專利名稱：含有抑制trail敏化劑靶基因tip41表達(dá)或活性抑制劑的用于增強(qiáng)trail敏感性的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有TIP41表達(dá)或活性抑制劑的用于增強(qiáng)TRAIL敏感性的組合物。2.背景技術(shù) 癌癥是對人類社會(huì)威脅最大的疾??；其由細(xì)胞系突變產(chǎn)生，細(xì)胞系突變導(dǎo)致這些細(xì)胞失控、無限分裂和永生。癌癥的原因包括外部或環(huán)境因素如化學(xué)品、病毒、細(xì)菌和電離輻射，以及內(nèi)部因素如先天性基因突變(Klaunig & Kamendulis,藥理學(xué)與毒理學(xué)年評(Annu Rev Pharmacol Toxicol.)，44:239-267，2004)。早期發(fā)現(xiàn)癌癥有可能通過手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法治愈；但是它們的副作用也大大顯現(xiàn)出來，晚期癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥患者最后身患任何特別治療都無法治愈的終期病患而結(jié)束生命。隨之也發(fā)展出各種與癌癥及其治療有關(guān)的生化機(jī)理，至今還沒有徹底治愈癌癥的辦法。TRAIL(TNF 相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TNF Related apoptosis InducingLigand))是與TNF(腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor))家族有關(guān)的細(xì)胞因子,其通過激活死亡受體途徑作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的配體起作用。TRAIL有4種受體。其中已知DR4/5(死亡受體4/5)在癌細(xì)胞系中過表達(dá)，據(jù)報(bào)道DcR 1/2(誘捕受體1/2)存在于正常細(xì)胞系中。與其他受體不同，誘捕受體的C-末端沒有死亡域，因此，死亡信號(hào)未傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。因此，使用TRAIL進(jìn)行癌癥治療被認(rèn)為是對正常細(xì)胞無副作用的下一代抗癌劑。迄今為止研發(fā)的許多抗癌劑和抑癌劑已報(bào)道有副作用，如由于其非特異性而對正常細(xì)胞的臨界細(xì)胞毒性，以及由于高突變率癌細(xì)胞系產(chǎn)生的獲得性抵抗力。然而，由于1997年已報(bào)道TRAIL可誘導(dǎo)癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，TRAIL被認(rèn)為是新抗癌藥，其對癌細(xì)胞系具有特異性，也對其他對于癌癥藥物有抗性的癌細(xì)胞有特異性。但是，一些癌癥，包括乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、肺癌、肝癌和腦瘤表現(xiàn)出TRAIL抗性性，也有報(bào)道連續(xù)使用TRAIL處理癌細(xì)胞系導(dǎo)致癌細(xì)胞對TRAIL產(chǎn)生獲得性抵抗力，甚至對于那些對TRAIL敏感的細(xì)胞來說，也是如此。TRAIL抗性機(jī)制可能是由于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制而產(chǎn)生的，而由于誘捕受體的過表達(dá)，DR 4/5、DcR I和DcR 2，尤其是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)變化導(dǎo)致的抵抗力獲得被認(rèn)為是更加合理的解釋。已知信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)變化的主要原因是抗凋亡蛋白的過表達(dá)，這抑制了促凋亡蛋白的作用。因此，當(dāng)前亟需的研究領(lǐng)域是開發(fā)通過克服TRAIL抗性來增加癌細(xì)胞系特異性細(xì)胞凋亡的TRAIL敏化劑。已報(bào)道TRAIL-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑在如下疾病中起著重要的作用，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性腎病和退行性腦病以及癌癥(韓國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)雜志(Journal ofKorean Colledge of Rheumatology) 2005 年 6 月第 2 期，第 12 卷；J AM Sco Nephrol19:904-914(2008);細(xì)胞死亡和分化(Cell Death Differ.) 2003 年 I 月，10 (I) : 134-41)。因而很多方法采用TRAIL通過誘導(dǎo)過表達(dá)的免疫細(xì)胞的死亡來緩解和治療自身免疫性疾病癥狀包括關(guān)節(jié)炎。因此，TRAIL不僅可有效地用于治療上述各種癌癥,也可有效用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和I型糖尿病。TIP41基因，也稱為TIPRL(T0R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控因子樣(TOR Signaling PathwayRegulator-Like))，其首先分離自酵母。已知TIP41蛋白是TOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子，其通過與TAP42蛋白相互作用而與雷帕霉素(rapamycin)反應(yīng)(Jacinto E等人,分子細(xì)胞(Mol cell) 8 (5) :1017-26, 2001)。人TIP41基因與酵母TIP41具有37%同源性，已知其激活MAPK和NF- K B的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(MatsudaA等人，致癌基因(Oncogene)，22 (21) : 3307-3318，2003)。與酵母Tip41不同，預(yù)期人TIP41激活細(xì)胞的增殖，至今未見報(bào)道人TIP41基因在關(guān)于肝癌、胃癌或癌癥發(fā)生方面的作用。 因此，本發(fā)明人通過證明使用siRNA(小干擾RNA)對抗TIP41，通過TRAIL處理和TIP41消耗使得在TRAIL抗性癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡顯著增加，從而完成了該研究。另外，不僅在表現(xiàn)出TRAIL抗性的肝癌細(xì)胞中，也在表現(xiàn)出TRAIL抗性的肺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞中觀察到細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。此外，其效果也通過注射了抗TIP41siRNA以及TRAIL的小鼠中腫瘤變小而證實(shí)。發(fā)明概述本發(fā)明提供含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑的用于增強(qiáng)TRAIL敏感性的組合物。為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑的用于增強(qiáng)TRAIL敏感性的組合物。本發(fā)明還提供含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑的抗癌助劑。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明抗癌助劑、用于預(yù)防和治療癌癥的組合物。本發(fā)明還提供預(yù)防或治療癌癥的組合物的篩選方法。本發(fā)明還提供增強(qiáng)癌癥對TRAIL的敏感性的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用于患有TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的對象的步驟。本發(fā)明還提供預(yù)防癌癥的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用于對象的步驟。本發(fā)明還提供治療癌癥的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用于罹患癌癥的對象的步驟。本發(fā)明還提供TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑，其用于在治療TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病期間增強(qiáng)TRAIL敏感性。此外，本發(fā)明提供用作抗癌助劑的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑。當(dāng)用TIP41 SiRNA處理表現(xiàn)出TRAIL抗性的肝癌細(xì)胞系以抑制TIP41的表達(dá)后，用TRAIL處理，則誘導(dǎo)出癌細(xì)胞系的特異性細(xì)胞凋亡。同樣的效果不僅在肝癌中、也在具有TRAIL抗性的肺癌和結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)。另外，TIP41表達(dá)的消耗和TRAIL處理減小了注射有腫瘤細(xì)胞的裸鼠腫瘤大小。總之，本發(fā)明的含有TIP41表達(dá)或活性抑制劑的組合物可用于增強(qiáng)TRAIL敏感性或用作抗癌助劑。


參照所附的附圖可最佳地理解本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用，其中圖I顯示TIP41在肝癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，并證明了將TIP41siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中然后用TRAIL處理，對TIP41的抑制圖IA顯示TIP41在肝癌組織中表達(dá)增強(qiáng)；圖IB顯示通過蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)分析，不考慮HBV感染，與周圍正常細(xì)胞中的TIP41相比，TIP41在肝癌組織中表達(dá)增強(qiáng)的水平；
圖IC顯示通過將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中然后用TRAIL處理，對 TIP41表達(dá)的抑制；si-cont :對照組 siRNA ;和si-TIP41 :TIP41siRNA。圖2所示確認(rèn)了將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后用TRAIL處理，所誘導(dǎo)的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡圖2A所示為將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，通過核染色質(zhì)染色法顯示的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；si-cont :對照組 siRNA ；si-1017 TIP41 siRNA;圖2B所示為將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，采用膜聯(lián)蛋白V-FITc/PI染色法進(jìn)行FACS (熒光活化細(xì)胞分選器)分析；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；圖2C所示為將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后以與濃度相關(guān)的方式用TRAIL處理，采用膜聯(lián)蛋白V-FITc/PI染色法進(jìn)行FACS (熒光活化細(xì)胞分選器)分析；si-cont :對照組 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。圖3所示確認(rèn)了將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，促凋亡蛋白對癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的激活作用圖3A所示確認(rèn)了將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，半胱天冬酶(caSpaSe)-3、-8、-9和PARP (聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)的激活作用si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA;圖3B所示確認(rèn)了將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞液中si-cont :對照組 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。
圖4顯示JNK (Jun氨基末端激酶)途徑與接受TIP41 siRNA和TRAIL處理的Huh7肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)圖4A顯示將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，JNK途徑的激活作用si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；圖4B顯示JNK抑制劑處理減少了接受TIP41消耗和TRAIL處理的Huh7肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ； 對照溶劑(Vehicle):0. 3% 的二甲亞砜(DMSO);和SP600125:JNK 抑制劑。圖5所示表明TIP41siRNA和TRAIL處理所誘導(dǎo)的Huh7肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡與P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑無關(guān)圖5A顯示接受TIP41 siRNA和TRAIL處理的Huh7肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑無關(guān)；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ;和圖5B所示表明TIP41消耗和TRAIL處理所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與p53的存在無關(guān)。圖6顯示TIP41消耗和TRAIL受體之間并無關(guān)聯(lián)圖6A顯示TRAIL受體在各種細(xì)胞系中的表達(dá)水平；圖6B顯示接受TIP41消耗和TRAIL的Huh7肝癌細(xì)胞系中TRAIL受體的表達(dá)水平；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ;和圖6C顯示TRAIL受體的表達(dá)水平取決于肝癌組織的時(shí)期。圖7顯示TIP41消耗和TRAIL處理無法誘導(dǎo)正常HAEC (人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞中的大量細(xì)胞死亡圖7A顯示在接受與時(shí)間相關(guān)方式的TIP41消耗和TRAIL處理的HAEC細(xì)胞中，未觀察到顯著的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；圖7B顯示在接受與時(shí)間相關(guān)方式的TIP41消耗和TRAIL處理的HAEC中，細(xì)胞凋亡與促凋亡蛋白裂解沒有關(guān)聯(lián)；si-cont :對照組 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。圖8顯示在接受TIP41消耗和TRAIL處理的肺癌、結(jié)直腸癌和肝癌細(xì)胞系中細(xì)胞凋亡增加圖8A顯示與對照組siRNA相比，將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至A549肺癌細(xì)胞，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；圖8B顯示與對照組siRNA相比，將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至A549肺癌細(xì)胞，然后以與濃度或時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加；si-cont :對照組 siRNA ;和si-TIP41 TIP41 siRNA。圖8C顯示與對照組siRNA相比，將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至H印G2、SK-Hepl肝癌細(xì)胞，然后以與時(shí)間相關(guān)的方式用TRAIL處理，所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加；
si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；圖9所示為通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確認(rèn)TIP41的抗細(xì)胞凋亡作用圖9A顯示裸鼠移植了癌細(xì)胞，然后注射TIP41 siRNA和TRAIL，其腫瘤減小了 ；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ；圖9B所示為通過對裸鼠腫瘤染色顯示的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；si-cont :對照組 siRNA ；si-TIP41 TIP41 siRNA ;和圖9C所示為對溶解的裸鼠腫瘤細(xì)胞采用蛋白質(zhì)印跡法顯示半胱天冬酶-8蛋白的活性與細(xì)胞凋亡有關(guān)。圖10顯示TIP41和PP2Ac之間的相互作用；圖10A顯示在PP2Ac過表達(dá)后，用蛋白質(zhì)印跡法對TIP41和PP2Ac之間相互作用進(jìn)行分析的結(jié)果；以及圖10B所示確認(rèn)了 TIP41和PP2Ac復(fù)合體(complex)之間，以及TIP41和MKK7之間的相互作用。圖11所示確認(rèn)了 TIP41和PP2Ac復(fù)合體之間，以及TIP41和MKK7之間的相互作用圖IlA所示確認(rèn)了 MKK7過表達(dá)后，TIP41和PP2Ac復(fù)合體之間，以及TIP41和MKK7之間的相互作用；圖IlB所示為采用免疫沉淀反應(yīng)法(immunoprecipitationprocedure)確認(rèn)了TIP41和PP2Ac復(fù)合體之間，以及TIP41和MKK7之間的相互作用；以及圖IlC所示確認(rèn)了采用體外GST免疫沉淀反應(yīng)法確認(rèn)了 TIP41、PP2Ac復(fù)合體和MKK7之間的相互作用。圖12所示確認(rèn)了 TIP41與MKK7相互作用的結(jié)合位點(diǎn)圖12A顯示制備的用于確認(rèn)TIP41與MKK7相互作用結(jié)合位點(diǎn)的TIP41片段；以及圖12B采用蛋白質(zhì)印跡法顯示的TIP41與MKK7相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。圖13所示確認(rèn)了 MKK7與TIP41相互作用的結(jié)合位點(diǎn)圖13A顯示制備的用于確認(rèn)MKK7與TIP41相互作用結(jié)合位點(diǎn)的MKK7片段；以及圖13B為采用蛋白質(zhì)印跡法顯示的MKK7與TIP41相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。
圖14所示為通過MKK7與TIP41相互作用確認(rèn)的細(xì)胞凋亡途徑圖14A所示確認(rèn)對MKK7表達(dá)的抑制減少了細(xì)胞凋亡；圖14B所示表明一旦TIP41表達(dá)被抑制則MKK7/JNK途徑被激活；si-cont :對照組 siRNA ;和si_MKK7 :MKK7 siRNA。
具體實(shí)施例方式參照附圖和下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述，將更加清楚地理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)勢。首先應(yīng)注意的是，基于發(fā)明人可以恰當(dāng)?shù)囟x術(shù)語的概念以便最好地描述其發(fā)明這一原則，本發(fā)明所用的術(shù)語和詞語應(yīng)視為與本發(fā)明的技術(shù)精神相對應(yīng)的含義或概念。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明涉及的熟知功能和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述將被省略，以免不必要地模糊本發(fā)明 的重點(diǎn)。以下詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明提供一種含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑、用于增強(qiáng)TRAIL敏感性的組合物。優(yōu)選所述TIP41蛋白具有如SEQ. ID. NO: I所示的氨基酸序列，但不限于此。優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑為TRAIL敏化劑，但不限于此。優(yōu)選所述TIP41表達(dá)抑制劑選自下組之一互補(bǔ)結(jié)合TIP41基因mRNA的反義核苷酸、抗TIP41的小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA，但不限于此。優(yōu)選所述TIP41活性抑制劑選自下組之一特異性結(jié)合TIP41的化合物、肽、肽模擬物、配體、抗體和天然物質(zhì)，但不限于此。優(yōu)選所述組合物用于使用TRAIL治療癌癥、炎癥性疾病或自身免疫性疾病。優(yōu)選所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、膀胱癌、血癌、胰腺癌和任何對TRAIL有抗性的癌癥，但不限于此。進(jìn)一步地，優(yōu)選所述炎癥性疾病選自下組之一皮膚炎、過敏癥、特異反應(yīng)性、結(jié)膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃體炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、克羅恩病(Crohn’ sdisease)、結(jié)腸炎、痔瘡、痛風(fēng)、僵直性脊椎炎、風(fēng)濕熱、全身性紅斑狼瘡、纖維肌痛、銀屑病關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周圍炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥以及急性和慢性炎癥，但不限于此。進(jìn)一步地，優(yōu)選所述自身免疫性疾病選自下組之一風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、葛瑞夫茲病(Graves disease)、橋本甲狀腺炎、阿狄森病(Addison’ sdisease)、白癜風(fēng)、全身性硬化癥、肺出血腎炎綜合征、白塞病(Becet’s disease)、克羅恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板減少性紫癜、尋常性天皰瘡、糖尿病、自身免疫性貧血、冷球蛋白血癥、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)和全身性紅斑狼瘡(SLE)，但不限于此。反義核苷酸如沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對所定義,反義核苷酸與DNA的互補(bǔ)堿基對、未成熟-mRNA或成熟-mRNA結(jié)合(雜交)，并限制遺傳信息從DNA向蛋白的流動(dòng)。反義核苷酸特異性結(jié)合靶序列的特點(diǎn)尤其使得其具有多種功能。由于反義核苷酸是單體單元的長鏈，其能夠很容地針對靶RNA序列進(jìn)行合成。最近的研究證明，反義核苷酸可作為研究靶蛋白的生化工具(Rothenberg 等人,J. Natl. Cancer Inst.，81:1539-1544，1999)。在有些領(lǐng)域已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，包括表現(xiàn)出核酸酶抗性的寡核苷酸化學(xué)和核苷酸合成，改善的細(xì)胞系粘附和靶標(biāo)結(jié)合親和力，因此，反義核苷酸的用途可以看作是一種新型抑制劑。肽模擬物所述肽模擬物是抑制導(dǎo)致TIP41活化的TIP41結(jié)合域的肽或非肽。非水解型肽類似物的主要?dú)埢é耞轉(zhuǎn)角二肽核(Nagai等人，四面體通訊(TetrahedronLett) 26:647, 1985)，麗-亞甲基假妝基(Ewenson 等人，J Med chem 29:295, 1986 ；以及 Ewenson 等人，妝結(jié)構(gòu)和功能(Peptides: Structure and Function)(第 9 次美國妝學(xué)術(shù)會(huì)議文集(Proceedings of the 9th AmeriCan Peptide Symposium)) Pierce 化學(xué)公司，伊利諾伊州羅克蘭(Rockland)，1985)，吖庚因(Huffman等人，肽化學(xué)和生物學(xué)(Peptides:Chemistry and Biology), G. R. Marshall 編著，EScOM 出版社，荷蘭萊頓市(Leiden), 1988),苯二氮(Freidinger 等人，妝化學(xué)和生物學(xué)(Peptides:Chemistryand Biology), G. R. Marshall 編著，EScOM 出版社，荷蘭萊頓市(Leiden), 1988),β _氨基醇(Gordon等人，生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem Biophys Res commun) 126:4191985),以及取代的Y _內(nèi)酰胺環(huán)(Garvey等人，肽化學(xué)和生物學(xué)(Peptides:Chemistry and Biology), G. R. Marshall 編著,EScOM 出版社，荷蘭萊頓市(Leiden)，1988)。siRNA 分子正義-RNA和反義-RNA形成雙鏈RNA分子，優(yōu)選正義-RNA為siRNA，其部分包含與部分TIP41mRNA中的連續(xù)核苷酸靶序列相同的核酸序列。優(yōu)選抗TIP41的siRNA被設(shè)計(jì)為包括10-30堿基對的正義序列和互補(bǔ)結(jié)合所述正義序列的反義序列，但其并不限于此，也可以使用任何具有互補(bǔ)結(jié)合靶向TIP41基因堿基對的正義序列的雙鏈RNA分子。最優(yōu)選與正義序列具有互補(bǔ)序列的反義序列?？贵w對于TIP41抗體，可使用通過注射TIP41制備的抗體，也可以使用市售的抗體。同樣，所述抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和可結(jié)合抗原表位的片段。多克隆抗體可通過將TIP41注射到動(dòng)物體內(nèi)，并通過抽血從動(dòng)物中采集含有抗體的血清的常規(guī)方法制備。所述多克隆抗體可使用本領(lǐng)域熟知的任何方法純化，也可以從任意的動(dòng)物宿主如山羊、兔子、綿羊、猴子、馬、豬、牛或狗中制備。單克隆抗體可使用只要通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)可提供抗體分子生產(chǎn)的任何技術(shù)來制備。盡管其不限于此，所述技術(shù)可包括雜交瘤、人B-細(xì)胞雜交瘤和EBV雜交瘤(Kohler G 等人，自然(Nature) 256:495-497，1975 ；Kozbor D 等人，免疫方法雜志(J Tmmunol Methods)81:31-42，1985 ；cote RJ 等人，美國科學(xué)院院刊(ProcNatl ACad Sci) 80:2026-2030，1983 ;以及 cole SP 等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol cellBiol)62:109-120，1984)?？芍苽浜刑禺愋越Y(jié)合TIP41的位點(diǎn)的抗體片段。例如，盡管不限于此，F(xiàn)(ab’ )2片段可用胃蛋白酶降解抗體分子制備，F(xiàn)ab片段可通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵橋來制備。作為另一方法，具有所需特異性的單克隆Fab片段可通過減小Fab表達(dá)文庫的大小來快速且簡易地分離(Huse WD 等人，科學(xué)(Science) 254:1275-1281，1989)。
為簡化下列步驟如洗滌或分離復(fù)合體，所述抗體可結(jié)合至固體基質(zhì)。固體基質(zhì)的實(shí)例包括合成樹脂、硝化纖維、玻璃基質(zhì)、金屬基質(zhì)、玻璃纖維、微球和微珠。另外，合成樹脂包括聚酷、聚氣乙纟布、聚本乙纟布、聚丙纟布、PVDF和尼龍。適述適體是一種單鏈核酸(DNA、RNA或修飾的核酸)，其本身具有穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，可以高親和力和特異性結(jié)合靶分子。由于第一種適體發(fā)現(xiàn)技術(shù)的發(fā)展，即SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment))(Ellington, AD 和 Szostak, JW.，自然(Nature) 346:818-822，1990)，發(fā)現(xiàn)了許多可結(jié)合各種靶分子如低分子量有機(jī)物質(zhì)、肽和膜蛋白的適體。由于適體具有獨(dú)特的高親和力(通常為PM水平)和對靶分子的特異性，這一點(diǎn)與單克隆抗體相當(dāng)，尤其是其用作替代性抗體的可能性很高，因而適體通常被稱為“化學(xué)抗體”。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，通過免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡法確定了肝癌組織中 TIP41蛋白的過表達(dá)。同樣，在以TIP41siRNA感染的肝癌細(xì)胞系中確定了 TIP41蛋白消耗(參見圖I)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，當(dāng)用TIP41 siRNA處理Huh7肝癌細(xì)胞后，以TRAIL處理各種不同的時(shí)間，確定的結(jié)果表明通過核染色質(zhì)染色和FACS分析法證實(shí)了細(xì)胞凋亡。另夕卜，將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系后，通過TRAIL以濃度-依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ACS分析結(jié)果證實(shí)與僅用TRAIL處理相比，在用TIP41siRNA和TRAIL共處理的情況下，細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加(參見圖2)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，用TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染后，以時(shí)間-依賴的方式用TRAIL處理Huh7肝癌細(xì)胞系，觀察到蛋白激活與細(xì)胞凋亡有關(guān)，尤其確定了半胱天冬酶-3、-8、-9和聚ADP核糖聚合酶(PARP)。另外也確定了細(xì)胞色素C在細(xì)胞液中的表達(dá)，其表明的事實(shí)為通過外在途徑和內(nèi)在途徑的結(jié)合，在Huh7肝癌細(xì)胞系中發(fā)生了由TRAIL和TIP41蛋白消耗導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡(參見圖3)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系中后，用TRAIL以時(shí)間-依賴的方式處理，然后確定了 C-JunN-末端激酶(JNK)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活(activation)，由于在JNK抑制劑處理的情況下確定了通過TRAIL和TIP41蛋白消耗的細(xì)胞凋亡減少，通過這些發(fā)現(xiàn)證明JNK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在TRAIL介導(dǎo)的通過TIP41消耗的細(xì)胞凋亡中起著重要的作用(參見圖4)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，為證明通過TIP41蛋白消耗，TRAIL-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不會(huì)在正常細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是特異性地在癌細(xì)胞系中發(fā)生的事實(shí)，研究了在TIP41 siRNA和TRAIL-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中p53蛋白的作用，并觀察到在絲氨酸(ser) 15和392位的磷酸化。然而，在p53-缺陷的HCT116同基因的HCC細(xì)胞系中TIP41消耗后，用TRAIL處理以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡的細(xì)胞死亡得以證實(shí)。這表明用TRAIL處理的TIP41消耗所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與P53的存在無關(guān)(參見圖5)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，確定在肝癌和肺癌細(xì)胞系中TRAIL受體的轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果為，與正常細(xì)胞系相比TRAIL-R2(DR5)過表達(dá)。另外，TIP41消耗后，同樣地確定了肝癌細(xì)胞系中TRAIL受體表達(dá)。這表明通過TIP41消耗的細(xì)胞凋亡增加并非由于TRAIL受體表達(dá)的變化(參見圖6)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，在正常細(xì)胞系中用TIP41 siRNA和TRAIL處理后檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡，與TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染和TRAIL處理有關(guān)的細(xì)胞凋亡沒有變化，證明影響細(xì)胞凋亡的蛋白激活沒有變化。因此，siRNA TIP41轉(zhuǎn)染后確定TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡特異性發(fā)生于癌細(xì)胞(參見圖7)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，用siRNA和TRAIL處理TRAIL-抗性肺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系，通過TIP41敲除確定細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(參見圖8)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中為了通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明TIP41的功能，將肝癌細(xì)胞系移植至裸鼠后，注射TIP41 siRNA和TRAIL，確定了腫瘤大小的減小和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，與僅注射TRAIL相比，當(dāng)TIP41 siRNA和TRAIL —起注射時(shí)，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白激活甚至增強(qiáng)(參見圖9)。另外，為了確定TIP41作為TRAIL敏化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，確定了 MKK7與作為TIP41結(jié)合蛋白的PP2Ac成分，以及與PP2Ac復(fù)合體之間的相互作用(參見圖10和1 1)。更具體地，為了確定結(jié)合TIP41的MKK7的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建包括各種MKK7區(qū)的片段，并確定結(jié)合位點(diǎn)(參見圖12和13)。而且，為了確定由TIP41消耗和TRAIL處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是否由于TIP41和MKK7之間的相互作用而減少，在Huh7肝癌細(xì)胞系中實(shí)施MKK7敲除以及TIP41和TRAIL處理后，進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。在這種情況下觀察到細(xì)胞凋亡的減少。MKK7敲除明顯減少了由TIP41消耗和TRAIL處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，我們還檢驗(yàn)了是否JNK激活與TIP41消耗和TRAIL-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)(參見圖14)。因此，當(dāng)用TIP41 siRNA和TRAIL處理TRAIL-抗性肝癌細(xì)胞系后，在TRAIL抗性癌細(xì)胞如肝癌、肺癌和結(jié)直腸癌中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。另外，將TIP41 siRNA和TRAIL注射到人癌細(xì)胞系產(chǎn)生的異種移植小鼠后，觀察到癌癥組織中腫瘤大小的減小和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。因此，TIP41蛋白表達(dá)或TIP41活性抑制劑可有效地用作增強(qiáng)TRAIL敏感性的組合物中的活性成分。除了 TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑以外，所述組合物可含有一種或多種具有相同或相似功能的活性成分。所述組合物可口服或非腸道途徑施用，在非腸道途徑施用時(shí)，其可進(jìn)行腹腔內(nèi)注射、直腸內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、子宮內(nèi)注射(intrauterine dura Iinjection)、腦血管內(nèi)注射或胸廓內(nèi)注射，并可作為常規(guī)藥物形式使用。所述組合物可單獨(dú)使用或與包括手術(shù)、放射治療、激素治療、化學(xué)治療和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的方法聯(lián)用。所述組合物的日劑量為約O. OOOlg 100mg/kg,優(yōu)選O. OOlg 10mg/kg,且優(yōu)選每天施用一次或分幾次施用，其可變化范圍取決于患者的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用時(shí)間和方法、排泄速率和疾病嚴(yán)重度。在實(shí)際的臨床施用中，本發(fā)明所述組合物可作為各種非口服制劑施用；配制時(shí)其可通過使用稀釋劑或賦形劑制備，如填充劑、增量劑(extender)、粘合劑、濕潤劑、崩解劑和表面活性劑。對于非腸道制劑，其包括無菌溶液、疏水溶劑、懸浮劑、乳劑、凍干藥物和栓劑。對于疏水溶劑和懸浮溶劑，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄欖油及注射用酯如油酸乙酯。對于栓劑的基質(zhì)可使用wit印sol (飽和脂肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂酸甘油酯(Iaurin)和甘油膠凍。本發(fā)明還提供含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑的抗癌助劑。優(yōu)選所述TIP41蛋白具有如SEQ. ID. NO: I所示的氨基酸序列，盡管其不限于此。優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑為TRAIL敏化劑，盡管其不限于此。優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑為例如選自下組之一(但不限于此)互補(bǔ)結(jié)合TIP41基因mRNA的反義核苷酸、抗TIP41的小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA，盡管其不限于此。優(yōu)選所述TIP41活性抑制劑選自下組之一特異性結(jié)合TIP41的化合物、肽、肽模擬物、適體、抗體和天然物質(zhì)，但不限于此。優(yōu)選所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、膀胱癌、血癌和胰腺癌，以及任何具有TRAIL抗性的癌癥，但不限于 此。進(jìn)一步地，在所述抗癌助劑中，優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑增強(qiáng)TRAIL敏感性，但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)驗(yàn)例中，TIP41蛋白在肝癌組織中過表達(dá)(參見圖1)，與僅用TRAIL處理相比，當(dāng)將TIP41 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7肝癌細(xì)胞系且用TRAIL以不同的時(shí)間段處理后，細(xì)胞凋亡增加更多(參見圖2)。另外，為了發(fā)現(xiàn)通過TIP41 siRNA和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，檢測了半胱天冬酶_3、-8、-9和聚ADP核糖聚合酶以及JNK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白和P53蛋白的活性，與僅用TRAIL處理相比，當(dāng)用TIP41 siRNA和TRAIL 二者處理時(shí)細(xì)胞凋亡增加更多，其表現(xiàn)的細(xì)胞凋亡被確定為癌細(xì)胞系特異性細(xì)胞凋亡(參見圖3、4、5和7)。另外當(dāng)TIP41蛋白受到抑制，確定了 TRAIL受體未發(fā)生變化(參見圖6)。此外，用TIP41s iRNA和TRAIL處理肝癌以外的也具有TRAIL抗性的細(xì)胞系，確定了凋亡的細(xì)胞死亡(參見圖8)。而且，與分別注射TRAIL和TIP41 siRNA相比，共同注射TIP41 siRNA和TRAIL時(shí)異種移植裸鼠的腫瘤大小減小了。另外，也觀察到共同注射TIP41siRNA和TRAIL時(shí)，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的激活和腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡最有效。因此，當(dāng)用TIP41 siRNA和TRAIL處理具有TRAIL-抗性的肝癌細(xì)胞系時(shí)，在TRAIL抗性癌細(xì)胞如肝癌、肺癌和結(jié)直腸癌中誘導(dǎo)了癌細(xì)胞系特異性細(xì)胞凋亡，且當(dāng)將TIP41siRNA和TRAIL注射到異種移植小鼠模型中，其可有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡并減小腫瘤的大小，因此其可有效用作含有TIP41表達(dá)或活性抑制劑的抗癌助劑。除了 TIP41表達(dá)或活性抑制劑以外，所述抗癌助劑可含有一種或多種具有相同或相似功能的活性成分。所述抗癌助劑可口服或非腸道途徑施用，在非腸道途徑施用時(shí)，其可進(jìn)行腹腔內(nèi)注射、直腸內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、子宮內(nèi)注射、腦血管內(nèi)注射或胸廓內(nèi)注射，并可作為常規(guī)藥物形式使用。所述抗癌助劑可單獨(dú)使用或與包括手術(shù)、放射治療、激素治療、化學(xué)治療和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的方法聯(lián)用。所述抗癌助劑的日劑量為約O. OOOlg 100mg/kg,優(yōu)選O. OOlg 10mg/kg,且優(yōu)選每天施用一次或分幾次施用，其可變化范圍取決于患者的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用時(shí)間和方法、排泄速率和疾病嚴(yán)重度。
在實(shí)際的臨床施用中，本發(fā)明所述抗癌助劑可作為各種非口服制劑施用；配制時(shí)其可通過使用稀釋劑或賦形劑制備，如填充劑、增量劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑和表面活性齊U。對于非腸道制劑，其包括無菌溶液、疏水溶劑、懸浮劑、乳劑、凍干藥物和栓劑。對于疏水溶劑和懸浮溶劑，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄欖油及注射用酯如油酸乙酯。對于栓劑的基質(zhì)可使用wit印sol (飽和脂肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂酸甘油酯和甘油膠凍。本發(fā)明還提供一種預(yù)防和治療癌癥的組合物，其包含本發(fā)明的抗癌助劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑與TRAIL聯(lián)用時(shí)，在各種具有TRAIL抗性的癌細(xì)胞系如肝癌、肺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，癌癥特異性細(xì)胞凋亡比率增加。進(jìn)一步地，在植入癌細(xì)胞系的裸鼠模型中檢測了本發(fā)明TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑的癌癥特異性細(xì)胞凋亡體內(nèi)效果。因此，所述含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑的抗癌助劑可用作所述預(yù)防和治療癌癥的組合物的活性成分。 除了 TIP41表達(dá)或活性抑制劑以外，所述組合物可含有一種或多種具有相同或相似功能的活性成分。所述組合物可口服或非腸道途徑施用，在非腸道途徑施用時(shí)，可將所述組合物進(jìn)行腹腔內(nèi)注射、直腸內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、子宮內(nèi)注射、腦血管內(nèi)注射或胸廓內(nèi)注射，并可作為常規(guī)藥物形式使用。所述組合物可單獨(dú)使用或與包括手術(shù)、放射治療、激素治療、化學(xué)治療和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的方法聯(lián)用。所述組合物的日劑量為約O. OOOlg 100mg/kg,優(yōu)選O. OOlg 10mg/kg,且優(yōu)選每天施用一次或分幾次施用，其可變化范圍取決于患者的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用時(shí)間和方法、排泄速率和疾病嚴(yán)重度。在實(shí)際的臨床施用中，本發(fā)明所述組合物可作為各種非口服制劑施用；配制時(shí)其可通過使用稀釋劑或賦形劑制備，如填充劑、增量劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑和表面活性齊U。對于非腸道制劑，其包括無菌溶液、疏水溶劑、懸浮劑、乳劑、凍干藥物和栓劑。對于疏水溶劑和懸浮溶劑，可使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄欖油及注射用酯如油酸乙酯。對于栓劑的基質(zhì)可使用Wit印sol (飽和脂肪酸混合物甘油酯)、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂酸甘油酯和甘油膠凍。本發(fā)明還提供一種篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法。所述篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法，可優(yōu)選包括I)用樣品物質(zhì)處理癌細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組；2)測量步驟I)中TIP41與PP2Ac或TIP41與MKK7蛋白之間的結(jié)合水平；以及3)與未經(jīng)步驟I)中樣品物質(zhì)處理的對照相比，篩選出降低步驟2)中TIP41和PP2Ac或TIP41和MKK7蛋白之間結(jié)合水平的物質(zhì)，盡管其不限于此。優(yōu)選所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、結(jié)腸癌、血癌和胰腺癌，更優(yōu)選所述癌癥為肝癌、肺癌或結(jié)直腸癌，但其并不限于此；且優(yōu)選包括具有TRAIL抗性的所有癌癥，但其并不限于此。在本發(fā)明的篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法中，優(yōu)選步驟2)中所述蛋白的結(jié)合水平以選自下組之一的方法測量免疫沉淀反應(yīng)、ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)釣餌(Pull-down)分析、蛋白質(zhì)芯片、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和酵母雙雜交(Y2H)，但其并不限于此。本發(fā)明還提供一種篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法。所述篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法，可優(yōu)選包括I)用樣品物質(zhì)處理癌細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組；2)測量步驟I)中MKK7的活性；以及3)與未經(jīng)步驟I)中樣品物質(zhì)處理的對照相比，篩選出增加步驟2)中MKK7活性的 物質(zhì)，但不限于此。在本發(fā)明的篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法中，優(yōu)選步驟2)中所述MKK7蛋白的表達(dá)水平以選自下組之一的方法測量RT_PCR、ELISA、免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)印跡法和FACS，但其并不限于此。優(yōu)選所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、結(jié)腸癌、血癌和胰腺癌，更優(yōu)選所述癌癥為肝癌、肺癌或結(jié)直腸癌，但其并不限于此；且優(yōu)選包括具有TRAIL抗性的所有癌癥，但其并不限于此。本發(fā)明還提供一種篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法。所述篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法，可優(yōu)選包括I)用樣品物質(zhì)處理癌細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組；2)測量步驟I)中PP2Ac的表達(dá)水平；以及3)與未經(jīng)步驟I)中樣品物質(zhì)處理的對照相比，篩選出降低步驟2)中PP2Ac蛋白表達(dá)水平的物質(zhì)，盡管其不限于此。在本發(fā)明的篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法中，優(yōu)選步驟2)中所述PP2Ac蛋白的表達(dá)水平以選自下組之一的方法測量免疫熒光、ELISA、質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)芯片，但其并不限于此。優(yōu)選所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、結(jié)腸癌、血癌和胰腺癌，更優(yōu)選所述癌癥為肝癌、肺癌或結(jié)直腸癌，但其并不限于此；且優(yōu)選包括具有TRAIL抗性的所有癌癥，但其并不限于此。本發(fā)明還提供一種增強(qiáng)癌癥對TRAIL敏感性的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用于患有TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病對象的步驟。優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑為TRAIL敏化劑，但其并不限于此。優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑選自下組之一互補(bǔ)結(jié)合TIP41基因mRNA的反義核苷酸、短干擾RNA(SiRNA)和短發(fā)夾RNA，但其并不限于此。優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑選自下組之一特異性結(jié)合TIP41的化合物、肽、肽模擬物、適體、抗體和天然物質(zhì)，但其并不限于此。所述TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病為癌癥、炎癥性疾病或自身免疫性疾病，但其并不限于此。優(yōu)選所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、膀胱癌、血癌和胰腺癌，但不限于此。進(jìn)一步地，優(yōu)選所述炎癥性疾病選自下組之一皮膚炎、過敏癥、特異反應(yīng)性、結(jié)膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃體炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、克羅恩病、結(jié)腸炎、痔瘡、痛風(fēng)、僵直性脊椎炎、風(fēng)濕熱、全身性紅斑狼瘡、纖維肌痛、銀屑病關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周圍炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥以及急性和慢性炎癥，但不限于此。進(jìn)一步地，優(yōu)選所述自身免疫性疾病選自下組之一風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、葛瑞夫茲病、橋本甲狀腺炎、阿狄森病、白癜風(fēng)、全身性硬化癥、肺出血腎炎綜合征、白塞病、克羅恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板減少性紫癜、尋常性天皰瘡、糖尿病、自身免疫性貧血、冷球蛋白血癥、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)和全身性紅斑狼瘡(SLE)，但不限于此。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑與TRAIL聯(lián)用時(shí)，在各種具有TRAIL抗性的癌細(xì)胞系如肝癌、肺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，癌癥特異性細(xì)胞凋亡比率增加。進(jìn)一步地，在植入腫瘤的裸鼠模型中檢測了本發(fā)明TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑的癌癥特異性細(xì)胞凋亡體內(nèi)效果。因此，本發(fā)明的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑可有效地用于增強(qiáng)TRAIL敏感性。 本發(fā)明還提供一種預(yù)防癌癥的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用到對象的步驟。本發(fā)明還提供一種治療癌癥的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用到患有癌癥的對象的步驟。優(yōu)選所述對象為脊椎動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為包括小鼠、兔、豚鼠、倉鼠、狗、貓的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，最優(yōu)選為包括黑猩猩或大猩猩的類人猿動(dòng)物。所述藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑可根據(jù)各種因素如給藥方法、靶向部位或患者狀況而變化。因此，所述施用量在用于人體時(shí)應(yīng)該考慮到穩(wěn)定性和效率而恰當(dāng)?shù)卮_定。所述藥學(xué)上有效量的給藥量也可在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中估測然后調(diào)整用于人類。關(guān)于確定藥學(xué)上有效量的給藥量要考慮的因素的信息，可參見Hardman和Limbird編著，古德曼和吉爾曼的治療學(xué)藥物基礎(chǔ)(Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics),第 10 版(2001)，拍蓋蒙出版社(Pergamon Press);以及 E. W. Martin 編著,雷明頓藥物科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第 18 版(1990),麥克出版公司(Mack Publishing Co.)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑可包括通常用于生物藥物制劑中的載體、賦形劑、稀釋劑，或上述兩者或更多的組合。所述藥用載體沒有嚴(yán)格的限制，條件是所述載體適合將TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑蛋白遞送到體內(nèi)。作為實(shí)例，所述載體可包括在默克索引(Merck Index),第13版,默克公司(Merck & Co. Inc)公開的化合物的混合物、鹽溶液、無菌水、林格氏(Ringer’s)溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇或上述一種或以上的混合物。根據(jù)需要，所述載體可以和其他常用添加劑包括抗氧化劑、緩沖液或抑真菌劑一起加入。進(jìn)一步地，可另外加入稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑劑以制備包括水溶液、懸浮液或乳液、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑的劑型。此夕卜，可使用已知方法或雷明頓藥物科學(xué)(麥克出版公司，賓夕法尼亞州伊斯頓，第18版，1990)公開的方法根據(jù)疾病或成分而制備合適的劑型。本發(fā)明TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑可另外包括一種或多種具有相同或相似功能的有效成分。相對于藥物組合物的總重量，本發(fā)明藥物組合物包括O. OOOf 10wt%的所述蛋白，優(yōu)選包括O. 001 lwt%的所述蛋白。根據(jù)不同目的，本發(fā)明TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑可為非經(jīng)口給藥(如靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射或局部應(yīng)用)或經(jīng)口給藥。進(jìn)一步地，所述給藥量可根據(jù)患者的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥時(shí)間和方法、排泄速率和疾病嚴(yán)重度而變化。本發(fā)明藥物組合物每日給藥量的范圍為O. 001 μ g 10mg/kg，優(yōu)選為O. 01 μ g 10mg/kg，且優(yōu)選將每日一次給藥分為每日多次給藥。本發(fā)明還提供在治療TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病期間，用于增強(qiáng)TRAIL敏感性的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑。此外本發(fā)明提供用作抗癌助劑的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑。優(yōu)選所述TIP41蛋白具有如SEQ. ID. NO: I所示的氨基酸序列，但不限于此。
優(yōu)選所述TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑為TRAIL敏化劑，但不限于此。優(yōu)選所述TIP41表達(dá)抑制劑選自下組之一互補(bǔ)結(jié)合TIP41基因mRNA的反義核苷酸、抗TIP41的小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA，但不限于此。優(yōu)選所述TIP41活性抑制劑選自下組之一特異性結(jié)合TIP41的化合物、肽、肽模擬物、適體、抗體和天然物質(zhì)，但不限于此。所述TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病為癌癥、炎癥性疾病或自身免疫性疾病，但不限于此。優(yōu)選所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、膀胱癌、血癌、胰腺癌和具有TRAIL抗性的任何癌癥，但不限于此。進(jìn)一步地，優(yōu)選所述炎癥性疾病選自下組之一皮膚炎、過敏癥、特異反應(yīng)性、結(jié)膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃體炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、克羅恩病、結(jié)腸炎、痔瘡、痛風(fēng)、僵直性脊椎炎、風(fēng)濕熱、全身性紅斑狼瘡、纖維肌痛、銀屑病關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周圍炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥以及急性和慢性炎癥，但不限于此。進(jìn)一步地，優(yōu)選所述自身免疫性疾病選自下組之一風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、葛瑞夫茲病、橋本甲狀腺炎、阿狄森病、白癜風(fēng)、全身性硬化癥、肺出血腎炎綜合征、白塞病、克羅恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板減少性紫癜、尋常性天皰瘡、糖尿病、自身免疫性貧血、冷球蛋白血癥、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)和全身性紅斑狼瘡(SLE)，但不限于此。以下將結(jié)合實(shí)驗(yàn)例和制備例詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，下列實(shí)驗(yàn)例和制備例僅用于說明本發(fā)明的目的，本發(fā)明并不限于下列實(shí)驗(yàn)例和制備例。<實(shí)驗(yàn)例1>確認(rèn)肝癌和肺癌組織中TIP41蛋白的表達(dá)〈1-1>用免疫染色確認(rèn)TIP41表達(dá)將肝癌患者的組織(忠南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，Kim, Jin-Man教授)用約10%中性福爾馬林溶液固定，加入石蠟并切成約5μπι厚的切片。將所述切片用約IOmM的抗壞血酸緩沖液(ΡΗ6. O)處理約4分鐘，置于含有約3%過氧化氫(H2O2)的約O. IM Tris-緩沖鹽溶液(TBS, ρΗ7. 4)中約30分鐘。將所述切片用蛋白封閉液(DAKO)于室溫下處理約20分鐘，并與抗-ΤΙΡ41抗體反應(yīng)30分鐘。用O. IM TBST (含有O. 01%吐溫20的O. IM TBS)洗滌后，使所述切片與nVision抗兔聚合物(DAKO)反應(yīng)30分鐘。通過與3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)色原體基質(zhì)溶液(DAKO)反應(yīng)可以觀察到該過氧化物酶-結(jié)合抗體。在顯微鏡下觀察，適當(dāng)染色后用O. IM TBS洗滌以結(jié)束反應(yīng)，用奧林巴斯(Olympus)BX51顯微鏡(奧林巴斯，日本)觀察，用奧林巴斯DP 70照相機(jī)(奧林巴斯，日本)成像。結(jié)果，與正常區(qū)域相比，觀察到肝癌組織腫瘤區(qū)域的TIP41過表達(dá)(圖1A)。另外與肝癌和肺癌患者的周圍正常組織(忠南大學(xué)Kim，Jin-Man教授的研究組提供)相比，這些患者癌癥組織中的TIP41蛋白過表達(dá)(表I和2)。TIP41表達(dá)和癌癥階段之間的相關(guān)分析表明，TIP41陽性表達(dá)與NSCLC的較高階段顯著相關(guān)，肺癌(P=O. 045)，表明了 TIP41表達(dá)與NSCLC級(jí)數(shù)的相關(guān)性(表2)。這些數(shù)據(jù)顯示在HCC和NSCLC細(xì)胞中TIP41表達(dá)是高度過表達(dá)。表I肝癌(HCC)臨床組織中的TIP41表達(dá)水平(IHC法)
權(quán)利要求
1.一種組合物，其含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑，用于增強(qiáng)TRAIL敏感性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述TIP41蛋白具有如SEQ.ID. NO: I所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述TIP41蛋白表達(dá)抑制劑選自下組之一互補(bǔ)結(jié)合TIP41基因mRNA的反義核苷酸、短干擾RNA和短發(fā)夾RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述TIP41蛋白活性抑制劑選自下組之一特異性結(jié)合TIP41蛋白的化合物、肽、肽模擬物、適體、抗體和天然物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述組合物用于治療癌癥、炎癥性疾病或自身免疫性疾病。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、膀胱癌、血癌和胰腺癌。
7.一種抗癌助劑，其含有TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗癌助劑，其中所述TIP41蛋白具有如SEQ.ID. NO: I所示的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗癌助劑，其中所述TIP41蛋白表達(dá)抑制劑選自下組之一互補(bǔ)結(jié)合TIP41基因mRNA的反義核苷酸、短干擾RNA和短發(fā)夾RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗癌助劑，其中所述TIP41蛋白活性抑制劑選自下組之一特異性結(jié)合TIP41蛋白的化合物、肽、肽模擬物、適體、抗體和天然物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗癌助劑，其中所述癌癥選自下組肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、膀胱癌、血癌和胰腺癌。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗癌助劑，其中所述TIP41蛋白活性抑制劑增強(qiáng)TRAIL(TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體)敏感性。
13.一種預(yù)防和治療癌癥的組合物，其包含權(quán)利要求7-12任一項(xiàng)所述的抗癌助劑。
14.一種篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法，其包括 1)用樣品物質(zhì)處理癌細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組； 2)測量步驟I)中TIP41與PP2Ac或MKK7蛋白之間的結(jié)合水平；以及 3)與未經(jīng)步驟I)中樣品物質(zhì)處理的對照比較，篩選出降低步驟2)中TIP41和PP2Ac或TIP41和MKK7蛋白之間結(jié)合水平的物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述癌細(xì)胞系為TRAIL-抗性癌細(xì)胞系。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中步驟2)中蛋白的結(jié)合水平通過選自下組的方法之一測量免疫沉淀反應(yīng)、ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)釣餌(Pull-down)分析、蛋白質(zhì)芯片、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和酵母雙雜交(Y2H)。
17.—種篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法，其包括 1)用樣品物質(zhì)處理癌細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組； 2)測量步驟I)中MKK7的活性；以及 3)與未經(jīng)步驟I)中樣品物質(zhì)處理的對照比較，篩選出增強(qiáng)步驟2)中MKK7蛋白活性的物質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述癌細(xì)胞系為TRAIL-抗性癌細(xì)胞系。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟2)中MKK7的活性通過選自下組的方法之一測量免疫熒光、ELISA、質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)芯片。
20.一種篩選預(yù)防或治療癌癥的組合物的方法，其包括 1)用樣品物質(zhì)處理癌細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組； 2)測量步驟I)中PP2Ac的表達(dá)水平；以及 3)與未經(jīng)步驟I)中樣品物質(zhì)處理的對照比較，篩選出降低步驟2)中PP2Ac蛋白表達(dá)水平的物質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述癌細(xì)胞系為TRAIL-抗性癌細(xì)胞系。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中步驟2)中PP2Ac的表達(dá)水平通過選自下組的方法之一測量RT_PCR、ELISA、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡法和FACS。
23.一種增強(qiáng)癌癥對TRAIL的敏感性的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用于患有TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的對象的步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病為癌癥、炎癥性疾病或自身免疫性疾病。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述癌癥選自下組之一肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腎癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、肺癌、子宮癌、膀胱癌、血癌和胰腺癌。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述炎癥性疾病選自下組之一皮膚炎、過敏癥、特異反應(yīng)性、結(jié)膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃體炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、克羅恩病、結(jié)腸炎、痔瘡、痛風(fēng)、僵直性脊椎炎、風(fēng)濕熱、全身性紅斑狼瘡、纖維肌痛、銀屑病關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)炎、腱炎、肌腱炎、腱鞘炎、腱周圍炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥以及急性和慢性炎癥。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述自身免疫性疾病選自下組之一風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、葛瑞夫茲病、橋本甲狀腺炎、阿狄森病、白癜風(fēng)、全身性硬化癥、肺出血腎炎綜合征、白塞病、克羅恩病、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、血小板減少性紫癜、尋常性天皰瘡、糖尿病、自身免疫性貧血、冷球蛋白血癥、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)和全身性紅斑狼瘡(SLE)。
28.一種預(yù)防癌癥的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用于對象的步驟。
29.一種治療癌癥的方法，其包括將藥學(xué)上有效量的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑施用于患有癌癥的對象的步驟。
30.一種TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑，其在治療TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病過程中用于增強(qiáng)TRAIL敏感性。
31.一種用作抗癌助劑的TIP41蛋白表達(dá)或活性抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)TRAIL敏感性的組合物，其含有用于抑制TIP41蛋白表達(dá)或活性的抑制劑。更具體地，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)用TIP41siRNA和TRAIL處理具有TRAIL抗性的肝癌細(xì)胞系后，誘導(dǎo)了癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡，且不僅在肝癌中而且在具有TRAIL抗性的肺癌和結(jié)腸癌中均誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，并且通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤的大小減小且癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)，由此誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由于抑制TIP41表達(dá)而激活MKK7/JNK傳遞途徑導(dǎo)致的。因此，本發(fā)明含有用于抑制TIP41蛋白表達(dá)或活性的抑制劑的組合物可有效地用于預(yù)防和治療癌癥或作為抗癌助劑。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102821778SQ201180015006
公開日2012年12月12日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者金南順, 宋寅成, 金哲熙, 河佳喜, 金晛宅, 鄭昭泳, 金楨珉, 金柱憲, 金鎮(zhèn)萬, 全修英 申請人:韓國生命工學(xué)研究院