水 性結(jié)構(gòu)、抗原指數(shù)、表面可及性等，再結(jié)合我們己有實(shí)際制備抗體的驗(yàn) 證經(jīng)驗(yàn)，最終確定第446到第460位為該抗體的靶標(biāo)，其氨基酸序列為 SLEGDTTKGTSEMSE多肽的合成革E標(biāo)多肽采用全自動多通道多肽合成儀合成，柱層析純化，然后通過HPLC，用每分鐘1。/。的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來檢測純度。多肽與載體蛋白交聯(lián)由于本合成多肽分子量太小，在動物體內(nèi)不 能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進(jìn)行免疫，選 擇鑰孔嘁血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián)，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制 備出人工免疫原。免疫動物所述的制備方法，其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原， 免疫家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經(jīng)過適應(yīng)性詞養(yǎng)后進(jìn)行 多點(diǎn)注射免疫。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測抗體效價達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時停止免疫?？贵w純化達(dá)到要求的免疫動物放血，標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清，依次 使用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過柱純化方法，進(jìn)行抗血清純化，通過SDS-PAGE和HPLC驗(yàn)證純度，得到目標(biāo)抗體。本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價高、親和力強(qiáng)，可與天然人DNA 錯配修復(fù)蛋白MLH1分子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本 較常規(guī)的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后 可以用于各種酶免檢測和WB試驗(yàn)要求，可用于建立體外免疫分析。


圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結(jié)果圖。 圖2是質(zhì)譜鑒定合成多肽分子量結(jié)果圖。圖3是通過間接ELISA方法鑒定純化抗體相對親和常數(shù)結(jié)果圖。圖1表明經(jīng)過HPLC對合成的多肽進(jìn)行純化后，液相色譜鑒定純度 為86.4%。圖2表明多肽分子量理論值為1673.8，質(zhì)譜鑒定實(shí)測值M+H+
為術(shù)5丄圖3中ELISA檢測制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為 106-107L/mol。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:人MLH1抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析軟件，對人MLH1氮 基酸序列進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、抗原指數(shù)(antigenicity)、表面 可及性(surfaceprobability)以及同源性(homology)等分析，再結(jié)合我們 已有實(shí)際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)，最終確定第446到第460位為靶標(biāo)，其 氨基酸序列為SLEGDTTKGTSEMSE。在全自動多肽合成儀上由固定羧 基向氨基端遞減合成后獲得粗品。經(jīng)30%乙睛溶解后，進(jìn)行高壓液相色 譜(HPLC)分析，計算主峰面積并收集，經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽， 質(zhì)譜鑒定。實(shí)施例2:合成多肽與載體的偶聯(lián)。載體蛋白選擇KLH (Keyhole !impethemocyanin)，用雙功能試劑 順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進(jìn)行偶 聯(lián)取KLH5mg (0.11,1，含賴氨酸2.2|jmol)，溶于0.75mL偶聯(lián) 緩沖液1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5) ; 3mg MBS (",)溶 于75)JL二甲酰胺(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉(zhuǎn) 混勻，室溫下作用30分鐘。迅速離心后，將反應(yīng)混合物(約0.8mL)加 入預(yù)先用偶聯(lián)緩沖液2 (0.1mol/L磷酸鹽，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0)平衡的PD-10柱。用偶聯(lián)緩沖液2洗脫， 收集洗脫液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶 聯(lián)緩沖液2，加入MBS-KLH緩沖液0.56，室溫下旋轉(zhuǎn)混合，作用2小 時后置4。C過夜，將反應(yīng)混合物(約0.7mL)加入預(yù)先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫，收集流出液。將KLH、 MBS-KLH禾口 偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)
鑒定偶聯(lián)效率。
實(shí)施例3:抗多肽抗體的制備。
取偶聯(lián)的KLH-多肽500Mg，溶于500mL磷酸緩沖液，加等體積的 完全福氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標(biāo)準(zhǔn)為2-2.5公斤)， 經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后，背部皮內(nèi)不少于15點(diǎn)注射。2周后抗原量減半 (250|jg)，加等體積的不完全福氏佐劑，第一次加強(qiáng)免疫。2周后進(jìn)行 第二次加強(qiáng)免疫，方法同前。再2周后開始耳緣靜脈少量采血，用合成 多肽(1|jg/mL)包被酶標(biāo)板，間接ELISA法檢測免疫血清效價。反復(fù)加 強(qiáng)免疫，至取血測抗體效價達(dá)到1: 16萬時停止免疫，采用頸動脈放血 收集抗體。
實(shí)施例4:親和層析純化抗多肽抗體。
① 人MLH1合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化 Sepharose4B，用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯(lián)緩沖液 洗2次，迅速與溶于5mL偶聯(lián)緩沖液的合成多肽500ijg混合，室溫旋 轉(zhuǎn)混合2小時。加入0.2mol/L甘氨酸4mL終止反應(yīng)，室溫下旋轉(zhuǎn)混合1 小時。用偶聯(lián)緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50mL磷 酸鹽緩沖液洗凝膠，按終止?jié)舛?.02。/。加疊氮鈉(NaN3)，置4。C保存。
② 親和層析純化抗多肽抗體將20mL兔抗多肽血清與16mL多肽 偶聯(lián)的Sepharose 4B共同加入50mL離心管，4°C旋轉(zhuǎn)混合6小時。將凝膠加入層析柱，棄去流出液，用15mL磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每 次加0.8mL pH2.9， 0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別 加入8支預(yù)先加入80ijL2mol/LTris-HCL緩沖液(pH7.5) ， 20mL磷
酸鹽緩沖液洗凝膠。上述全部操作在4。c下完成。毎管取洗脫液2ijL， 稀釋50倍后測280nm的OD值，計算蛋白質(zhì)含量并繪制洗脫曲線。
實(shí)施例5:抗體鑒定，使用間接ELISA方法檢測抗體相對親和常數(shù)。
用合成肽交聯(lián)BSA，分別以5 ug/mL和10 ug/mL的濃度，在4 度下包被ELISA檢測板過夜，10。/。的山羊血清室溫封閉2小時后加入倍 比稀釋的己知蛋白濃度的純化后的抗體，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗0.1mL， TMB顯色測定A450。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以曲線 達(dá)到水平時的A450值為100%，以其他相對于該濃度的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo) 作圖，求出A50即50% A值對應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff=(n —1)/2(n[Ab，] t一2[Ab]t)算出抗體相對親和常數(shù)，其中[Ab， ]t 、 [Ab]t指的是A50 時即包被抗原分別為5 u g/mL和10 u g/mL時抗體半飽和時抗體的摩爾 濃度，[Ag]t、 [Ag' ] t指的是包被的抗原濃度本實(shí)驗(yàn)中即指10 u g和5 yg， n=[Ag]t/[Ag， ] t，本實(shí)驗(yàn)中n=2。試驗(yàn)效果
1. 人MLH1合成多肽HPLC純化后，使用液相色譜鑒定純度為 86.4.6%。多肽分子量理論值為1673.8，質(zhì)譜鑒定實(shí)測值M+H+
為1675.1。
2. 多肽與載體的偶聯(lián)效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)效率與樣品回 收率大致相符，大于80%。
3. 抗體效價多只家兔得到的抗血清效價均在1:10萬以上。
4. 抗體親和力相對親和常數(shù)為106-107L/mol。
5. 抗體的應(yīng)用以上技術(shù)指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)保證該抗體完全可以應(yīng)用于蛋 白印跡和各種酶免實(shí)驗(yàn)，以及建立相應(yīng)體外免疫分析試劑。序列表
<110>北京意宏安生物科技有限公司
<120> —種C端特異的人DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1多肽及其抗體制備
方法
<160>2
<210> 1 <211> 756 <212> PRT <213>人
<400> 1
MSFVAGVIRRLDETWNRIAAGSLEGDTTKGTSEMSENCLDAKSTSI QVIVKEGGLKLIQIQDNGTGIRKEDLDIVCERFTTSKLQSFEDLASIST丫GF RGEALASISHVAHVTITTKTADGKCA丫RASYSDGKLKAPPKPCAGNQGTQ ITVEDLFYNIATRRKALKNPSEE丫GKILEWGR丫SVHNAGISFSVKKQGET VADVRTLPNASTVDNIRSIFGNAVSRELIEIGCEDKTLAFKMNGYISNANYS VKKCIFLLFINHRLVESTSLRKAIETVYAAYLPKNTHPFLYLSLEISPQNVDV NVHPTKHEVHFLHEESILERVQQHIESKLLGSNSSRM丫FTQTLLPGLAGP SGEMVKSTTSLTSSSTSGSSDKVYAHQMVRTDSREQKLDAFLQPLSKPL SSQPQAIVTEDKTDISSGRARQQDEEMLELPAPAEVAAKNQSLEGDTTK GTSEMSEKRGPTSSNPRKRHREDSDVEMVEDDSRKEMTAACTPRRRIINLTSVLSLQEEINEQGHEVLREMLHNHSFVGCVNPQWALAQHQTKLYLL NTTKLSEELFYQILIYDFANFGVLRLSEPAPLFDLAMLALDSPESGWTEED GPKEGLAEYIVEFLKKKAEMLADYFSLEIDEEGNLIGLPLLIDNYVPPLEGL PIFILRLATEV隨DEEKECFESLSKECAMFYSIRKQYISEESTLSGQQSEV PGSIPNSWKWTVEHIVYKALRSHILPPKHFTEDGNILQLANLPDLYKVFER C
<210>2 <211> 15 <212> PRT <213>人
<400> 2
SLEGDTTKGTSEMSE
權(quán)利要求
1.一種C端特異的人DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為SLEGDTTKGTSEMSE。
2. —種特異的抗人DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1C端合成多肽抗體，其特征在于該抗體效價在 1: 100000以上，特異性強(qiáng)，親和力高達(dá)106—107 L/mol。
3. —種特異的抗人DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1C端合成多肽抗體的制備方法，其特征在于以 人MLH1氨基酸序列中第446到第460位的SLEGDTTKGTSEMSE肽段序列作為抗原肽 合成人MLH1抗原肽；純化的抗原肽與蛋白載體偶聯(lián)，經(jīng)柱層析純化后；制備出人工免 疫原，免疫動物，制備多肽抗體，并經(jīng)親和層析純化而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于載體蛋白為鑰孔嘁血藍(lán)素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于偶聯(lián)的KLH—多肽加福氏佐劑免疫后收集抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，免疫家 兔制備兔抗人MLH1合成多肽抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于合成多肽偶聯(lián)S印harose4B，制備親和層析 柱，用于純化抗多肽抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種C端特異的人DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1多肽及其抗體的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。C端特異的人MLH1多肽的氨基酸序列為SLEGDTTKGTSEMSE。抗人MLH1多肽抗體按以下方法制備(1)人MLH1抗原表位的分析；(2)人MLH1 C端多肽的合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗人MLH1多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人MLH1多肽抗體。本發(fā)明制備的C端特異的抗人MLH1合成多肽抗體效價高、親和力強(qiáng)、特異性好，可與天然人DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)；制備成本低；純化后的抗體可完全用于免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，以及建立體外免疫分析方法。該抗體為研究人MLH1的生物學(xué)功能及其與相關(guān)疾病的關(guān)系提供了有用的工具。
文檔編號C07K7/00GK101318997SQ20071010017
公開日2008年12月10日 申請日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者呂玉娥, 杜宏武, 陳光宇 申請人:北京意宏安生物科技有限公司