專利名稱：人腫瘤抑制基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人腫瘤抑制基因，該基因的表達(dá)受生長(zhǎng)因子處理所抑制，還涉及組成該基因的DNA以及該DNA編碼的蛋白質(zhì)。
由于重組生長(zhǎng)激素(rhGH)刺激生長(zhǎng)的作用，它在世界上已廣泛用作治療藥物來(lái)治療患GH分泌缺陷、Turner綜合征或慢性腎病的兒童[Neely E.K.和Rosenfeld R.G.，Ann.Rev.Med.，45407-420(1994)]。另外，由于它表現(xiàn)出各種生理效應(yīng)，因此預(yù)計(jì)GH在例如脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)組成代謝、骨質(zhì)疏松和造血以及更廣泛地在衰老上有更廣的藥物用途。
高等動(dòng)物具有大約100000個(gè)基因，其中約15％在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并控制生命活動(dòng)的所有過(guò)程(即發(fā)育、增殖、分化、體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等)。這些基因的表達(dá)對(duì)蛋白合成的調(diào)節(jié)主要是在轉(zhuǎn)錄(mRNA)和翻譯水平上，而且認(rèn)為GH與這些功能緊密相關(guān)。
另一方面，通過(guò)對(duì)腫瘤(由細(xì)胞異常增殖引起)的研究，在70年代提出存在腫瘤基因，然后Hanabusa等人首次鑒定了一種腫瘤基因v-src。后來(lái)，通過(guò)分析遺傳性腫瘤，發(fā)現(xiàn)了各種腫瘤抑制基因，這些基因的抑制是引起腫瘤的原因，而且也已積累了許多證據(jù)表明某些腫瘤的進(jìn)展受到抑制細(xì)胞增殖的腫瘤抑制基因所抑制。
通常測(cè)定腫瘤抑制基因的標(biāo)準(zhǔn)是(1)在腫瘤兩個(gè)等位基因中發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變和缺失，和(2)在遺傳性腫瘤高發(fā)病率的癌家族中，在含有一個(gè)等位基因的生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了突變。腫瘤抑制基因的特征在于其功能的喪失會(huì)導(dǎo)致癌發(fā)生。
已經(jīng)表明，在癌的發(fā)展和進(jìn)展中，涉及到一系列基因突變，包括由于基因缺失或突變引起的腫瘤基因的激活和腫瘤抑制基因的滅活[Schmandt，R.等人，Clin.Chem.，392375-2385(1993)]。通過(guò)腫瘤抑制基因的鑒定以及表明許多腫瘤細(xì)胞中缺少正常等位基因的證據(jù)積累，腫瘤抑制基因在生理上的重要性已經(jīng)得到認(rèn)同[Knudson，A.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.9010914-10921(1993)]。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10個(gè)以上的主要腫瘤抑制基因，它們包括RB1基因(其突變導(dǎo)致成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤[Friend，S.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 849059-9063(1987)])、p53基因(導(dǎo)致結(jié)腸癌[Lane，D.P.等人，Nature，278261-263(1979)])和WTI基因(導(dǎo)致Wilms腫瘤[Call，K.M.等人，Cell，60509-520(1990)])。
最近，進(jìn)行了許多研究來(lái)弄清某些類型腫瘤與染色體13q缺失之間的關(guān)系。借助于不同的多態(tài)性DNA標(biāo)記，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)已經(jīng)能檢測(cè)染色體特定區(qū)域中等位基因的缺失(例如雜合性的喪失(LOH))。
在前列腺、卵巢、子宮頸、結(jié)腸、輸尿管和乳腺腫瘤中觀察到染色體13q12上缺失了等位基因[Gudmundsson，J.等人，Cancer Res.，554830-4832(1995)]。例如，兩種癌敏感型基因(染色體17q21上的BRCA1和染色體13q12上的BRCA2)被認(rèn)為是導(dǎo)致具有多起女性早發(fā)性乳房癌病例的美國(guó)家庭中約80％乳房癌病例的原因[Gayther，S.A.等人，Mol.Med.-Today，3168-174(1997)]。然而，該數(shù)字只是針對(duì)美國(guó)人群獲得的，預(yù)計(jì)其它國(guó)家將有所不同。例如，在芬蘭乳房癌家庭中，由BRCA1和BRCA2基因突變引起的總共只占21％[Verhmanen，P.等人，Hum.Mol.Genet.，62309-2315(1997)]。這些數(shù)據(jù)表明其它一些乳房和乳房-卵巢癌易感基因可能是重要的，預(yù)計(jì)它們中的一些在染色體13q12-13q13上[Van Den Berg J.，等人，Br.J.Cancer，741615-1619(1996)]。
在許多類型的人肺癌中發(fā)現(xiàn)染色體13(包括染色體13q12)缺失，這些肺癌例如是小細(xì)胞癌[Yokota，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，849252-9256(1987)]、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌[Weston，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865099-5103(1989)]。然而，由于染色體13的延伸區(qū)丟失，不可能對(duì)出問(wèn)題的基因座精確定點(diǎn)。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌獲得了準(zhǔn)確得多的數(shù)據(jù)表明特異性地喪失13q12[Virmani，A.K.等人，Gene Chromosome Cancer，21308-319(1998)]。另外，預(yù)計(jì)該區(qū)域中還存在著一些未知的腫瘤抑制基因[Tamura，K.等人，Int.J.Cancer，7445-49(1997)]。
在67％的肝細(xì)胞癌中(不論乙型肝炎病毒是陽(yáng)性還是陰性)[Jacob，A.N.等人，Oncogene，13213-221(1996)，Walker，G.J.等人，Cancer Res.，514367-4370(1991)]，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中(據(jù)信是由于其它還未鑒定的位于染色體13q、特別是13q12上的腫瘤抑制基因的缺失引起的)[Kirkpatrick，H.等人，Oncogene，142189-2193(1997)]，在胰癌[Schutte，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925950-5954(1995)]和腺癌[Jacob，A.N.等人，Oncogene，13213-221(1996)]中，在垂體腺瘤中(反映具有預(yù)后標(biāo)記的潛在價(jià)值的侵蝕型生物活性)[Pearce，S.H.等人，Clin.Endocrinol.(Oxf.)，45195-200(1996)，Bates，A.S.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，82818-824(1997)]，在甲狀旁腺腺瘤中[Pearce，S.H.等人，Clin.Endocrinol.(Oxf.)，45195-200(1996)，Yoshimoto，K.等人，Clin.Endocrinol.(Oxf.)，4867-72(1998)]，在脂肪瘤中[Mandahl，N.等人，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，120707-711(1994)，Sreekantaiah，C.等人，Cancer Genet.Gytogenet.，39281-288(1989)]，均發(fā)現(xiàn)染色體13Q12基因座明顯缺失。
對(duì)于下述某些血癌獲得了與染色體13q12喪失相關(guān)的進(jìn)一步的資料多發(fā)性骨髓瘤和漿細(xì)胞性白血病[Avet-Loiseau，H.等人，Genes Chromosomes Cancer，19124-133(1997)]、骨髓增生性腫瘤[Still，I.H.等人，Ann.Hum.-Genet.，61(Pt1)15-24(1997)]和與T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤以及外周血液嗜酸細(xì)胞增多癥相關(guān)的非特異性骨髓增生性疾病[Still，I.H.等人，Blood，903136-3141(1997)]、慢性成淋巴細(xì)胞白血病[Garcia-Marco，J.A.等人，Cancer Genet.Cytogenet.，9452-58(1997)，Garcia-Marco，J.A.等人，Blood，881568-1575(1996)，Catovsky，D.，Hematol.Cell Ther.，39 Suppl.1S5-S11(1997)，Garcia-Marco，J.A.等人，Br.J.Haematol.，99708-709(1997)]。這些文獻(xiàn)中有一些預(yù)示了新的腫瘤抑制基因位于染色體13q12上[Garcia-Marco，J.A.等人，Cancer Genet.Cytogenet.，9452-58(1997)，Garcia-Marco，J.A.等人，Blood，881568-1575(1996)，Catovsky，D.，Hematol.Cell Ther.，39 Suppl.1S5-S11(1997)]。
預(yù)計(jì)這些腫瘤抑制基因在生物種屬中是保守的，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，腫瘤抑制基因的許多產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起作用。因此，已經(jīng)揭示腫瘤抑制基因產(chǎn)物與細(xì)胞粘附蛋白、信號(hào)引導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子或凋亡調(diào)節(jié)分子有關(guān)。
另一方面，最近的基因分析表明，約80％的人基因與黑尾果蠅(Drosophilamelanogaster)同源，預(yù)計(jì)果蠅是在分子水平研究人腫瘤發(fā)展的很好的模型[Cookson，C.，F(xiàn)inancial Times，1997年6月14日]。包含果蠅基因組的基因數(shù)約為10,000。盡管該數(shù)目低于人所含基因組的基因數(shù)(即約100000)，但是認(rèn)為人基因與昆蟲(chóng)基因是相似的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)人基因是多樣的衍生的基因。許多蛋白及其結(jié)構(gòu)域和整個(gè)復(fù)合物以及各種代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在人和果蠅之間是保守的[Artavanis-Tsakonas S.等人，Science，268225-232(1995)]。
另外，已發(fā)現(xiàn)黑尾果蠅產(chǎn)生的腫瘤具有人腫瘤的共同特征，且黑尾果蠅的腫瘤基因和腫瘤抑制基因與人的腫瘤基因和腫瘤抑制基因同源[Miklos，G.L.G.和Rubin，G.M.，Cell，86521-529(1996)]。因此，采用黑尾果蠅基因數(shù)據(jù)的方法提供了搜尋新基因的強(qiáng)大工具[Tian Xu，等人，Developments，1211053-1063(1995)]。
在上述背景下，本發(fā)明的目的是提供一種新的共基因表達(dá)受人生長(zhǎng)激素等抑制的人腫瘤抑制基因，組成該基因的DNA以及由該基因編碼的蛋白。
如下文所要描述的，在采用家兔軟骨細(xì)胞的研究中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)某些基因的表達(dá)受到生長(zhǎng)因子(如生長(zhǎng)激素GH)的抑制，并在分離后檢查和鑒定了該基因。結(jié)果是，本發(fā)明者得出結(jié)論，該基因可能是一種新的腫瘤抑制基因，因此是到了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了具有序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA。
另外，本發(fā)明提供了構(gòu)成一種人基因的DNA，該基因的表達(dá)受到生長(zhǎng)因子的抑制，該DNA具有序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示核苷酸序列或是相對(duì)于此二者任一所述核苷酸序列有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、替代或增加的核苷酸序列。
另外，本發(fā)明提供了構(gòu)成所述人基因的DNA，其中生長(zhǎng)因子是人生長(zhǎng)激素或胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。
另外，本發(fā)明提供了構(gòu)成一種人基因的DNA，該人基因編碼腫瘤抑制蛋白，具有序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示核苷酸序列或是相對(duì)于此二者任一所述核苷酸序列有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、替代或增加的核苷酸序列。
另外，本發(fā)明提供了具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明提供了其表達(dá)受生長(zhǎng)因子抑制的蛋白，該蛋白具有序列表中SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示氨基酸序列或是相對(duì)于此二者任一所述氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列。
另外，本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)，其中生長(zhǎng)因子是人生長(zhǎng)激素或胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。
另外，本發(fā)明提供了一種腫瘤抑制蛋白，該蛋白具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示氨基酸序列或是相對(duì)于此二者任一所述氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)缺失、替代或增加的氨基酸序列。
另外，本發(fā)明提供了一種DNA，該DNA包含編碼具有前述氨基酸序列的一種蛋白的核苷酸序列。
另外，本發(fā)明提供了一種探針，該探針包含與組成前述核苷酸序列之一的DNA雜交的DNA。
另外，本發(fā)明提供了一種重組載體，該載體包括組成前述一種核苷酸序列的DNA。
另外，本發(fā)明提供了一種DNA片段，該片段用作引物，并由前述一種核苷酸序列的部分序列組成。
另外，本發(fā)明提供了一種人用診斷性藥物制劑，該制劑包含前述探針。診斷性藥物制劑可用于侏儒癥、巨人癥、肢端肥大癥、血管病、糖尿病性腎病、或心臟病或惡性腫瘤(包括白血病)，以檢查受到生長(zhǎng)因子抑制的腫瘤抑制基因的表達(dá)。
另外，本發(fā)明提供了含有前述蛋白之一的抗腫瘤藥物制劑。
另外，本發(fā)明提供了針對(duì)前述蛋白之一的多克隆或單克隆抗體。
另外，本發(fā)明提供了含有前述一種抗體的診斷性藥物制劑來(lái)檢查腫瘤抑制基因的表達(dá)。
因此，構(gòu)成本發(fā)明基因的DNA、它們的轉(zhuǎn)錄物mRNA及其翻譯的蛋白可用作心臟病、血管病、糖尿病性腎病和惡性腫瘤(如乳房癌、腎腺癌、結(jié)腸直腸癌和白血病)的治療、診斷和預(yù)防藥物，這些疾病在諸如巨人癥/肢端肥大癥中因生長(zhǎng)激素分泌過(guò)多或侏儒癥中給予過(guò)多生長(zhǎng)激素的情況下由水平升高的生長(zhǎng)激素或IGF-1所誘生。
對(duì)84個(gè)散發(fā)性、家族性和遺傳性乳房癌原發(fā)性腫瘤樣品中的LOH進(jìn)行了分析。結(jié)果，在34％的腫瘤樣品中發(fā)現(xiàn)LOH在BRCA2(乳房癌易感基因)區(qū)域內(nèi)，在27％的樣品中發(fā)現(xiàn)LOH在RB1區(qū)域內(nèi)。然而發(fā)現(xiàn)只有7％的腫瘤LOH選擇性地位于BRAC2中LOH選擇性位于RB1內(nèi)也只有7％。
另外，證實(shí)了一些腫瘤有限制性缺失圖形，這提示在BRCA2的鄰近和遠(yuǎn)端都有額外的腫瘤抑制基因。還提示了BRCA2內(nèi)的LOH和早期復(fù)發(fā)與死亡之間有著非常顯著的且獨(dú)立的關(guān)系。結(jié)果表明，13q12-13q13區(qū)域內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因的滅活，賦予了腫瘤生長(zhǎng)的強(qiáng)烈潛在可能，并導(dǎo)致家族性和散發(fā)性乳房癌的不良預(yù)后。
利用mRNA差別性顯示和PCR選擇cDNA扣除法，本發(fā)明者主要試圖檢測(cè)受生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)的基因，從而證明家兔軟骨細(xì)胞中存在受生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)的基因。因此，利用mRNA差別性顯示，發(fā)現(xiàn)電泳條帶N119受到生長(zhǎng)激素處理的抑制。切下該條帶，抽提其中所含DNA，克隆并測(cè)序。發(fā)現(xiàn)該DNA片段只有219堿基長(zhǎng)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其與已知基因或EST(表達(dá)的序列標(biāo)記)有有意義的同源性。對(duì)應(yīng)于條帶N119的DNA與對(duì)應(yīng)于條帶N62、71、111和112的DNA同源。因此，將這5條條帶的DNA歸為一個(gè)同源簇HCD10，而感興趣的家兔基因命名為HCD10(119)。除了發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素的抑制作用外，還發(fā)現(xiàn)HCD10(119)基因的轉(zhuǎn)錄由伴刀豆球蛋白A激活。
用5′-RACE(5′-cDNA末端的快速擴(kuò)增)方法克隆編碼HCD10(119)蛋白的基因的一部分。對(duì)該基因的2.5kb片段作DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其與黑尾果蠅warts腫瘤抑制基因同源。
另外，在本研究中，在用家兔軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，某些基因的表達(dá)受生長(zhǎng)激素(GH)抑制。根據(jù)這些資料，本發(fā)明者預(yù)計(jì)存在一種表達(dá)受GH抑制的腫瘤抑制基因(GHTSG受生長(zhǎng)激素抑制的腫瘤抑制基因)，并繼續(xù)進(jìn)行了調(diào)查。
然后，在采用2.5kb家兔HCD10(119)基因片段的DNA序列作BLAST搜尋中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一些人EST，并用DNASIS(Hitachi Software Engineering Co.Ltd.)將它們編譯成人類似物的推測(cè)性1.65kb區(qū)域(hGHITS人生長(zhǎng)激素抑制的腫瘤抑制基因)。不幸的是，用該方法不能獲得可靠的基因序列。因?yàn)镋ST基本上是不準(zhǔn)確的[Sudo，K.等人，Genomics，24276-279(1994)，F(xiàn)rigeno，J.-M.，Hum.Mol.Genet.4(1)37-43(1995)，Lanfranchi，G.等人，Genome Research，635-42(1996)]。然后，償試了用一組引物測(cè)序。
用OLIGO(一種分析引物的軟件購(gòu)自National Bioscience，Inc.)設(shè)計(jì)覆蓋1.65kb人DNA片段的5個(gè)正向引物和5個(gè)反向引物，在PCR中用通用cDNA文庫(kù)作為模板，采用下列7組引物1)H119U142+H119L739，2)H119U142+H119L1048，3)H119U142+H119L1499，4)H119U736+H119L1048，5)H119U736+H119L1499，6)H119U782+H119L1048，和7)H119U782+H119L1499。
最后，選擇引物組1)和7)，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生了在表觀上大小合適最適于用作雜交探針的DNA條帶。
用組1和組7為引物，一組14個(gè)分離的cDNA文庫(kù)作為模板，反復(fù)進(jìn)行PCR。根據(jù)所得結(jié)果，選擇了人肺cDNA文庫(kù)(λgt10)，因?yàn)橛萌魏我粚?duì)引物對(duì)其擴(kuò)增均產(chǎn)生了強(qiáng)的DNA條帶。
將如此獲得的DNA條帶克隆到質(zhì)粒載體(pMOSBlueAmersham)中，由于DNA測(cè)序確認(rèn)了它們的真實(shí)性，因此用下述方法產(chǎn)生特異性雜交探針使攜帶各自質(zhì)粒的大腸桿菌菌株生長(zhǎng)，純化質(zhì)粒DNA，用EcoRI和SalI限制性酶對(duì)它們進(jìn)行消化，電泳分離DNA片段，純化DNA插入物。
回收攜帶hGHITS基因不同區(qū)域的17個(gè)噬菌體克隆。純化它們的DNA，重新克隆到質(zhì)粒載體(pUC18Pharmacia)中并測(cè)序。重新構(gòu)建4892堿基的核苷酸序列，但是缺少全長(zhǎng)基因的5′和3′端。
用OLIGO設(shè)計(jì)該核苷酸序列兩個(gè)末端的引物對(duì)引物對(duì)H3111U13和H311L320用于5′區(qū)，引物對(duì)H316U39和H319L498用于基因的3′區(qū)。用這些引物擴(kuò)增克隆的噬菌體DNA片段產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳分離。然后不進(jìn)行克隆將它們直接用作探針。回收獲得13個(gè)與5′探針雜交的噬菌體克隆和12個(gè)與3′探針雜交的噬菌體克隆，并進(jìn)行分析。
分析這些噬菌體克隆表明，存在兩個(gè)可能有功能的等位基因。裝配成全長(zhǎng)5486堿基的核苷酸序列hGHITS1(序列表中SEQ ID NO1)和hGHITS2(SEQ ID NO2)。推導(dǎo)出分別對(duì)應(yīng)于hGHITS1和hGHITS2編碼區(qū)的1088氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。在這些核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)三處不同hGHITS1等位基因在核苷酸第467位攜帶＂g＂(因而氨基酸27是Lys)，在1357位攜帶＂c＂(因而氨基酸324是Ala)，在1473位是＂g＂(因此，氨基酸363是Gly)，而hGHITS2等位基因在核苷酸第467位攜帶＂a＂(氨基酸沒(méi)有改變)，在1357位攜帶＂t＂(因而氨基酸324是Val)，在1473位是＂a＂(氨基酸363是Ser)。這些序列之間的三處不同屬于正常/突變類型目前還未確定。
根據(jù)PSORT分析，最有可能的是該蛋白是一種酶并位于細(xì)胞核內(nèi)，氨基酸60和61之間可能有斷裂位點(diǎn)。
用BLASTP搜尋法，將hGHITS蛋白的氨基酸序列與已知的多肽序列相比較。果蠅腫瘤抑制基因warts[Justice R.W.等人，Genes & Dev.，9534-546(1995)](也稱為基因＂lats＂Xu，T.等人，Development，1211053-1063(1995))顯示出與hGHITS基因的同源性最高。用＂GeneStream align＂將hGHITS和warts基因作序列對(duì)比，結(jié)果清晰地表明在該酶的C端有顯著的同源性。MOTIF(基序)搜尋揭示有8個(gè)基序位于與果蠅warts基因(也是一種蛋白激酶)高度同源的區(qū)域內(nèi)，包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)特征和蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)域特征(signature)。
眾所周知的是，與家族其它成員差異有限的蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域預(yù)計(jì)在細(xì)胞生理學(xué)中起類似的作用[Hanks，S.K.等人，Science 24142-52(1988)]。另一方面，已經(jīng)分離出黑尾果蠅腫瘤抑制基因的人同源物，并表明其在功能上是保守的[Maie，A.R.St.J.％Xu.T.，Am.J.Hum.Genet.，611006-1010(1997)]。黑尾果蠅腫瘤抑制基因warts是細(xì)胞正常生長(zhǎng)以及維持其正常形態(tài)所必需的。該基因被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)它的喪失會(huì)導(dǎo)致異常增殖，它類似于人肌肉營(yíng)養(yǎng)不良激酶。這些事實(shí)強(qiáng)有力地支持這樣一個(gè)觀點(diǎn)，即hGHITS是一種腫瘤抑制基因。
hGHITS表現(xiàn)出與稱為DRES7的1053bp長(zhǎng)的EST的同源性最高。DRES7位于13q12基因座[GenBank Accession U69566]。然而，在染色體該區(qū)域中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)另外兩個(gè)腫瘤抑制基因乳房癌易感(BRCA2)基因位于染色體13q12[Wooster，R.等人，Science，2652088-2099(1994)]，和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB1)基因位于13q14[Walbaum，R.等人，Hum.Genet.，44219-226(1978)]。
根據(jù)本發(fā)明者的實(shí)驗(yàn)，家兔HCD10(119)受到人生長(zhǎng)激素抑制，揭示受hGHITS基因影響的癌類型的另一種方法是觀察生長(zhǎng)激素或胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)量的升高與各自癌發(fā)展之間的關(guān)系。
例如，已經(jīng)在幾類不同的腫瘤中發(fā)現(xiàn)IGF-1的受體，這些腫瘤包括前列腺癌[Lamharzi，N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，958864-8868(1998)]、胰癌[Bergmann，U.，等人，Cancer Res.，552007-2011(1995)]、骨和軟組織肉瘤[Sekyi-Otu，A.等人，CancerRes.，55129-134(1995)]、Wilm′s腫瘤、小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤和成淋巴細(xì)胞白血病[Daughaday，W.H.，Endocrinology，1271-4(1990)]。已知一些腫瘤受生長(zhǎng)激素或IGF-1所激活。例如，已知急性白血病受人生長(zhǎng)激素激活上調(diào)了其受體[Giesbert，S.等人，Ann.Hematol.，74253-257(1997)]。
從上文可以預(yù)計(jì)，用生長(zhǎng)因子對(duì)抗劑會(huì)導(dǎo)致一些腫瘤被抑制人骨肉瘤生長(zhǎng)可用生長(zhǎng)抑素類似物抑制[Pinski，J.等人，Int.J.Cancer，65870-874(1996)]。生長(zhǎng)激素釋放激素對(duì)抗劑抑制人腎腺癌增殖[Jungwirth，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，945810-5813(1997)]。
發(fā)現(xiàn)患者的身高和一些腫瘤的發(fā)病存在正相關(guān)性。例如，研究表明，成髓細(xì)胞瘤可能受生長(zhǎng)激素產(chǎn)生的影響[Robertson，S.C.等人，Neurosurgery，41561-565(1997)]。然而，在乳房癌中有未解決的矛盾。一些研究者相信，IGF-1是一種強(qiáng)效的乳房促分裂原[Yang，X.F.等人，Cancer Res.，561509-1511(1996)]。它們使生長(zhǎng)激素參與人乳房生長(zhǎng)，并表明在一些經(jīng)生長(zhǎng)激素治療的兒童中產(chǎn)生男乳房女性化，且高身材和肢端肥大癥與乳房癌發(fā)病率的增加有關(guān)[Ng，S.T.等人，Nat.Med.，31141-1144(1997)]。然而，其它研究者相信，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)女性達(dá)到其最高高度(并不是總計(jì)到達(dá)的高度)時(shí)的年齡是乳房癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素[Li，C.I.等人，Epidemiology，8559-565(1997)]。據(jù)稱，相對(duì)于到達(dá)最終高度的年齡的增長(zhǎng)，乳房癌有危險(xiǎn)有下降的傾向。
肢端肥大癥患者中的發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)于高水平生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)疾病的其它信息。肢端肥大癥患者體內(nèi)生長(zhǎng)激素的水平的增加導(dǎo)致發(fā)生結(jié)腸腺癌[Vasen，H.F.等人，Eur.J.Endocrinol.，131(3)235-237(1994)]、結(jié)直腸癌[Jenkins.PJ等人，Clin Endocrinol oxf47(1)17-22(1997)]、心血管疾病[Lombardi，G.等人，J.Pediatr.Endocrinol.Metab.，10553-560(1997)]以及所有惡性疾病[Orme，S.M.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，832730-2734(1998)]的風(fēng)險(xiǎn)增加。
在用辛利肽(octreotide)(生長(zhǎng)抑素的類似物)治療時(shí)，腫瘤細(xì)胞增殖活性減少、心臟功能改善以及血清IGF-1水平同時(shí)降低，此結(jié)果確認(rèn)了生長(zhǎng)激素是上述疾病的一個(gè)原因[Cascinu，S.等人，Gastroenterology，113767-772(1997)，Lombardi，G.等人，Horm.Res.，48 Supple.438-42(1997)]。在心血管疾病例中，病根似乎并不只是心室質(zhì)量的增長(zhǎng)，因?yàn)樗c其它體內(nèi)器官的大小的增加不相稱，據(jù)報(bào)道肢端肥大癥心肌病的嚴(yán)重性與“疾病持續(xù)時(shí)間”的關(guān)系比與循環(huán)性生長(zhǎng)激素和/或IGF-1水平的關(guān)系更密切[Lombardi，G.等人，J.Endocrinol.，155 Supple.1S33-S37(1997)]。這使我們猜測(cè)是基因受某閾值水平生長(zhǎng)激素所抑制導(dǎo)致了心血管疾病的發(fā)作。
另外，以結(jié)腸作為主要的靶，用等量的抽提自不同正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的mRNA以及hGHITS特異性探針進(jìn)行Northern雜交。與正常結(jié)腸組織(結(jié)果未顯示)相比，結(jié)腸腺癌SW480中觀察到的hGHITS轉(zhuǎn)錄至少增加10倍。在8個(gè)受測(cè)試的癌細(xì)胞培養(yǎng)中，該表達(dá)水平顯然是最高的。這表明結(jié)腸腺癌中的某些顯著突變產(chǎn)生了該基因的無(wú)功能性同系物。
盡管預(yù)計(jì)功能性hGHITS轉(zhuǎn)錄的增加會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng)，但是絕對(duì)沒(méi)有預(yù)計(jì)到結(jié)果是Burkitt′s淋巴瘤Raji的細(xì)胞培養(yǎng)缺少了可見(jiàn)的hGHITS mRNA表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果提示hGHITS基因的缺陷可能導(dǎo)致Burkitt′s淋巴瘤發(fā)展和增殖。
上述發(fā)現(xiàn)總地表明，本發(fā)明的DNA、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及翻譯蛋白可能可用作治療藥物，通過(guò)將組成本發(fā)明的基因的DNA導(dǎo)入患者體內(nèi)或?qū)RNA或蛋白施加到受影響的部位來(lái)治療心臟病、血管疾病、糖尿病性腎病和惡性腫瘤如乳房癌、結(jié)腸直腸癌和白血病(當(dāng)在巨人癥/肢端肥大癥中或侏儒癥中過(guò)多分泌或給予生長(zhǎng)激素的情況下由升高水平的生長(zhǎng)激素或IGF-1所誘導(dǎo))。另外，本發(fā)明還表明，誘導(dǎo)或促進(jìn)本發(fā)明基因表達(dá)的某些物質(zhì)(例如刺激本發(fā)明基因轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)如伴刀豆球蛋白A)可能用作治療藥物來(lái)治療上述疾病。
另外，利用hGHITS基因表達(dá)和癌發(fā)展之間的關(guān)系，包含hGHITS基因部分(或全部)DNA的DNA，能提供以hGHITS基因表達(dá)狀況為基礎(chǔ)的癌癥診斷手段，以及在癌癥患者體內(nèi)預(yù)后的手段(例如通過(guò)提供針對(duì)hGHITS基因轉(zhuǎn)錄物的探針或PCR引物)。
根據(jù)病因?qū)W研究，在持續(xù)經(jīng)受過(guò)量生長(zhǎng)激素水平的巨人癥或肢端肥大癥患者體內(nèi)，這些疾病的發(fā)病率(如腫瘤發(fā)展和血管疾病)更高。這表明，這些疾病(即腫瘤發(fā)展和血管疾病)可能是由于本發(fā)明的腫瘤抑制基因受到血液中持續(xù)存在的過(guò)量生長(zhǎng)激素抑制而引起的。另外，生長(zhǎng)激素的生理性分泌以脈沖方式產(chǎn)生。因此，預(yù)計(jì)生長(zhǎng)激素水平高于臨界值的“時(shí)間”內(nèi)負(fù)責(zé)抑制本發(fā)明基因的表達(dá)。這還表明，在生長(zhǎng)激素治療中，出于安全性考慮，以脈沖方式給藥的方法(而非連續(xù)給藥的方法)才是較佳的，這符合自然的生理循環(huán)。通常，在選擇藥物和確定治療患者的劑量時(shí)，還需要參考個(gè)別患者的遺傳資料。
因此，在用生長(zhǎng)激素治療兒童侏儒癥時(shí)，可用根據(jù)本發(fā)明基因及其類似物設(shè)計(jì)的探針和引物作為診斷性藥物來(lái)測(cè)定本發(fā)明的腫瘤抑制基因的表達(dá)水平，然后用所得結(jié)果評(píng)價(jià)患者對(duì)治療的適應(yīng)性并確定合適的治療時(shí)間和劑量，從而減少腫瘤發(fā)展的危險(xiǎn)。
盡管需要大規(guī)模的研究來(lái)獲得最終結(jié)論，但是可以合理地預(yù)計(jì)，在人群中，低的hGHITS基因表達(dá)水平或其非功能性等位基因的表達(dá)與日后癌癥發(fā)展的危險(xiǎn)之間有正相關(guān)性。因此，通過(guò)用根據(jù)本發(fā)明基因獲得的探針和引物檢測(cè)個(gè)體的hGHITS基因表達(dá)，就可能初步診斷個(gè)體內(nèi)日后腫瘤發(fā)展的可能性。另外，除了這種監(jiān)測(cè)外，從那些能促進(jìn)或誘導(dǎo)hGHITS基因表達(dá)的物質(zhì)中還可選出合適的物質(zhì)(如伴刀豆球蛋白A)來(lái)預(yù)防腫瘤發(fā)展。
本發(fā)明的DNA不僅包括具有序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2具體指出的核苷酸序列的DNA，而且還包括構(gòu)成基因的性質(zhì)基本相同、相對(duì)于此二者任一核苷酸序列之一有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代或添加的DNA。術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)堿基”通常包括高達(dá)10個(gè)堿基，通常為幾個(gè)(例如3個(gè)或4個(gè))堿基。本發(fā)明的蛋白不僅包括具有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4具體指出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，而且還包括具有基本相同性質(zhì)的、相對(duì)于此二者任一氨基酸序列具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代或添加的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”通常包括高達(dá)10個(gè)氨基酸，通常為幾個(gè)(例如3個(gè)或4個(gè))氨基酸。另外，本發(fā)明還包括編碼這些蛋白的DNA序列。這類各種核苷酸序列易用眾所周知的密碼子簡(jiǎn)并知識(shí)制得。
利用重組DNA技術(shù)易獲得各種突變體。首先，可以通過(guò)不同的嵌合和/或酶促過(guò)程將突變導(dǎo)入DNA克隆片段中，然后對(duì)這樣獲得的突變型DNA測(cè)序，以選擇具有預(yù)期優(yōu)點(diǎn)的特定突變體。該方法允許系統(tǒng)性地制備不同的突變體而不論它們的表型如何。制備突變型DNA克隆的常用方法如下1.利用一個(gè)寡核苷酸在給定的DNA序列中直接進(jìn)行取代、缺失、插入或增加。該方法能在小的DNA區(qū)域中導(dǎo)入多個(gè)突變。
2.利用較長(zhǎng)的寡核苷酸可以合成所需的基因。
3.利用利用區(qū)域特異性誘變技術(shù)，可將一個(gè)所需的突變導(dǎo)入大的(1-3kb)DNA區(qū)域中。
4.DNA接頭區(qū)掃描性誘變是一種適用于將一串點(diǎn)突變導(dǎo)入相對(duì)較小的(4-10bp)DNA區(qū)域中的方法。
5.PCR也可用作直接導(dǎo)入突變的方法。從上述方法獲得了制備能表達(dá)包括不同突變的所需基因的質(zhì)粒和載體的方法。即，利用限制性酶和連接酶的組合將攜帶所需基因的DNA插入表達(dá)載體的DNA中，很容易構(gòu)建攜帶所需基因的重組質(zhì)粒。然后將這樣獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入不同的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，進(jìn)而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。可采用的細(xì)胞范圍從原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)到酵母、昆蟲(chóng)、動(dòng)植物細(xì)胞。。
用氯化鈣方法或電穿孔可將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。氯化鈣方法能有效地轉(zhuǎn)化并且不需要特殊裝置。為了獲得更高的效率，建議采用電穿孔。常用于動(dòng)物細(xì)胞系的已知的轉(zhuǎn)染方式有兩種，即瞬時(shí)和永久。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞1-4天以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，然后收獲細(xì)胞并分析它們的DNA。另外，在許多研究中，產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，其中轉(zhuǎn)染的基因被摻入染色體中。轉(zhuǎn)染方法的例子包括磷酸鈣法、電穿孔和脂質(zhì)體融合方法。用本領(lǐng)域熟知的方法很容易制得針對(duì)本發(fā)明的腫瘤抑制基因編碼的蛋白(多肽)或其片段和類似物的多克隆和單克隆抗體。一旦純化，這些抗體可用作與本發(fā)明腫瘤抑制基因有關(guān)的疾病的實(shí)驗(yàn)室試劑和診斷性試劑。所得抗體可用于制備抗體柱、免疫沉淀和用Western印跡鑒定抗原。
以毫克規(guī)模制備針對(duì)本發(fā)明腫瘤抑制基因所編碼蛋白的單克隆抗體的通用方法如下用抗原蛋白接種小鼠進(jìn)行免疫，從表現(xiàn)出足夠抗體滴度的小鼠體內(nèi)取出脾臟。分離脾細(xì)胞，使所選B細(xì)胞與B細(xì)胞來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞融合形成分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。用親和層析柱、離子交換或凝膠過(guò)濾等方法從培養(yǎng)基中純化獲得雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。本發(fā)明的多克隆抗體也可用常規(guī)方法制得用家兔、馬、小鼠和豚鼠作為受免疫動(dòng)物，用本領(lǐng)域已知的免疫動(dòng)物的一種方案接種抗原蛋白，然后從收集的血清中分離IgG等。本發(fā)明將參照下列實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述。然而，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例。
<引物的制備>
用DNASIS軟件和OLIGO軟件設(shè)計(jì)hGHITS的特異性引物。M13通用測(cè)序引物(USP)(gtaaaa cgacg gccagtSEQ ID NO5)和M13反向測(cè)序引物(cagga aacag ctatgacSEQ ID NO8)用于對(duì)pUC18載體中的插入物測(cè)序，下列hGHITS特異性引物購(gòu)自Nisshinbo Tokyo Research CentreH119U89(tccaaa tattacca gaaag ggagccaSEQ ID NO7)、H119U142(gacct ctggga tgatgtgtSEQ ID NO8)、H119U219(agagg tcttgg gcaca tttca ctggtSEQ ID NO9)、H119U736(cctgag cacgca ttttacgSEQ ID NO10)、H119U782(acaatg gctacc cctttcgSEQ ID NO11)、H119L739(ttcgta aaatgc gtgctcSEQ ID NO12)、H119L1048(cctgttt gggtttt cttggtSEQ ID NO13)、H119L1493(tcatca ccttgc tcacac ttccc tattaSEQ ID NO14)、H119L1499(catcac cttgctc acacttccSEQ ID NO15)、H119L1515(gtcgg aaatca cagccac atcatcaSEQ ID NO16)、H311U13(ttcgttt gcgtc ctaccacSEQ ID NO17)、H311L320(gcggc gtcttg ctctgSEQ ID NO18)、H316U39(ctgctct ggtctca atttaagSEQ ID NO19)、H316L498(caagtc tgctgt gcctgtcSEQ ID NO20)。
用DNA合成儀391型PCR-mate EpTM(Applied Biosystems，USA)合成正向T7啟動(dòng)子引物(ctaat acgact cactat agggaSEQ ID NO21)和反向U-20聚體引物(ggtttt cccagtcacga cgtSEQ ID NO22)，來(lái)對(duì)克隆pMOSBlue T-載體中的插入物測(cè)序。
<搜尋合適的人cDNA文庫(kù)>
在搜尋具有hGHITS基因最佳代表性的文庫(kù)時(shí)，采用了含有等份的14個(gè)分開(kāi)的cDNA文庫(kù)和一等份組合文庫(kù)(Universal cDNA Library)的快速篩選人cDNA文庫(kù)組(QUICK-Screen Human cDNA Library Panel(Clontech))。
在帶帽MicroAmp反應(yīng)管(Perkin Elmer)中制備反應(yīng)混合物各10微升6.4微升H2O、1微升10×擴(kuò)增緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.01％w/v明膠)、0.2微升dNTP混合物(各2.5mM)、1微升正向引物(2μM)、1微升反向引物(2μM)、0.2微升熱處理過(guò)的cDNA文庫(kù)等份、和0.2微升聚合酶混合物
。用移液管上下吸取混合物以充分混合。按照下列擴(kuò)增循環(huán)在GeneAmp PCR系統(tǒng)9600型熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)上進(jìn)行PCR[重復(fù)40輪]10秒96℃(變性)1分鐘56℃(退火)1分鐘72℃(延伸)[最后步驟]4℃(放置)用微波爐將1％瓊脂糖GP-36(Nacalai Tesque)融化在含有0.5微克/毫升溴化乙啶的0.5×TBE緩沖液(45mM Tris，45mM硼酸、1mM EDTA、pH8.3)中，將溶液倒入110×60×7.5mm Mupid-2 Mini-Gel電泳系統(tǒng)模具(Advance)中，使其在室溫下固化至少30分鐘并插入梳子，制備分離膠。
使每個(gè)PCR反應(yīng)混合物與2微升10×加樣緩沖液(50％甘油、0.01％溴酚藍(lán))混合并加樣到凝膠上。用Mupid-2 Mini-Gel電泳系統(tǒng)以100V進(jìn)行凝膠電泳30分鐘，緩沖室中含有0.5×TBE緩沖液。
在用透射儀透射凝膠時(shí)拍攝照片。從凝膠上切下合適的PCR片段。
<PCR片段的純化>
用QIAEX II凝膠抽提試劑盒(QIAGEN)純化DNA片段。對(duì)于100bp-4kbp的DNA片段來(lái)說(shuō)，1體積的凝膠中加入3體積的QX1緩沖液。振蕩30秒重懸QIAEX II，在每份樣品中加入10微升樹(shù)脂。在Thermo Alumi Bath ALB-120(Iwaki)中50℃培育混合物12分鐘。每隔2分鐘稍稍振蕩樣品。18000×g(15000rpm，在TOMY MRX-150型高速微量冷凍離心機(jī)上)離心試管1分鐘，棄去上清。在每份含沉淀的DNA中加入500微升QX1緩沖液，稍稍振蕩、18000×g離心1分鐘，完全除去上清。在每份含沉淀的DNA中加入500微升PE緩沖液，稍稍振蕩、18000×g離心1分鐘，完全除去上清。再一次重復(fù)該洗滌步驟。空氣干燥沉淀25-30分鐘直至它們變白。避免采用真空干燥，因?yàn)檫^(guò)分干燥的沉淀會(huì)導(dǎo)致回收率更低。每份樣品中加入純化的水，振蕩重懸沉淀，在室溫下培育5分鐘并間或振蕩混合物。18000×g離心樣品1分鐘并將含DNA上清轉(zhuǎn)移到清潔的試管中。重復(fù)該步驟，在50℃下培育混合物。合并同一PCR產(chǎn)物的第一和第二DNA洗脫液，用瓊脂糖電泳測(cè)試1微升等份。-20℃保藏純化的DNA片段。
<克隆純化的PCR片段>
用pMOSBlue平頭克隆試劑盒(Amersham)來(lái)克隆經(jīng)如此擴(kuò)增和純化的條帶產(chǎn)物。將3.75微升每份純化的濃縮物和0.5微升10×pK緩沖液、0.25微升100mM DTT以及0.5微升pK酶混合物混合在1.5毫升試管中。用移液管嘴輕輕攪拌混合物，在微量離心機(jī)中稍稍旋轉(zhuǎn)離心。在Sanyo培養(yǎng)箱中22℃培育試管40分鐘。在ThermoAlumi Bath中75℃熱滅活反應(yīng)物約10分鐘，在冰上冷卻2分鐘，稍稍離心以收集冷凝物。
混合5微升的上述產(chǎn)物和0.5微升pMOSBlue載體(50毫微克/微升)和0.5微升T4DNA連接酶(2 Weiss單位)，制得各連接反應(yīng)物。用移液管嘴輕輕攪拌混合物，在微量離心機(jī)中稍稍旋轉(zhuǎn)離心。在Sanyo培養(yǎng)箱中22℃培育試管過(guò)夜。
解凍含200微升pMOSBlue感受態(tài)細(xì)胞的一個(gè)試管，攪拌使懸浮的細(xì)胞均勻混合。將15微升感受態(tài)細(xì)胞移液到各預(yù)冷的1.5毫升試管中。將1微升連接混合物直接加入細(xì)胞中并輕微攪拌混合。其余的細(xì)胞再次冷凍用于下次轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化效率有一些損失)。試管于冰上放置30分鐘。在Thermo Alumi Bath ALB-120中42℃下熱休克細(xì)胞正好45秒，在冰上放置30秒。在室溫下將80微升SOC培養(yǎng)基加入各試管，使試管置于37℃1小時(shí)。
用100微升20毫克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和20微升100mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)鋪涂在含有1.5％Bacto-Agar(Difco)、30膠囊/升的CircleGrow(Bio101，Inc.，)、75微克/毫升氨芐青霉素和15微克/毫升四環(huán)素的平板上。在接種前使瓊脂板浸泡至少30分鐘。
將全部體積的各轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸液鋪涂在瓊脂板上。倒置平板37℃培育過(guò)夜。觀察到有四種不同的表型深藍(lán)、淺藍(lán)、白色帶藍(lán)色中心(所謂的“牛眼”)和白色。發(fā)現(xiàn)插入物只在白色噬斑中。
<質(zhì)粒DNA的純化>
用無(wú)菌牙簽挑取含有轉(zhuǎn)化子的白色菌落。將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到有含100微克/毫升氨芐青霉素的2.5毫升CircleGrow培養(yǎng)基的14毫升帶蓋聚丙烯管(Falcon)中。37℃、200rpm搖動(dòng)試管16-72小時(shí)(培育1天提供的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量最大)。
用RPM AFS試劑盒(Bio 101，Inc.)從細(xì)菌培養(yǎng)中迅速分離和純化雙鏈DNA。一次最多能純化12個(gè)質(zhì)粒DNA。18000×g(15000rpm，TOMY MRX-150高速微量冷凍離心機(jī))離心2毫升Safe-Lock管(Eppendorf)中的細(xì)菌細(xì)胞1分鐘。傾析并棄去上清。通過(guò)振蕩將細(xì)胞重懸于1毫升水中并再次離心。傾析并棄去上清。將每份細(xì)胞沉淀振蕩重懸于200微升Pre-Lysis 1號(hào)緩沖液中直至細(xì)胞完全重懸。在細(xì)胞懸液中直接加入400微升2號(hào)堿性裂解液，輕輕倒置試管15次。1分鐘后，加入300微升冰冷的3號(hào)中和液，劇烈振蕩試管3-5次直至形成均勻的白色沉淀。在冰上培育混合物5分鐘，室溫離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的2毫升試管中。
在上清中加入500微升4號(hào)Glassmilk SpinBuffer，上下顛倒5分鐘以使DNA與Glassmilk液有效結(jié)合，18000×g離心2秒。傾析并棄去上清。將每份Glassmilk/DNA復(fù)合物重懸于500微升5號(hào)洗滌溶液中(通過(guò)移液管嘴輕輕攪拌然后上下吹吸)，并轉(zhuǎn)移到試劑盒提供的RPM AFS旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器(spin filter)中。旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器10秒以使洗滌液平面降低至沉淀平面但不使沉淀干燥。清空Catch試管，重新組裝旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。在每份旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器中加入500微升洗滌液，然后離心2分鐘以干燥過(guò)濾器中的物質(zhì)。將旋轉(zhuǎn)過(guò)濾物質(zhì)轉(zhuǎn)移到新的試劑盒提供的RPM AFS Catch試管中。在每份樣品中加入140微升8號(hào)洗脫液(RNA酶/DNA酶/無(wú)熱原水)，以手指輕拍將Glassmilk/DNA復(fù)合物混合成漿液。15000rpm離心3分鐘收集Catch管中的質(zhì)粒DNA。-20℃保藏DNA溶液。
<DNA插入物的檢測(cè)>
對(duì)經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶消化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，以確定插入物的存在以及用于DNA測(cè)序的合適量的DNA溶液。使質(zhì)粒DNA溶液各2微升與11.1微升H2O、1.5微升10×H通用緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH7.5，100mM MgCl2，10mM DTT，1M NaCl)、0.2微升SalI(10U/微升)(購(gòu)自Takara)、0.2微升EcoRI(10U/微升)(購(gòu)自Takara)混合，并且37℃培育至少2小時(shí)。
用微波爐將含1％瓊脂糖GP-36(Nacalai Tesque)、0.5微克/毫升溴化乙啶(Sigma)和0.5×TBE緩沖液的混合物融化，制得分離膠，將溶液倒入Mupid-2 Mini-Gel電泳系統(tǒng)模具(Advance)中，使其室溫下固化至少30分鐘。
使每份消化的質(zhì)粒DNA與1.5微升10×加樣緩沖液(50％甘油、0.01％溴酚藍(lán))混合并加樣到凝膠上。用pHY標(biāo)記(Takara)作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。用緩沖室中含有0.5×TBE緩沖液的Mupid-2 Mini-Gel電泳系統(tǒng)以100V進(jìn)行凝膠電泳30分鐘。用FAS-II(Toyobo)產(chǎn)生圖片用電子紫外透射儀照射凝膠，用XC-75/75CE CCD視頻相機(jī)模塊(Sony)拍攝圖片，并用視頻圖像打印機(jī)UP-880(Sony)打印。從攜帶長(zhǎng)度合適插入物的克隆選取DNA用于DNA測(cè)序以獲得最終的確認(rèn)。
<DNA測(cè)序樣品的制備>
用具有AmpliTaq DNA聚合酶FS的ABI PRISMTM染色終止循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)進(jìn)行DNA測(cè)序。一次最多加工18個(gè)PCR產(chǎn)物。如下所述，在帶蓋MicroAmp反應(yīng)管(Perkin Elmer)中制備反應(yīng)混合物8微升Terminator Ready Reaction Mix、2微升正向或反向引物(2μM)、0.1-0.5微克質(zhì)粒DNA(所需DNA溶液體積根據(jù)電泳圖片估計(jì))并加水至最終體積為20微升。用移液管上下吹吸混合物以充分混合。根據(jù)下列擴(kuò)增循環(huán)在GeneAmp PCR系統(tǒng)9600型熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)上進(jìn)行PCR[重復(fù)25輪]10秒96℃(變性)5秒50℃(退火)4分鐘60℃(延伸)[最后步驟]4℃(放置)用乙醇沉淀純化PCR產(chǎn)物。對(duì)于每份反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5毫升微量離心管中加入2微升3M乙酸鈉(pH5.2)和50微升99.5％乙醇。將每個(gè)反應(yīng)管中全部20微升物質(zhì)轉(zhuǎn)移到含有乙醇溶液的微量離心管中。振蕩試管并置于冰上10分鐘。然后4℃、18000×g(15000rpm，在TOMY MC-150高速微量離心機(jī)上)離心混合物20分鐘。用微量移液管仔細(xì)吸出乙醇溶液。加入250微升70％乙醇洗滌沉淀并15000rpm離心1分鐘。用微量移液管仔細(xì)吸出乙醇溶液以避免攪亂沉淀。真空干燥試管10分鐘。干燥的沉淀可立即使用或-20℃保藏。
<DNA測(cè)序>
用373-18DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems)對(duì)質(zhì)粒DNA測(cè)序。由于玻璃儀器的清潔度對(duì)于可信、準(zhǔn)確地測(cè)序非常重要，因此用水仔細(xì)洗滌玻璃儀器，然后用異丙醇擦洗。用含8.3M尿素的4.75％變性PAGG分離PCR產(chǎn)物在50毫升離心管中，混合19.94克尿素、4.75毫升40％(19∶1)丙烯酰胺/Bis溶液(Bio-Rad Laboratories)和8毫升5×TBS緩沖液，加入蒸餾水至40毫升。劇烈攪拌試管，在微波爐中旋轉(zhuǎn)1周溫?zé)?，并再次劇烈攪拌直至所有尿素結(jié)晶溶解。在裝有am A-3S抽吸器的干燥器中使溶液脫氣，同時(shí)準(zhǔn)備凝膠澆注裝置(約10分鐘)。加入18微升TEMED(Sigma)和160微升10％過(guò)硫酸銨(-20℃保藏)，輕微混合30秒并倒入玻璃板模具(420×250×0.25mm)中。使凝膠在室溫下固化2-5小時(shí)。
混合52微升甲酰胺和10微升含3％藍(lán)色葡聚糖(Sigma)的50mM EDTA(pH8.0)，制得加樣緩沖液。將測(cè)序樣品溶解在3微升該緩沖液中，在Thermo Alumi BathALB-120(Iwaki)中94℃加熱2分鐘，然后置于冰上。再一次仔細(xì)清洗有凝膠的玻璃板，掃描檢查，并組裝電泳室。將鯊魚(yú)齒形梳插入浸液1mm，將1×TBE緩沖液倒入兩個(gè)緩沖室中，預(yù)先進(jìn)行電泳20-30分鐘。PMT電壓設(shè)定為900V，運(yùn)行參數(shù)設(shè)定為2500V、20mA和30W。用注射器以1×TBE緩沖液仔細(xì)清洗諸孔，將樣品加入孔中，進(jìn)行電泳9小時(shí)。電泳開(kāi)始后立即開(kāi)啟數(shù)據(jù)收集計(jì)算機(jī)程序。
數(shù)據(jù)收集完畢后自動(dòng)激活A(yù)NALYSIS計(jì)算機(jī)程序。手動(dòng)修正軟件錯(cuò)誤。核苷酸序列的最初分析采用DNASIS軟件來(lái)進(jìn)行。
<雜交探針的制備>
按“插入物的檢測(cè)”部分所述從具有適當(dāng)插入物的質(zhì)粒DNA儲(chǔ)備液制備雜交探針?；旌霞兓腄NA樣品和0.116體積的10×H通用緩沖液以及SalI(10U/微升)和EcoRI(10U/微升)各0.02體積。37℃消化過(guò)夜。于50V進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳50分鐘，從凝膠上切下DNA插入物，如“PCR片段的純化”部分所述，合并相同的級(jí)分并純化。
<噬菌體接種細(xì)胞的制備>
為了獲得高效的噬菌體感染，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲用于噬菌體生長(zhǎng)的細(xì)胞且基本上沒(méi)有死細(xì)胞非常重要。發(fā)現(xiàn)XL1-Blue MRF′菌株是使用最方便的。其基因型是Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-l recA1 gyrA96 relA1lac[F′proAB lacqZ ΔM15 Tn10(Tetr)]。菌株在添加了25微克/毫升四環(huán)素的CG瓊脂板(1.6％Bacto-Agar(Difco)和40膠囊/升Circle Grow(Bio101，Inc.))上培養(yǎng)。每?jī)芍軐⒓?xì)胞重新劃線到新鮮平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜并4℃保藏。
在接種階段的前一天，從CG瓊脂板挑取單菌落接種到添加了0.4％麥芽糖和25微克/毫升四環(huán)素的3毫升CG肉湯(40膠囊/升CircleGrow)中，并37℃搖動(dòng)培育過(guò)夜。
將1.0毫升過(guò)夜培養(yǎng)物加入47毫升同一預(yù)先溫?zé)岬纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中，37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)3小時(shí)。用裝備了0.1毫升石英玻璃槽的Beckman DU640分光光度計(jì)評(píng)估細(xì)胞濃度。OD600通常在0.3左右(1.5×108細(xì)胞/毫升)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的50毫升帶蓋聚碳酸酯離心瓶(Beckman)中，采用Beckman JA20轉(zhuǎn)頭在Beckman J2-MC離心機(jī)中4℃、3000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。將細(xì)胞沉淀重懸在冰冷的無(wú)菌10mM MgSO4中，制得2×109細(xì)胞/毫升的懸浮液。將細(xì)胞置于冰上并立即用于滴定和接種噬菌體以便篩選。
<噬菌體滴定>
用含有添加了25微克/毫升四環(huán)素的CG瓊脂的100mm Petri皿(Falcon)進(jìn)行滴定。使倒入瓊脂的平皿敞開(kāi)蓋子在室溫下靜置20分鐘以使瓊脂固化，然后在無(wú)菌櫥中(SCV-1301EC II BHitachi)吹無(wú)菌空氣干燥30分鐘并4℃保藏。使用前，從冰箱中取出皿并在恒溫室中37℃溫?zé)?小時(shí)。
使2微升噬菌體混合物與198微升SM緩沖液混合(100mM NaCl、8mM MgSO4、0.01％明膠(Sigma)和50mM Tris-HCl，pH7.5)。該稀釋度標(biāo)為104，因?yàn)樵诮臃N10微升稀釋液時(shí)，平板上的一個(gè)噬斑等價(jià)于原來(lái)噬菌體原種中的104pfu/ml。以相同方式用SM緩沖液制備連續(xù)稀釋液直到109。
用90微升SM緩沖液稀釋10微升的各個(gè)噬菌體稀釋液，和懸浮在10mM MgCl2中的100微升細(xì)胞混合，并在Thermo Alumi Bath ALB-120的金屬容器中37℃培育15分鐘。
在微波爐中融化CG頂層瓊脂(0.8％I-B型瓊脂糖(Sigma)、40膠囊/升CircleGrow)，加入20％麥芽糖至最終濃度為0.4％。將3毫升等份的頂層瓊脂糖加入16×125mm帶蓋組織培養(yǎng)管(Falcon)中，使用前置于Thermo Alumi Bath ALB-120中48℃。
將各接種化合物加入含有融化瓊脂糖的試管中，顛倒試管5次迅速混合，然后倒在添加了25微克/毫升四環(huán)素的100mm平板中的干CG瓊脂上。在取出平板前使頂層瓊脂糖完全凝固3分鐘。將平板倒置并在恒溫室中37℃培育5小時(shí)，然后在室溫下過(guò)夜。計(jì)數(shù)噬斑數(shù)量，通過(guò)將噬斑總數(shù)乘以稀釋度來(lái)計(jì)算噬菌體滴度。
<噬菌體接種和將噬斑轉(zhuǎn)移到膜上>
接種過(guò)程基本上和上述噬菌體的滴定相同。一次最多能處理12個(gè)平板。用死于外傷的75歲男性白種人的肺(Clontech)通過(guò)寡(dT)加隨機(jī)引導(dǎo)方法構(gòu)建λgt10克隆載體的cDNA文庫(kù)。
對(duì)于首次篩選，使SM緩沖液稀釋的100微升噬菌體文庫(kù)(含有50000-500000pfu(噬斑形成單位))與懸浮在10mM MgCl2中的等體積的細(xì)胞混合，37℃培育15分鐘，通過(guò)5次顛倒和7毫升48℃的CG頂層瓊脂糖充分混合，并倒在添加了25微升/毫升四環(huán)素的CG瓊脂平板(150mmFalcon)上。將平板倒置，37℃培育5小時(shí)，然后在室溫下過(guò)夜。
將HybondTM-N+(圓形，132mm，帶格，帶正電荷的尼龍膜(Amersham))鋪到含噬斑瓊脂平板上。用21G針刺三點(diǎn)以標(biāo)記濾膜的方向。取下濾膜，將其面朝上放在臺(tái)上干燥至少3分鐘。對(duì)于DNA固定，將濾膜置于2層浸透了0.4M NaOH的Whatman濾紙上10-30分鐘。用5×SSPE緩沖液(20×SSPE3.0M NaCl，0.2M NaH2PO4，0.02MEDTA，pH7.4，購(gòu)自GibcoBRL)充分洗膜2次，并用水洗一次，以除去細(xì)菌碎片和堿，用紙巾吸干并在室溫下干燥。
<探針的標(biāo)記和純化>
用Multiprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham)標(biāo)記探針。用水將大約各25毫微克回收的DNA插入物調(diào)至27微升，在Thermo Alumi Bath ALB-120中98℃加熱5分鐘并在冰上冷卻。18000×g(15000rpm，在TOMY MRX-150型高速微量冷凍離心機(jī)上)離心試管1秒，使試管內(nèi)的物質(zhì)下降。如下所述，在冰上在帶蓋MicroAmp反應(yīng)管中建立四種反應(yīng)物全部體積的變性的DNA探針、10微升標(biāo)記緩沖液、5微升引物/BSA溶液、6微升[α-32P]dCTP(約110TBq/毫摩爾，370MBq/ml)(Amersham)和2微升Klenow酶。通過(guò)上下吹吸稍稍混合混合物，在GeneAmp PCR系統(tǒng)2400型中37℃培育30分鐘，置于20℃3-4小時(shí)直至除去未摻入的核苷酸，然后雜交。
用QIAquick除核苷酸試劑盒(Qiagen)純化標(biāo)記的探針。使每份標(biāo)記混合物與1.5毫升試管中的500微升緩沖液PN混合。將QIAquich旋轉(zhuǎn)柱置于提供的2毫升收集管中。為了結(jié)合DNA，將樣品加樣到QIAquick旋轉(zhuǎn)柱中，6000rpm離心1分鐘(TOMY高速微量離心機(jī)MC-150)。將QIAquich柱置于清潔的2毫升收集管中，保留放射活性流穿液以便隨后計(jì)算摻入DNA中的標(biāo)記。為了洗滌QIAquick柱，加入500微升緩沖液PE并6000rpm離心1分鐘。棄去流穿液，用另500微升緩沖液PE重復(fù)洗滌。棄去流穿液，再次13000rpm離心QIAquick柱1分鐘以除去殘余的液體。將QIAquick柱置于清潔的1.5毫升微量離心管中。為了從柱中洗脫DNA，在柱中心加入100微升緩沖液EB(10mM Tris-HCl，pH8.5)，靜置1分鐘，然后13000rpm離心1分鐘。
將洗脫的每份標(biāo)記DNA轉(zhuǎn)移到帶蓋MicroAmp反應(yīng)管中，在GeneAmp PCR系統(tǒng)2400型中99.9℃加熱5分鐘，然后冷卻至4℃。將變性的探針加入含有450微升雜交緩沖液的1.5毫升試管中，用β(γ)測(cè)量器TGS-133(Aloka)評(píng)價(jià)標(biāo)記摻入的效率并和未摻入核苷酸的放射活性比較。
<噬斑雜交>
為了精確地定位濾膜以切下陽(yáng)性噬斑，在低溫下進(jìn)行雜交和濾膜洗滌是有利的。如下制備100毫升雜交緩沖液50毫升甲酰胺、去離子、測(cè)試的核酸酶和蛋白酶(Nacalai Tesque)，25毫升20×SSPE緩沖液(3M NaCl，0.2M NaH2PO4，20mM EDTA，pH7.4GibcoBRL)，5毫升10％SDS，18毫升水；2管1.5毫升試管各自含有200微升10毫克/毫升腓精DNA溶液(GibcoBRL)和0.8毫升水，使其在Thermo Alumi BathALB-120中98℃加熱5分鐘，在冰上冷卻，然后和雜交緩沖液合并。由于SDS易于隨溫度降低而沉淀，使用前將雜交緩沖液(在冬季)溫?zé)嶂链蠹s40℃。
將80毫升雜交緩沖液倒入150mm圓形塑料容器中，一張接一張地浸漬12張濾膜，應(yīng)注意每張膜的前面應(yīng)接觸相鄰膜的前面，每張膜的背面接觸相鄰膜的背面。合上蓋子，在Thomastat Shaker T-22S中32℃、40rpm進(jìn)行預(yù)雜交至少3小時(shí)。
將雜交緩沖液從預(yù)雜交濾器倒入另一150mm圓形塑料容器中，其余的雜交緩沖液與四個(gè)標(biāo)記探針混合，如上所述浸泡濾膜。合上容器蓋子，在Thomastat ShakerT-22S中32℃、40rpm雜交過(guò)夜。
將濾膜置于另一帶蓋子的圓形塑料容器中，采用下列各洗滌方案通過(guò)在Thomastat Shaker T-22S中搖動(dòng)40rpm來(lái)進(jìn)行洗滌1)2×SSPE緩沖液，0.1％SDS 32℃ 10分鐘2)2×SSPE緩沖液，0.1％SDS 50℃ 1.5小時(shí)3)0.5×SSPE緩沖液，0.1％SDS 50℃ 1.5小時(shí)吸出濾膜中剩余的洗滌緩沖液，使濾膜室溫至少干燥1.5小時(shí)。在兩個(gè)35.6×43.2-cm Fuji EC-A匣中排列12個(gè)濾膜，曝光Hyperfilm-MP X射線膠片(Amersham)3-4天。
<噬菌體回收>
使X-射線膠片顯影，憑借照明用Bright Light Box根據(jù)取向標(biāo)記確定陽(yáng)性噬斑的位置。用21G針頭切下中心與X射線膠片上陽(yáng)性信號(hào)重合的5×5mm頂層瓊脂糖栓塞(plug)，并放入各含有0.3毫升SM緩沖液的4毫升帶蓋樣品管中。4℃洗脫噬菌體1天。
<第二次篩選噬菌體>
第二次篩選噬菌體基本上和上述第一次篩選相同。在初步調(diào)節(jié)后，不需要再為平板接種而滴定噬菌體洗脫液發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下對(duì)應(yīng)于每150mm Petri平皿0.0001微升噬菌體洗脫液的噬斑量是合適的。用添加了14微升DMSO(二甲基亞砜)的0.2毫升SM緩沖液4℃洗脫單個(gè)噬斑1天，-70℃保藏直至用于繁殖和純化噬菌體DNA。
<噬菌體DNA的制備>
在接種階段的前一天早上，從CG瓊脂平板挑取大腸桿菌XL1-Blue MRF′單菌落，接種到3毫升添加了0.4％麥芽糖和25微克/毫升四環(huán)素的CG肉湯(40膠囊/升CircleGrow)中，并37℃振搖培育。當(dāng)天晚上，在47毫升同樣預(yù)溫?zé)岬纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中加入50微升培養(yǎng)物，并劇烈搖動(dòng)37℃培育過(guò)夜。第二天早上，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的50毫升帶蓋聚碳酸酯離心瓶(Beckman)中，并用Beckman JA20轉(zhuǎn)子4℃、3000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。將所得細(xì)胞沉淀重懸在4.5毫升冰冷的無(wú)菌10mM MgSO4中，然后置于冰上。
用含有添加了25微克/毫升四環(huán)素的1.2％CG瓊脂糖GP-36的150mm Petri平皿(Falcon)繁殖噬菌體。倒入瓊脂的Petri平皿在固化后沒(méi)有干燥。將它們保藏在冰箱中，使用前在恒溫室中37℃溫?zé)?小時(shí)。
使50微升含有約5×106pfu的噬菌體洗脫液和450微升SM緩沖液以及500微升細(xì)胞懸液充分混合，37℃培育15分鐘，和6毫升融化的瓊脂糖混合并鋪涂到Petri皿上。3分鐘后，倒置平皿并37℃培育約8小時(shí)。
為了洗脫噬菌體，用8毫升SM緩沖液和200微升氯仿覆蓋每個(gè)平板，將平板固定到Rotary Shaker R-20mini(Taitec)上，4℃、150rpm振動(dòng)過(guò)夜。
將噬菌體洗脫液轉(zhuǎn)移到15毫升錐形離心管(Greiner)中，用另外2毫升SM緩沖液室溫洗滌平板1小時(shí)。合并第一次和第二次洗脫液，3500rpm旋轉(zhuǎn)試管10分鐘(TOMY TS-7轉(zhuǎn)頭低速離心機(jī)TOMY LC-122)。
用QIAGENλ微量試劑盒(QUIAGEN)純化噬菌體DNA。將8毫升澄清的平板裂解液轉(zhuǎn)移至新的15毫升離心管中，和25微升緩沖液LI(300mM NaCl，100mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，0.2毫克/毫升BSA，20毫克/毫升RNA酶A和6毫克/毫升DNA酶I)混合，在Thermo Alumi Bath ALB-120(Iwaki)中37℃培育30分鐘。將裂解液和1.6毫升冰冷的緩沖液L2(30％聚乙二醇PEG6000，3M NaCl)合并，于冰上培育60分鐘。將試管內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到16×76mm離心管(Beckman)中，在L70超離心機(jī)(Beckman)的50Ti轉(zhuǎn)頭中4℃、15000rpm離心15分鐘。棄去上清液，將試管倒置1分鐘，以排干殘余液。前一步驟中進(jìn)行的PEG沉淀所形成噬菌體沉淀很難用肉眼看見(jiàn)，因?yàn)樗峭该鞯?，并且分布在整個(gè)試管壁上。因此，用0.65毫升緩沖液L3(100mM NaCl，100mM Tris-HCl，pH7.5，25mM EDTA)分幾次沿管壁吹吸，以確保沉淀完全重懸，將該物質(zhì)轉(zhuǎn)移至2毫升Safe-Lock管(Eppendorf)中。在試管中加入等體積的緩沖液4(4％十二烷基硫酸鈉)，輕輕混合，在Thermo Alumi Bath ALB-120中70℃加熱10分鐘，然后在冰上冷卻。將0.65毫升緩沖液L5(3M乙酸鉀，pH5.5)倒入試管中，立即稍稍混合，并15000rpm、4℃離心30分鐘(高速微量冷凍離心機(jī)MRX-150(TOMY))。將上清轉(zhuǎn)移到新的2毫升管中，室溫再次15000rpm離心10分鐘以除去殘余的懸浮或顆粒狀物質(zhì)。
在進(jìn)行離心的同時(shí)，將QIAGEN-tip 20放入廢液盤上方的QIAtrack 1中，用1毫升緩沖液QBT(750mM NaCl，50mM MOPS，pH7.0，15％乙醇，0.15％Triton X-100)平衡柱。使QIAGEN-tip完全排干。QIAGEN-tip可以無(wú)人管理，因?yàn)闃?shù)脂床保留了一些緩沖液，不容易變干。
迅速將上清液加樣到QIAGEN-tip上，使其靠重力流經(jīng)通過(guò)樹(shù)脂。尖嘴用1毫升緩沖液QC(1.0M NaCl，50mM MOPS，pH7.0，15％乙醇)洗滌兩次。將QIArack 1的上部放在裝有清潔的1.5毫升管的下方支架的上面，用0.75毫升緩沖液QC(1.25MNaCl，50mM Tris-HCl，pH8.5，15％乙醇)洗脫DNA兩次至兩個(gè)1.5毫升微量離心管(Treff Lab)中。
用0.7體積異丙醇沉淀DNA，并室溫15000rpm離心30分鐘。仔細(xì)取出上清液棄去。室溫用0.5毫升70％乙醇稍稍洗滌DNA沉淀，然后重新離心。重復(fù)室溫用70％乙醇洗滌。完全除去乙醇?？諝飧稍锍恋?分鐘，將每管中的DNA溶解在18微升NaOH(pH8)中，合并含有相同DNA的兩個(gè)管中的物質(zhì)。
<噬菌體插入物的重新克隆>
為了確定噬菌體插入物的序列，將來(lái)自合適克隆的DNA片段重新克隆到pUC18載體中。
使36微升λDNA溶液和4.5微升10×H緩沖液以及4.5微升EcoRI(10U/微升)(Takara)混合。37℃消化過(guò)夜，然后在三個(gè)孔中分配混合物，用1％瓊脂糖GP-36凝膠50V電泳50分鐘。按“PCR片段的純化”所述，用QIAEX II凝膠抽提試劑盒純化插入物。
使5微升洗脫的片段和15微升水混合，并加入Ready-To-Go pUC18 EcoRI/BAP+連接酶(Pharmacia Biotech)的管中。室溫培育混合物3分鐘，然后在MIR-153培養(yǎng)箱(Sanyo)中16℃培育0.5-30小時(shí)。用0.5微升連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化25微升DH5高度感受態(tài)的細(xì)胞(Toyobo)。轉(zhuǎn)化基本上根據(jù)“純化的PCR片段的克隆”過(guò)程實(shí)旋。將1/10的轉(zhuǎn)化子鋪涂到含1.4％Bacto-Agar(Difco)、40膠囊/升CircleGrow(Bio 101，Inc.)和100微克/毫升氨芐青霉素的平板上。37℃培育平板過(guò)夜。
每次轉(zhuǎn)化挑取3個(gè)克隆，在添加了100微克/毫升氨芐青霉素的2.5毫升CircleGrow培養(yǎng)基中37℃下生長(zhǎng)16-72小時(shí)。按照“質(zhì)粒DNA的純化”所述的那樣，用RPM AFS試劑盒純化質(zhì)粒DNA。
用2U EcoRI消化2微升DNA溶液，然后在1％瓊脂糖凝膠上電泳來(lái)估計(jì)插入物的存在和純化的DNA的大約濃度。按照上述方法用M13通用測(cè)序引物和M13反向測(cè)序引物通過(guò)DNA測(cè)序確定插入物的取向。
<嵌套缺失的構(gòu)建>
用外切核酸酶III控制DNA的消化來(lái)構(gòu)建雙鏈DNA中的單向缺失，以便對(duì)重新克隆的DNA插入物進(jìn)行測(cè)序。該酶僅對(duì)雙鏈DNA有3′外切核酸酶活性平頭和5′突出末端易被消化，而三個(gè)堿基或更長(zhǎng)的3′突出端對(duì)該酶有抗性。另外，由于磷酸骨架中的硫代磷酸酯鍵對(duì)外切核酸酶III的消化有抗性，因此已經(jīng)“填入”硫代核苷酸凹陷的3′末端(5′突出端)對(duì)消化也有抗性。用至少兩個(gè)攜帶該基因各個(gè)DNA區(qū)的獨(dú)立的克隆和雙鏈嵌套缺失試劑盒(Pharmacia Biotech)從相反的兩端產(chǎn)生缺失。
合適的限制性內(nèi)切核酸酶一定不能切割DNA插入物。如果可采用產(chǎn)生3′和5′突出端或平頭末端的一對(duì)合適的限制性酶，那么用這些酶消化2微克純化的質(zhì)粒DNA至少3小時(shí)。用各2微升等份通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測(cè)消化的進(jìn)展。當(dāng)消化完成后，70℃加熱DNA樣品10分鐘以滅活酶。
當(dāng)不能找到合適的一對(duì)限制性酶且兩個(gè)內(nèi)切核酸酶均不產(chǎn)生3′突出端時(shí)，可以選擇硫代核苷酸的末端保護(hù)。在這種情況下，在10微升的體積中用第一限制性內(nèi)切核酸酶消化2微克質(zhì)粒DNA溶液。最多用3微升的該反應(yīng)混合物來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)展?；旌螰PLCpure Klenow片段(1單位/微升)和20微升1×Klenow緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5；10mM MgCl2和0.1mM DTT)，制得稀釋的Klenow片段(0.05單位/微升)。在1.5毫升微量離心管中加入下列物質(zhì)7微升限制性消化的DNA、1微升10×Klenow緩沖液、1微升dNTPαS Mix(含有dATPαS，dCTPαS，dGTPαS和dTTPαS各400μM的水溶液)和1微升稀釋的Klenow片段。輕輕混合試管，簡(jiǎn)單離心并37℃培育15分鐘。65℃加熱反應(yīng)混合物20分鐘，然后加入20微升NaCl/糖原(含有250mMNaCl和250毫微克/微升糖原的水溶液)和75微升乙醇。將混合物置于干冰上10分鐘，或-80℃冷卻至少1小時(shí)。4℃、15000rpm離心10分鐘，收集DNA沉淀。仔細(xì)取出上清液棄去。用250微升70％乙醇清洗沉淀，離心1分鐘。仔細(xì)除去上清液。真空干燥沉淀5分鐘，重新溶于10微升水中。在20微升的最終反應(yīng)體積中用第二限制性酶消化DNA，70℃加熱10分鐘以滅活酶。
在微量離心管中，如下制得S1核酸酶/緩沖液混合物33微升S1緩沖液、66微升蒸餾水和1微升S1核酸酶。將3微升該混合物移液到20個(gè)微量離心管中，并置于冰上。
制備24微升含合適NaCl濃度的2×ExoIII緩沖液。在用等體積的雙消化DNA稀釋后，NaCl的濃度應(yīng)為75mM或更低。
在1.5毫升微量離心管中，混合20微升2×ExoIII緩沖液和20微升(2微克)雙消化的DNA，在Thermo Alumi Bath ALB-120中30℃平衡2-3分鐘。取出2微升等份作為“0時(shí)間”對(duì)照樣品，并置入含有3微升S1核酸酶/緩沖液的合適的試管中，充分混合并置于冰上。
加入1微升外切核酸酶，輕輕混合，繼續(xù)30℃培育。每隔5分鐘從反應(yīng)混合物中取出2微升樣品，立即和3微升S1核酸酶/緩沖液充分混合。所有這些試管均置于冰上直至從外切核酸酶III反應(yīng)混合物中取出了所有的定時(shí)樣品。
在取出所有的定時(shí)樣品并和S1核酸酶/緩沖液混合后，在室溫下同時(shí)培育這些樣品30分鐘。
向每份樣品中加入1微升S1核酸酶終止溶液，65℃培育試管30分鐘。用每份定時(shí)樣品的一半來(lái)電泳分析缺失，另一半用于通過(guò)連接重新環(huán)化。所有樣品均同時(shí)進(jìn)行這兩個(gè)步驟，然后用缺失分析的結(jié)果選擇重新環(huán)化的樣品用于轉(zhuǎn)化。
混合3微升各份樣品和2微升加樣緩沖液(50％甘油、1mM EDTA和0.01％溴酚藍(lán))，在含有0.5微克/毫升溴化乙啶的1％瓊脂糖凝膠(瓊脂糖凝膠GP-36，購(gòu)自NacalaiTesque)上電泳30分鐘進(jìn)行分析。
在進(jìn)行電泳的同時(shí)，用各定時(shí)樣品的其余3微升進(jìn)行重新連接。在1.5毫升微量離心管中混合下列物質(zhì)制備連接混合物40微升10×連接緩沖液，80微升25％PEG，2微升T4 DNA連接酶和218微升蒸餾水。將17微升的該連接混合物加入3微升各定時(shí)樣品中，輕輕混合并室溫培育2小時(shí)。
在電泳完成后，檢查凝膠以確定哪個(gè)定時(shí)樣品含有感興趣的缺失。用含有感興趣缺失的那些樣品轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。用2微升連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化10微升DH5高度感受態(tài)細(xì)胞(Toyobo)。根據(jù)“純化的PCR片段的克隆”所述的方法，實(shí)施轉(zhuǎn)化。將1/10轉(zhuǎn)化子鋪涂到含1.4％Bacto-Agar(Difco)、40膠囊/升CircleGrow(Bio 101，Inc.)和100微克/毫升氨芐青霉素的平板上。使各平板的兩個(gè)菌落生長(zhǎng)，如上所述對(duì)經(jīng)EcoRI消化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳然后作DNA測(cè)序，以分析缺失程度。將DNA序列與質(zhì)粒DNASIS計(jì)算機(jī)程序相聯(lián)，以編譯全長(zhǎng)插入物。
<測(cè)序數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析>
用DNASIS計(jì)算機(jī)程序和下列一些通過(guò)因特網(wǎng)獲得的軟件來(lái)分析核苷酸序列BLAST(基本局部序列對(duì)比搜索工具＂Basic Local Alignment Search Tool＂)、MOTIF(蛋白質(zhì)序列基序搜索＂Protein Sequence Motif Search＂)、PSORT(蛋白分揀信號(hào)和氨基酸序列中定位的預(yù)測(cè)＂Prediction of Protein Sorting Signal and Localization Sites in AminoAcid Sequences＂)、SOSUI(預(yù)測(cè)跨膜節(jié)段)、SIM(蛋白質(zhì)序列對(duì)比工具)和GeneStream序列對(duì)比。
<Northern雜交>
如上文“噬斑雜交”中所述的那樣，使每條泳道含有約2微克多聚A+RNA的多重組織Northern(MTN)印跡(Clontech)和hGHITS特異性探針雜交。
預(yù)雜交和雜交在42℃而不是32℃進(jìn)行。
進(jìn)行下列洗滌1)2×SSPE緩沖液，0.1％SDS 42℃ 10分鐘2)2×SSPE緩沖液，0.1％SDS 65℃ 1.5小時(shí)3)0.5×SSPE緩沖液，0.1％SDS 65℃ 1.5小時(shí)4)0.1×SSPE緩沖液，0.1％SDS 65℃ 1.5小時(shí)
5)0.1×SSPE緩沖液，0.1％SDS 65℃ 1.5小時(shí)采用BIOMAX MS科學(xué)顯影膠片(Kodak)，因?yàn)槠涿舾行员菻yperfilm-MP兒乎高8倍。用具有增感屏的Fuji EC-A匣使膠片在-80℃下受膜曝光3周。在膠片顯影前，在室溫下溫?zé)岽讼恢辽?小時(shí)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人JCR Pharmaceuticals Co.，Ltd.
(ii)發(fā)明名稱人腫瘤抑制基因(iii)序列數(shù)目22(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5486堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO1cgcggcgtga gcgccccggg aagatggagc agtcgccgtc cacgccaccg ccgccgcccg 60gggctccccc gtccctgcgg ggccagcagc agctccagcc accagtgccc ggtctcccgg120cgcgagaggc ccgggagccg ccggccagga cgcccccgag ggtgtagacc gcgcccctgg180agagagtgat aatcttcaaa atgaagactt tggaaaattt taggttctct ataggaacta240caaaaatgga aggaaagaac attttcaaaa ggaaattatt ttgaaagtat gtttacaaca300aactgatact attgacagtt ttttttttta aataataaaa cactttaaga agattgtatt360tatggtaaaa ggaaactgga ctaaca atg agg cca aag act ttt cct gcc acg 413Met Arg Pro Lys Thr Phe Pro Ala Thr1 5act tat tct gga aat agc cgg cag cga ctg caa gag att cgt gag ggg 461Thr Tyr Ser Gly Asn Ser Arg Gln Arg Leu Gln Glu Ile Arg Glu Gly10 15 20 25tta aag cag cca tcc aag tct tcg gtt cag ggg cta ccc gca gga cca 509Leu Lys Gln Pro Ser Lys Ser Ser Val Gln Gly Leu Pro Ala Gly Pro30 35 40aac agt gac act tcc ctg gat gcc aaa gtc ctg ggg agc aaa gat gcc 557Asn Ser Asp 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caggaaactg agtgatctaa tggttctctc 4820actttttttt tgttctttta gtgtactttg aagtatcaaa tcttaacttg gtttaaacaa 4880tacatattcc taacctttgt aaaaaagcaa agattcttca aaatgacatt gaaataaaaa 4940gtaagccata cgtattttct tagaagtata gatgtatgtg cgtgtataca cacacacaca 5000cacacacaga gataaacaca atattcctta tttcaaatta gtatgattcc tatttaaagt 5060gatttatatt tgagtaaaaa gttcaattct tttttgcttt ttaaaaaatc tgatgcttca 5120taattttcat tatattattc cacatatttt tccttgaagt tcttagcata atgtatccat 5180tacttagtat atatctaggc aacaacactt agaagtttat cagtgtttaa actaaaaaaa 5240taaagattcc tgtgtactgg tttacatttg tgtgagtggc atactcaagt ctgctgtgcc 5300tgtcgtcgtg actgtcagta ttctcgctat tttatagtcg tgccatgttg ttactcacag 5360cgctctgaca tactttcatg tggtaggttc tttctcagga actcagttta actattattt 5420attgatatat cattaccttt gaaaagcttc tactggcaca atttattatt aaaattttga 5480atccag 5486(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1088氨基酸(B)類型PRT(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Arg Pro Lys Thr Phe Pro Ala Thr Thr Tyr Ser Gly Asn Ser Arg1 5 10 15Gln Arg Leu Gln Glu Ile Arg Glu Gly Leu Lys Gln Pro Ser Lys Ser20 25 30Ser Val Gln Gly Leu Pro Ala Gly Pro Asn Ser Asp Thr Ser Leu Asp35 40 45Ala Lys Val Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Arg Gln Gln Gln Gln Met50 55 60Arg Ala Thr Pro Lys Phe Gly Pro Tyr Gln Lys Ala Leu Arg Glu Ile65 70 75 80Arg Tyr Ser Leu Leu Pro Phe Ala Asn Glu Ser Gly Thr Ser Ala Ala85 90 95Ala Glu Val Asn Arg Gln Met Leu Gln Glu Leu Val Asn Ala Gly Cys100 105 110Asp Gln Glu Met Ala Gly Arg Ala Leu Lys Gln Thr Gly Ser Arg Ser115 120 125Ile Glu Ala Ala Leu Glu Tyr Ile Ser Lys Met Gly Tyr Leu Asp Pro130 135 140Arg Asn Glu Gln Ile Val Arg Val Ile Lys Gln Thr Ser Pro Gly Lys145 150 155 160Gly Leu Met Pro Thr Pro Val Thr Arg Arg Pro Ser Phe Glu Gly Thr165 170 175Gly Asp Ser Phe Ala Ser Tyr His Gln Leu Ser Gly Thr Pro Tyr Glu180 185 190Gly Pro Ser Phe Gly Ala Asp Gly Pro Thr Ala Leu Glu Glu Met Pro195 200 205Arg Pro Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Pro Gly Val Gly Pro His Gly Pro210 215 220Gly His Gln His Gln His Pro Pro Lys Gly Tyr Gly Ala Ser Val Glu225 230 235 240Ala Ala Gly Ala His Phe Pro Leu Gln Gly Ala His Tyr Gly Arg Pro245 250 255His Leu Leu Val Pro Gly Glu Pro Leu Gly Tyr Gly Val Gln Arg Ser260 265 270Pro Ser Phe Gln Ser Lys Thr Pro Pro Glu Thr Gly Gly Tyr Ala Ser275 280 285Leu Pro Thr Lys Gly Gln Gly Gly Pro Pro Gly Ala Gly Leu Ala Phe290 295 300Pro Pro Pro Ala Ala Gly Leu Tyr Val Pro His Pro His His Lys Gln305 310 315 320Ala Gly Pro Ala Ala His Gln Leu His Val Leu Gly Ser Arg Ser Gln325 330 335Val Phe Ala Ser Asp Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Thr Pro Ser Arg340 345 350Asn Ser Leu Asn Val Asp Leu Tyr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Val Gln355 360 365Gln Trp Pro Ala Ala Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Leu Gln Lys Pro370 375 380Gly Leu Glu Ala Pro Pro Arg Ala His Val Ala Phe Arg Pro Asp Cys385 390 395 400Pro Val Pro Ser Arg Thr Asn Ser Phe Asn Ser His Gln Pro Arg Pro405 410 415Gly Pro Pro Gly Lys Ala Glu Pro Ser Leu Pro Ala Pro Asn Thr Val420 425 430Thr Ala Val Thr Ala Ala His Ile Leu His Pro Val Lys Ser Val Arg435 440 445Val Leu Arg Pro Glu Pro Gln Thr Ala Val Gly Pro Ser His Pro Ala450 455 460Trp Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala465 470 475 480Ala Glu Gly Leu Asp Ala Lys Glu Glu His Ala Leu Ala Leu Gly Gly785 490 495Ala Gly Ala Phe Pro Leu Asp Val Glu Tyr Gly Gly Pro Asp Arg Arg500 505 510Cys Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His Leu Leu Leu Arg Ser Lys Ser515 520 525Glu Gln Tyr Asp Leu Asp Ser Leu Cys Ala Gly Met Glu Gln Ser Leu530 353 340Arg Ala Gly Pro Asn Glu Pro Glu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Lys Ser545 550 555 560Ala Lys Gly Asp Lys Gly Gly Lys Asp Lys Lys Gln Ile Gln Thr Ser565 570 575Pro Val Pro Val Arg Lys Asn Ser Arg Asp Glu Glu Lys Arg Glu Ser580 585 590Arg Ile Lys Ser Tyr Ser Pro Tyr Ala Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln595 600 605His Val Glu Asn Val Ile Lys Thr Tyr Gln Gln Lys Val Asn Arg Arg610 615 620Leu Gln Leu Glu Gln Glu Met Ala Lys Ala Gly Leu Cys Glu Ala Glu625 630 635 640Gln Glu Gln Met Arg Lys Ile Leu Tyr Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Asn645 650 655Arg Leu Lys Arg Ala Lys Met Asp Lys Ser Met Phe Val Lys Ile Lys660 665 670Thr Leu Gly Ile Gly Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu Ala Cys Lys Val675 680 685Asp Thr His Ala Leu Tyr Ala Met Lys Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val690 695 700Leu Asn Arg Asn Gln Val Ala His Val Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu705 710 715 720Ala Glu Ala Asp Asn Glu Trp Val Val Lys Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln725 730 735Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp740 745 750Met Met Ser Leu Leu Ile Arg Met Glu Val Phe Pro Glu His Leu Ala755 760 765Arg Phe Tyr Ile Ala Glu Leu Thr Leu Ala Ile Glu Ser Val His Lys770 775 780Met Gly Phe Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp785 790 795 800Leu Asp Gly His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe805 810 815Arg Trp Thr His Asn Ser Lys Tyr Tyr Gln Lys Gly Ser His Val Arg820 825 830Gln Asp Ser Met Glu Pro Ser Asp Leu Trp Asp Asp Val Ser Asn Cys835 840 845Arg Cys Gly Asp Arg Leu Lys Thr Leu Glu Gln Arg Ala Arg Lys Gln850 855 860His Gln Arg Cys Leu Ala His Ser Leu Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile865 870 875 880Ala Pro Glu Val Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp885 890 895Trp Ser Val Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Leu Val Gly Gln Pro Pro900 905 910Phe Leu Ala Pro Thr Pro Thr Glu Thr Gln Leu Lys Val Ile Asn Trp915 920 925Glu Asn Thr Leu His Ile Pro Ala Gln Val Lys Leu Ser Pro Glu Ala930 935 940Arg Asp Leu Ile Thr Lys Leu Cys Cys Ser Ala Asp His Arg Leu Gly945 950 955 960Arg Asn Gly Ala Asp Asp Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Ser Ala Ile965 970 975Asp Phe Ser Ser Asp Ile Arg Lys Gln Pro Ala Pro Tyr Val Pro Thr980 985 990Ile Ser His Pro Met Asp Thr Ser Asn Phe Asp Pro Val Asp Glu Glu995 10001005Ser Pro Trp Asn Asp Ala Ser Glu Gly Ser Thr Lys Ala Trp Asp Thr101010151020Leu Thr Ser Pro Asn Asn Lys His Pro Glu His Ala Phe Tyr Glu Phe1025103010351040Thr Phe Arg Arg Phe Phe Asp Asp Asn Gly Tyr Pro Phe Arg Cys Pro104510501055Lys Pro Ser Gly Ala Glu Ala Ser Gln Ala Glu Ser Ser Asp Leu Glu106010651070Ser Ser Asp Leu Val Asp Gln Thr Glu Gly Cys Gln Pro Val Tyr Val107510801085(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1088氨基酸(B)類型PRT(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Arg Pro Lys Thr Phe Pro Ala Thr Thr Tyr Ser Gly Asn Ser Arg1 5 10 15Gln Arg Leu Gln Glu Ile Arg Glu Gly Leu Lys Gln Pro Ser Lys Ser20 25 30Ser Val Gln Gly Leu Pro Ala Gly Pro Asn Ser Asp Thr Ser Leu Asp35 40 45Ala Lys Val Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Arg Gln Gln Gln Gln Met50 55 60Arg Ala Thr Pro Lys Phe Gly Pro Tyr Gln Lys Ala Leu Arg Glu Ile65 70 75 80Arg Tyr Ser Leu Leu Pro Phe Ala Asn Glu Ser Gly Thr Ser Ala Ala85 90 95Ala Glu Val Asn Arg Gln Met Leu Gln Glu Leu Val Asn Ala Gly Cys100 105 110Asp Gln Glu Met Ala Gly Arg Ala Leu Lys Gln Thr Gly Ser Arg Ser115 120 125Ile Glu Ala Ala Leu Glu Tyr Ile Ser Lys Met Gly Tyr Leu Asp Pro130 135 140Arg Asn Glu Gln Ile Val Arg Val Ile Lys Gln Thr Ser Pro Gly Lys145 150 155 160Gly Leu Met Pro Thr Pro Val Thr Arg Arg Pro Ser Phe Glu Gly Thr165 170 175Gly Asp Ser Phe Ala Ser Tyr His Gln Leu Ser Gly Thr Pro Tyr Glu180 185 190Gly Pro Ser Phe Gly Ala Asp Gly Pro Thr Ala Leu Glu Glu Met Pro195 200 205Arg Pro Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Pro Gly Val Gly Pro His Gly Pro210 215 220Gly His Gln His Gln His Pro Pro Lys Gly Tyr Gly Ala Ser Val Glu225 230 235 240Ala Ala Gly Ala His Phe Pro Leu Gln Gly Ala His Tyr Gly Arg Pro245 250 255His Leu Leu Val Pro Gly Glu Pro Leu Gly Tyr Gly Val Gln Arg Ser260 265 270Pro Ser Phe Gln Ser Lys Thr Pro Pro Glu Thr Gly Gly Tyr Ala Ser275 280 285Leu Pro Thr Lys Gly Gln Gly Gly Pro Pro Gly Ala Gly Leu Ala Phe290 295 300Pro Pro Pro Ala Ala Gly Leu Tyr Val Pro His Pro His His Lys Gln305 310 315 320Ala Gly Pro Val Ala His Gln Leu His Val Leu Gly Ser Arg Ser Gln325 330 335Val Phe Ala Ser Asp Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Thr Pro Ser Arg340 345 350Asn Ser Leu Asn Val Asp Leu Tyr Glu Leu Ser Ser Thr Ser Val Gln355 360 365Gln Trp Pro Ala Ala Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Leu Gln Lys Pro
370 375 380Gly Leu Glu Ala Pro Pro Arg Ala His Val Ala Phe Arg Pro Asp Cys385 390 395 400Pro Val Pro Ser Arg Thr Asn Ser Phe Asn Ser His Gln Pro Arg Pro405 410 415Gly Pro Pro Gly Lys Ala Glu Pro Ser Leu Pro Ala Pro Asn Thr Val420 425 430Thr Ala Val Thr Ala Ala His Ile Leu His Pro Val Lys Ser Val Arg435 440 445Val Leu Arg Pro Glu Pro Gln Thr Ala Val Gly Pro Ser His Pro Ala450 455 460Trp Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala465 470 475 480Ala Glu Gly Leu Asp Ala Lys Glu Glu His Ala Leu Ala Leu Gly Gly785 490 495Ala Gly Ala Phe Pro Leu Asp Val Glu Tyr Gly Gly Pro Asp Arg Arg500 505 510Cys Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His Leu Leu Leu Arg Ser Lys Ser515 520 525Glu Gln Tyr Asp Leu Asp Ser Leu Cys Ala Gly Met Glu Gln Ser Leu530 353 340Arg Ala Gly Pro Asn Glu Pro Glu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Lys Ser545 550 555 560Ala Lys Gly Asp Lys Gly Gly Lys Asp Lys Lys Gln Ile Gln Thr Ser565 570 575Pro Val Pro Val Arg Lys Asn Ser Arg Asp Glu Glu Lys Arg Glu Ser580 585 590Arg Ile Lys Ser Tyr Ser Pro Tyr Ala Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln595 600 605His Val Glu Asn Val Ile Lys Thr Tyr Gln Gln Lys Val Asn Arg Arg610 615 620Leu Gln Leu Glu Gln Glu Met Ala Lys Ala Gly Leu Cys Glu Ala Glu625 630 635 640Gln Glu Gln Met Arg Lys Ile Leu Tyr Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Asn645 650 655Arg Leu Lys Arg Ala Lys Met Asp Lys Ser Met Phe Val Lys Ile Lys660 665 670Thr Leu Gly Ile Gly Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu Ala Cys Lys Val675 680 685Asp Thr His Ala Leu Tyr Ala Met Lys Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val690 695 700Leu Asn Arg Asn Gln Val Ala His Val Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu705 710 715 720Ala Glu Ala Asp Asn Glu Trp Val Val Lys Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln725 730 735Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp740 745 750Met Met Ser Leu Leu Ile Arg Met Glu Val Phe Pro Glu His Leu Ala755 760 765Arg Phe Tyr Ile Ala Glu Leu Thr Leu Ala Ile Glu Ser Val His Lys770 775 780Met Gly Phe Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp785 790 795 800Leu Asp Gly His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe805 810 815Arg Trp Thr His Asn Ser Lys Tyr Tyr Gln Lys Gly Ser His Val Arg820 825 830Gln Asp Ser Met Glu Pro Ser Asp Leu Trp Asp Asp Val Ser Asn Cys835 840 845Arg Cys Gly Asp Arg Leu Lys Thr Leu Glu Gln Arg Ala Arg Lys Gln850 855 860His Gln Arg Cys Leu Ala His Ser Leu Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile865 870 875 880Ala Pro Glu Val Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp885 890 895Trp Ser Val Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Leu Val Gly Gln Pro Pro900 905 910Phe Leu Ala Pro Thr Pro Thr Glu Thr Gln Leu Lys Val Ile Asn Trp915 920 925Glu Asn Thr Leu His Ile Pro Ala Gln Val Lys Leu Ser Pro Glu Ala
930 935 940Arg Asp Leu Ile Thr Lys Leu Cys Cys Ser Ala Asp His Arg Leu Gly945 950 955 960Arg Asn Gly Ala Asp Asp Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Ser Ala Ile965 970 975Asp Phe Ser Ser Asp Ile Arg Lys Gln Pro Ala Pro Tyr Val Pro Thr980 985 990Ile Ser His Pro Met Asp Thr Ser Asn Phe Asp Pro Val Asp Glu Glu995 10001005Ser Pro Trp Asn Asp Ala Ser Glu Gly Ser Thr Lys Ala Trp Asp Thr101010151020Leu Thr Ser Pro Asn Asn Lys His Pro Glu His Ala Phe Tyr Glu Phe1025103010351040Thr Phe Arg Arg Phe Phe Asp Asp Asn Gly Tyr Pro Phe Arg Cys Pro104510501055Lys Pro Ser Gly Ala Glu Ala Ser Gln Ala Glu Ser Ser Asp Leu Glu106010651070Ser Ser Asp Leu Val Asp Gln Thr Glu Gly Cys Gln Pro Val Tyr Val107510801085(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物M13噬菌體(xi)序列描述SEQ ID NO5gtaaaacgac ggccagt17(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源
(A)生物M13噬菌體(xi)序列描述SEQ ID NO6caggaaacag ctatgac17(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO7tccaaatatt accagaaagg gagcca 26(2)SEQ IDNO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO8gacctctggg atgatgtgt 19(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO9agaggtcttg ggcacatttc actggt 26
(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO10cctgagcacg cattttacg 19(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO11acaatggcta cccctttcg 19(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO12ttcgtaaaat gcgtgctc 18(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型DNA
(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO13cctgtttggg ttttcttggt 20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO14tcatcacctt gctcacactt ccctatta28(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO15catcaccttg ctcacacttc c 21(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人
(xi)序列描述SEQ ID NO16gtcggaaatc acagccacat catca 25(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO17ttcgtttgcg tcctaccac 19(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO18gcggcgtctt gctctg 16(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO19ctgctctggt ctcaatttaa g 21
(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物智人(xi)序列描述SEQ ID NO20caagtctgct gtgcctgtc 19(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物T7噬菌體(xi)序列描述SEQ ID NO21ctaatacgac tcactatagg ga 22(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型DNA(vi)來(lái)源(A)生物T7噬菌體(xi)序列描述SEQ ID NO22ggttttccca gtcacgacgt 20
權(quán)利要求
1.一種DNA，它具有序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示核苷酸序列。
2.一種構(gòu)成人基因的DNA，該基因的表達(dá)受生長(zhǎng)因子抑制，它具有序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列或相對(duì)于任一所述核苷酸序列有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代或增加的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)成人基因的DNA，其中生長(zhǎng)因子是人生長(zhǎng)激素或胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。
4.一種構(gòu)成人基因的DNA，該基因編碼腫瘤抑制蛋白，它具有序列表中SEQ IDNO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列或相對(duì)于任一所述核苷酸序列有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代或增加的核苷酸序列。
5.一種蛋白，它具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
6.一種蛋白，該蛋白的表達(dá)受生長(zhǎng)因子抑制，它具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列或相對(duì)于任一所述氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白，其中生長(zhǎng)因子是人生長(zhǎng)激素或胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。
8.一種腫瘤抑制蛋白，它具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列或相對(duì)于任一所述的氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列。
9.一種DNA，它包含編碼具有權(quán)利要求5-8所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
10.一種探針，它包含與權(quán)利要求1、2、3或4所述的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
11.一種探針，它包含與權(quán)利要求9所述的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
12.一種重組載體，它包括由權(quán)利要求1、2、3或4所述的核苷酸序列組成的DNA。
13.一種重組載體，它包括由權(quán)利要求9所述的核苷酸序列組成的DNA。
14.一種用作引物的DNA片段，它由權(quán)利要求1、2、3或4所述的核苷酸序列的部分序列組成。
15.一種用作引物的DNA片段，它由權(quán)利要求9所述的核苷酸序列的部分序列組成。
16.一種人用診斷性藥物制劑，它包含權(quán)利要求10所述的探針。
17.一種人用診斷性藥物制劑，它包含權(quán)利要求11所述的探針。
18.權(quán)利要求16所述的診斷性藥物制劑在侏儒癥、巨人癥、肢端肥大癥、血管病、糖尿病性腎病、或心臟病、或包括乳房癌、腎腺癌、結(jié)腸直腸癌和白血病的惡性腫瘤中用于檢查受生長(zhǎng)激素抑制的腫瘤抑制基因的表達(dá)。
19.權(quán)利要求17所述的診斷性藥物制劑在侏儒癥、巨人癥、肢端肥大癥、血管病、糖尿病性腎病、或心臟病、或包括乳房癌、腎腺癌、結(jié)腸直腸癌和白血病的惡性腫瘤中用于檢查受生長(zhǎng)激素抑制的腫瘤抑制基因表達(dá)的應(yīng)用。
20.一種抗腫瘤藥物制劑，它含有權(quán)利要求5-8之一所述的蛋白。
21.一種針對(duì)權(quán)利要求5-8之一所述的蛋白的多克隆或單克隆抗體。
22.一種診斷性藥物制劑，它含有權(quán)利要求21所述的抗體用來(lái)檢查腫瘤抑制基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人腫瘤抑制基因,它編碼腫瘤抑制蛋白,它的表達(dá)受人生長(zhǎng)激素的抑制。本發(fā)明還提供了組成該基因的DNA以及該基因編碼的蛋白。該DNA具有序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
文檔編號(hào)A61K38/27GK1263154SQ9912696
公開(kāi)日2000年8月16日 申請(qǐng)日期1999年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月25日
發(fā)明者古賀淳一, 河野惠子, F·N·佐洛塔里奧夫 申請(qǐng)人:日本化學(xué)研究株式會(huì)社