專利名稱：Dna損傷修復(fù)基因msh2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為耙標(biāo)基因的腫 瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
MSH2基因?qū)儆贒NA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(mismatch r印air ,畫R)醒R基因的缺陷將導(dǎo)致復(fù) 制后MMR功能的喪失，進(jìn)而增加細(xì)胞的自發(fā)突變頻率而使細(xì)胞出現(xiàn)所謂的突變子表型.突變 子表型被認(rèn)為能夠?qū)е露嗖桨┳冞^(guò)程所需的多重突變，并使得基因突變的事件不斷放大積 累，使大量錯(cuò)誤信息遍布于整個(gè)基因組(包括癌基因，抗癌基因以及其他與腫瘤關(guān)系密切的 基因)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生.研究發(fā)現(xiàn),腸道對(duì)垸化劑耐受，MMR功能缺陷細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu) 勢(shì)，加速了腫瘤的發(fā)生.
研究發(fā)現(xiàn)造成遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌(HN PCC)的原因絕大部分歸于固R基因的突 變，尤其是hMSH2突變是造成HN PCC發(fā)生的主要原因。DNA作為多種抗癌藥物攻擊的靶分子， 其損傷修復(fù)能力異常，是導(dǎo)致各種直接或間接引起DNA損傷的抗癌藥產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī) 制.因此，從研究醒R基因入手,篩選與DNA修復(fù)有關(guān)的選擇性抑制劑能降低腫瘤的多藥耐藥 性，增加化療效果,為腫瘤治療和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性開辟新途徑。
另外，不同的醒R基因產(chǎn)物在腫瘤良惡性病變中表達(dá)存在差異.MSH2在惡性腫瘤中表達(dá) 水平明顯上調(diào)，這很可能是因?yàn)镸SH2基因自身發(fā)生突變,且編碼出的產(chǎn)物促進(jìn)腫瘤發(fā)生.
光動(dòng)力療法(Photodynamic Ther邵y,簡(jiǎn)稱PDT)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種通過(guò)生物光 敏化作用來(lái)?yè)p傷腫瘤組織的新型腫瘤療法。其原理是利用一些熒光量子產(chǎn)額高的光敏劑注 射體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞與其親和性高于正常細(xì)胞，因而潴留在腫瘤細(xì)胞中。當(dāng)用強(qiáng)光照射后， 光敏劑吸收光子躍遷至激發(fā)態(tài)，處于激光態(tài)的光敏劑再將能量傳至周圍的氧分子產(chǎn)生單線 態(tài)氧。單線態(tài)氧是細(xì)胞的強(qiáng)毒性劑，作用途徑包括直接損傷，即通過(guò)細(xì)胞膜、線粒體或溶 酶體等PDT敏感細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，破壞此結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞受損。
光敏劑正是通過(guò)上述的機(jī)制而殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織的損傷極小。且光動(dòng)力療 法具有雙重選擇性即光導(dǎo)纖維的定向照射作用與藥物在腫瘤組織中的潴留作用，使該療法 在腫瘤治療中具有良好的應(yīng)用前景。目前阻礙光動(dòng)力療法的主要瓶頸是光敏劑。但是獲得 一種新型高效理想的光敏劑難度大。如果能從光動(dòng)力療法的機(jī)制入手，獲得光敏劑的靶標(biāo) 基因，將推動(dòng)光動(dòng)力療法的應(yīng)用。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力治療腫瘤細(xì)胞前后MSH2基因發(fā)生改變，且MSH2沉默后對(duì)光動(dòng)力 治療的敏感性減弱，MSH2是光敏劑的靶標(biāo)基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)MSH2表達(dá)水平在光動(dòng)力治療腫瘤細(xì)胞前后的變化判斷與MSH2相關(guān) 的光敏劑及對(duì)光敏劑的敏感性，以MSH2表達(dá)水平為指標(biāo)篩選獲得與MSH2相關(guān)的高效光敏 劑。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的 腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法，包括下列歩驟
a. Real-time PCR檢測(cè)靶腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)MSH2;
b. 光敏劑與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)； C.激光照射耙腫瘤細(xì)胞；
d. 收集激光照射后的腫瘤細(xì)胞抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
e. 檢測(cè)光敏劑光動(dòng)力治療后MSH2表達(dá)水平改變情況；
f. 獲得與MSH2相關(guān)的高效光敏劑。
可以通過(guò)改變MSH2基因的表達(dá)水平來(lái)影響光敏劑的光動(dòng)力療效，同時(shí)可以用MSH2沉默 后的穩(wěn)定細(xì)胞株或過(guò)表達(dá)后的穩(wěn)定細(xì)胞作為篩選與MSH2相關(guān)的光敏劑。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供另一種MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法 光敏劑的篩選方法，包括下列步驟
(1) 構(gòu)建MSH2低表達(dá)穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞株或過(guò)表達(dá)穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞株；
(2) 將光敏劑與穩(wěn)定細(xì)胞株共培養(yǎng)；
(3) 激光照射與光敏劑共培養(yǎng)后的穩(wěn)定細(xì)胞株；
(4) MTT法評(píng)估細(xì)胞的存活率；
(5) 通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，獲得對(duì)MSH2敏感的光敏劑。 步驟2中所述的靶腫瘤細(xì)胞可為根據(jù)reaMime PCR法檢測(cè)MSH2基因在光動(dòng)力療法前后
的表達(dá)情況得到MSH2表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞株。
將光敏劑與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，激光照射腫瘤細(xì)胞，激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧殺傷腫瘤細(xì)胞，Real-time PCR檢測(cè)治療前后MSH2的表達(dá)水平，表達(dá)水平增加提示細(xì)胞對(duì)光敏劑的敏 感性增加，為光敏劑介導(dǎo)的腫瘤光動(dòng)力治療提供新的應(yīng)用途徑。
通過(guò)檢測(cè)腫瘤光動(dòng)力治療前后MSH2基因表達(dá)水平改變，并且MSH2沉默后細(xì)胞對(duì)光動(dòng)力 治療產(chǎn)生抵抗，證明MSH2是光敏劑的基因靶標(biāo)，可以通過(guò)改變MSH2基因的表達(dá)水平來(lái)影響 光敏劑的光動(dòng)力療效，同時(shí)可以用MSH2沉默后的穩(wěn)定細(xì)胞株或過(guò)表達(dá)后的穩(wěn)定細(xì)胞作為篩 選與MSH2相關(guān)的光敏劑。MSH2的過(guò)表達(dá)載體及小分子干擾片斷可以作為光動(dòng)力治療的輔助 手段，提高光動(dòng)力療效。


圖1 DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑一種篩選方法
的操作流程圖； 圖2實(shí)施例1的光敏劑光動(dòng)力治療后MSH2表達(dá)水平；
X軸代表光敏劑光動(dòng)力治療情況，Ps為只加光敏劑，PDT為光敏劑加激光；Y軸
代表MSH2表達(dá)水平。 圖3實(shí)施例2 MTT法檢測(cè)MSH2低表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)光敏劑光動(dòng)力治療的敏感性變化，
X軸中NC為正常表達(dá)MSH2的細(xì)胞，MSH2-siRNA為MSH2被沉默的細(xì)胞；Y軸為細(xì)
胞的存活率。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:光敏劑光動(dòng)力治療前后MSH2差異表達(dá)檢測(cè) (以結(jié)腸癌細(xì)胞株sw480為例) 1將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞株sw480細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸 液，接種于6cm培養(yǎng)皿中 2置37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)
3 24h后加光敏劑
4 48h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行光照(XD-635AB型光動(dòng)力PDT激光治療儀)
5 根據(jù)Invitrogen公司的Trizol說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取，均為RNase-free操作。 6根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說(shuō)明書進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
7 Real-time PCR檢測(cè) (1)配置反應(yīng)體系
6每管加入量
0.5nl l単 8，
(2) 設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-timePCR:預(yù)變性95。C， 15S;之后每一步變性95。C。 5S; 退火延伸60'C， 30S;共進(jìn)行54個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。
(3) 制作熔解曲線
8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并繪圖，結(jié)果見圖2。
試劑
SYBR premix ex taq: 上游引物(5jiM): 下游引物(5pM): cDNA 水
實(shí)施例2: MTT法檢測(cè)MSH2低表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)光敏劑光動(dòng)力治療的敏感性變化
(以結(jié)腸癌細(xì)胞株sw480為例)
1. 將MSH2RNA干擾慢病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞株sw480，獲得低表達(dá)MSH2的穩(wěn)定細(xì)胞株
2. 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液；正常表達(dá)MSH2 的細(xì)胞作為對(duì)照。
3. 接種于96孔板，每孔lOOpl
4. 置37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)
5. 24h后加光敏劑
6. 48h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行光照(XD-635AB型光動(dòng)力PDT激光治療儀)
7. 72h時(shí)進(jìn)行MTT檢測(cè)
8. 進(jìn)行MTT前拍照
9. 培養(yǎng)終止前4h加入10pl 5mg/ml的MTT
10. 吸棄培養(yǎng)液后加lOOnlDMSO終止反應(yīng)
11. 酶標(biāo)儀570nm檢測(cè)OD值
12. 采用軟件SPSS12.0對(duì)兩種細(xì)胞的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，結(jié)果見圖3。
權(quán)利要求
1.一種DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法，其特征在于包括下列步驟a.Real-time PCR檢測(cè)靶腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)MSH2；b.光敏劑與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)；c.激光照射靶腫瘤細(xì)胞；d.收集激光照射后的腫瘤細(xì)胞抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA；e.檢測(cè)光敏劑光動(dòng)力治療后MSH2表達(dá)水平改變情況；f.以MSH2表達(dá)水平為指標(biāo)篩選獲得強(qiáng)殺傷作用的光敏劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光敏 劑的篩選方法，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞株sw480。
3. —種DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法， 其特征在于包括下列步驟(1) 構(gòu)建MSH2低表達(dá)穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞株或過(guò)表達(dá)穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞株；(2) 將光敏劑與穩(wěn)定細(xì)胞株共培養(yǎng)；(3) 激光照射與光敏劑共培養(yǎng)后的穩(wěn)定細(xì)胞株；(4) MTT法評(píng)估細(xì)胞的存活率；(5) 通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，獲得對(duì)MSH2敏感的光敏劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光 敏劑的篩選方法，其特征在于所述MSH2低表達(dá)穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞株對(duì)光敏劑介導(dǎo)的光 動(dòng)力治療產(chǎn)生抵抗。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光 敏劑的篩選方法，其特征在于所述MSH2過(guò)表達(dá)穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞株增加對(duì)光敏劑介導(dǎo) 的光動(dòng)力治療的敏感性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為耙標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng) 力療法光敏劑的篩選方法，其特征在于步驟2中所述的靶腫瘤細(xì)胞可為根據(jù)real-time PCR法檢測(cè)MSH2基因在光動(dòng)力療法前后的表達(dá)情況得到MSH2表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞株。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng) 力療法光敏劑的篩選方法，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480。
全文摘要
本發(fā)明涉及DNA損傷修復(fù)基因MSH2作為靶標(biāo)基因的腫瘤光動(dòng)力療法光敏劑的篩選方法。通過(guò)檢測(cè)腫瘤光動(dòng)力治療前后MSH2基因表達(dá)水平改變，以MSH2表達(dá)水平為指標(biāo)篩選獲得強(qiáng)殺傷作用的光敏劑；用MSH2沉默后的穩(wěn)定細(xì)胞株或過(guò)表達(dá)后的穩(wěn)定細(xì)胞作為篩選與MSH2相關(guān)的光敏劑。MSH2的過(guò)表達(dá)載體及小分子干擾片斷可以作為光動(dòng)力治療的輔助手段，提高光動(dòng)力療效。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101665830SQ20091005478
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者丁志樓, 筠 孫, 楊曉霞, 鄭梅珍, 陳志龍 申請(qǐng)人:東華大學(xué);陳志龍