專利名稱：一種檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法。
相關(guān)文獻(xiàn)有(1)Leon，S.A.，Shapiro，B.，Sklaroff，D.M.，et.al.，F(xiàn)ree DNA in the serum of cancerpatients and the effect of therapy.Cancer Res.，37646-650，1977.
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(3)Stroun，M.，Anker，P.，Maurice，P.，et.a1.，Neoplastic characteristics of the DNAfound in the plasma of cancer patients.Oncology(Basel)，46318-322，1989.
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本發(fā)明通過(guò)對(duì)腫瘤患者如肺癌患者血漿中分離純化DNA，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)其中P16基因表達(dá)的改變，為臨床預(yù)測(cè)和預(yù)后分析提供參考資料。
本發(fā)明方法通過(guò)下述方法和步驟進(jìn)行，1)取腫瘤患者血漿標(biāo)本肝素抗凝，離心后，血漿保存?zhèn)溆茫?)分離純化提取血漿DNA；取備用血漿直接加等量生理鹽水，重復(fù)加入Tris-飽和酚和氯仿∶異戊醇混合液，混勻、分層后，離心，取上層液；再加入氯仿∶異戊醇混合液，混勻、分層后，離心取上層液，加冷無(wú)水乙醇和乙酸鈉(pH5.2)混勻，冰箱過(guò)夜。次日離心，棄上清，加乙醇洗滌，離心棄上清，自然干燥，干燥管內(nèi)加雙蒸水溶解沉淀DNA，用核酸測(cè)定儀定量DNA，并計(jì)算吸光度A260/A280的比值。
3)PCR方法檢測(cè)P16外顯子2基因表達(dá)。
P16外顯子2基因的引物序列為5`--TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense)，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense)，取樣本DNA，Taq酶，PCR反應(yīng)儀(P.E.-TC1.美國(guó)公司生產(chǎn))進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件94-95℃變性3-5分鐘；按94-95℃45-60秒、55-60℃45-60秒、72℃1分鐘，40-45個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5-10分鐘。同時(shí)用β-actin基因作內(nèi)參照，其引物序列為5``--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(Sense)，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(Antisense)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，圖象分析。
本發(fā)明方法特異性高，能為臨床預(yù)測(cè)和預(yù)后分析提供參考資料，并且操作簡(jiǎn)單，成本低，可在一般實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。
其中，M是100bp DNA Ladder Marker(Promega公司)，4、6、8為P16外顯子2基因缺失肺癌患者血漿標(biāo)本，1-3，5-7為P16外顯子2基因表達(dá)肺癌患者血漿標(biāo)本。
分離純化提取血漿DNA 取出備用血漿，室溫融化，加入等量生理鹽水，分管1ml/每管。分別加入Tris-飽和酚250ul和250ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻至乳白色，置4℃30分鐘待分層后，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，吸取上層液放入新管；再加入Tris-飽和酚250ul和250ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻至乳白色，置4℃30分鐘待分層后，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，吸取上層液放入新管；再加入500ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻至乳白色，置4℃20分鐘待分層后，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，吸取上層液放入新管；每管400ul分別加入1ml冷無(wú)水乙醇和200ul3M乙酸鈉(pH5.2)混勻，置-20℃冰箱過(guò)夜。次日在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，棄去上清液，加入75％乙醇1ml洗滌，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，棄去上清液，用紙吸干管口液體后，在超凈工作臺(tái)上風(fēng)機(jī)自然干燥。干燥的管內(nèi)分別加入雙蒸水溶解沉淀DNA，應(yīng)用eppendrof核酸測(cè)定儀定量DNA，并計(jì)算吸光度A260/A280的比值。
PCR方法檢測(cè)P16外顯子2基因PCR反應(yīng)總體積為25ul，反應(yīng)體系為10×PCR buffer2.5ul，內(nèi)含15mM氯化鎂，dNTPs其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mM，P16外顯子2基因的引物序列為5`--TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense)，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense)，濃度均為50pMol.各取1ul，樣本DNA量為1ug左右，Taq酶2單位，加雙蒸水至25ul。石蠟油20ul封蓋液體。在PCR反應(yīng)儀(P.E.-TC1.美國(guó)公司生產(chǎn))上，94℃變性5分鐘后；按94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。同時(shí)用β-actin基因作內(nèi)參照，其引物序列為5`--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(Sense)，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(Antisense)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.6％瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，以電壓100V，電泳30分鐘。在GIS圖象分析系統(tǒng)上，分析PCR擴(kuò)增條帶，以promega公司生產(chǎn)的PCR標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，P16外顯子2基因?yàn)?00bp，β-actin基因?yàn)?18bp。
本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果表明，在58例肺癌患者血漿中分離純化DNA含量為374.0±307.2ug/ml，濃度范圍36.0～1491.0ug/ml。吸光度A260/A280的比值為0.93±0.11，其比值范圍0.71～1.17。在58例肺癌患者血漿中β-actin基因表達(dá)率為100％(58/58)。P16基因的表達(dá)率為43.1％(25/58)。其中肺腺癌的表達(dá)率為21.7％(5/23)，肺鱗癌為61.5％(16/26)，腺鱗癌混合型為44.4％(4/9)。按分期，其中I期肺癌患者血漿中P16基因的表達(dá)率為30％(6/20)，II期患者的表達(dá)率為54.5％(6/11)，III期的表達(dá)率為47.8％(11/23)，IV期為25％(1/4)。在對(duì)照組10例心臟科患者血漿中β-actin基因表達(dá)率為90％(9/10)。P16基因的表達(dá)率為90％(9/10)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肺癌患者血漿中P16基因的表達(dá)率明顯低于對(duì)照組心臟科患者(P＜0.05)。
結(jié)果證實(shí)本發(fā)明方法可利用腫瘤患者的血漿或血清中分子信息抑癌基因P16外顯子2表達(dá)的變化，判斷腫瘤患者治療效果及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法，其特征是采用PCR方法檢測(cè)血漿DNA中P16基因表達(dá)。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法，其特征是所述的血漿是腫瘤患者血漿。
3.按權(quán)利要求1和2所述的檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法，其特征是通過(guò)下述步驟進(jìn)行，1)取腫瘤患者血漿標(biāo)本肝素抗凝，離心后，血漿保存?zhèn)溆茫?)分離純化提取血漿DNA；3)PCR方法檢測(cè)P16外顯子2基因表達(dá)
4.按權(quán)利要求3所述的檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法，其特征是所述的分離純化提取血漿DNA中，取備用血漿直接加等量生理鹽水，重復(fù)加Tris-飽和酚和氯仿∶異戊醇混合液后，再加氯仿∶異戊醇混合液后，加冷無(wú)水乙醇和乙酸鈉pH5.2。
5.按權(quán)利要求3所述的檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法，其特征是所述的P16外顯子2基因的引物序列為5`--TGGCTCTGACCATTCTGT，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG，內(nèi)參照β-actin基因引物序列為5`--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA。
6.按權(quán)利要求3所述的檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法，其特征是所述的PCR反應(yīng)條件為94-95℃變性3-5分鐘，按94-95℃45-60秒、55-60℃45-60秒、72℃1分鐘，40-45個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5-10分鐘。
7.按權(quán)利要求3所述的檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法，其特征是所述的PCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，按94℃60秒、55℃60秒、72℃1分鐘，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬生物化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)腫瘤患者血漿中分離純化DNA，用PCR方法檢測(cè)其中P16基因表達(dá)的改變。本發(fā)明方法特異性高，可判斷腫瘤患者治療效果及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，能為臨床預(yù)測(cè)和預(yù)后分析提供參考資料，并且操作簡(jiǎn)單，成本低，可在一般實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1439724SQ0311595
公開(kāi)日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2003年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者包國(guó)良, 董強(qiáng)剛 申請(qǐng)人:上海市胸科醫(yī)院