專利名稱：Dpys12基因在制備抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Dpysl2基因在制備抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)控制著生物個體的感覺、認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶等多種機(jī)能，神經(jīng)系統(tǒng)的 功能失調(diào)特別是神經(jīng)退行性疾病(如Alzheimer's disease, Parkinson's disease )目前 在人群中有著較高的發(fā)病比例，嚴(yán)重的威脅著人類健康。利用干細(xì)胞技術(shù)將胚胎干 細(xì)胞分化為功能性的神經(jīng)細(xì)胞為治療神經(jīng)退行性疾病提供了希望(Lee, J. P., M. Jeyakumar， et al. (2007). "Stem cells actthrough multiple mechanisms to benefit mice with neurodegenerative metabolic disease." Nat Med 13(4): 439-47 )。
神經(jīng)發(fā)生(Neurogenesis)是胚胎發(fā)育早期的重要事件，受到多種信號通路(如 FGF， BMPs， Wnt等)、多個基因在時間和空間上的精確調(diào)控。盡管近年來成體神 經(jīng)系統(tǒng)中也被發(fā)現(xiàn)存在神經(jīng)發(fā)生過程，但胚胎期的早期神經(jīng)發(fā)生仍在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā) 育中起主導(dǎo)作用。究竟哪些基因/蛋白參與了胚胎期的神經(jīng)發(fā)生已成為該領(lǐng)域的研究 熱點(diǎn)，其研究成果將對治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供直接或間接的藥物靶點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞 因具有發(fā)育的全能性因此可以通過體外誘導(dǎo)分化進(jìn)而形成神經(jīng)細(xì)胞，該體系為尋找 神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)因子提供了合適的研究模型。
Dpysl2 (也稱DRP2、 Crmp2、 Ulip2)是一個在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的基因，研究 表明其在Semaphrorin3A介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞軸突生長及導(dǎo)向過程中起作用，在生長錐 塌陷(growth cone collapse)過程中還可通過調(diào)控微管系統(tǒng)的組裝及Numb蛋白介導(dǎo) 的內(nèi)吞過程中起作用(Fukata, Y., T. J. Itoh, et al. (2002). "CRMP-2 binds to tubulin heterodimers to promote microtubule assembly." Nat Cell Biol 4(8): 583-91; Nishimura， T., Y. Fukata， et al. (2003). "CRMP-2 regulates polarized Numb-mediated endoeytosis for axon growth." Nat Cell Biol 5(9): 819-26)。近來的研究還表明外周T淋巴細(xì)胞中 Dpysl2的高表達(dá)與病毒引起的神經(jīng)感染相關(guān)(Vuaillat, C., M. Varrin-Doyer， et al. (2008). "High CRMP2 expression in peripheral T lymphocytes is associated with recruitment to the brain during virus-induced neuroinflammation." J Neuroimmunol 193(1-2): 38-51)，并且該基因表達(dá)蛋白的超磷酸化是AD及某些腫瘤的表征(Cole， A. R., W. Noble, et al. (2007). "Collapsin response mediator protein-2 hyperphosphorylation is an early event in Alzheimer's disease progression." J Neurochem
103(3): 1132-44),其單核苷酸多態(tài)性(SNP)更是與精神分裂癥(schizophrenia) 相關(guān)(Nakata, K., H. Ujike, et al. (2003). "The human dihydropyrimidinase-related protein 2 gene on chromosome 8p21 is associated with paranoid-type schizophrenia." Biol Psychiatry 53(7): 571-6)。但迄今為止，該基因/蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能尚未完全揭 示，目前研究多集中在特定的神經(jīng)系統(tǒng)中，對于其在胚胎期的神經(jīng)發(fā)生的過程中的 作用尚不明確。
胚胎干細(xì)胞是從早期胚胎中分離出來的具有分化成個體所有組織和細(xì)胞潛能的 多能性干細(xì)胞，在體外通過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)分化，可形成不同胚層的多個類型的細(xì)胞。 利用胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化已成為研究神經(jīng)發(fā)生的分子機(jī)制的良好研究模型并 且如何提高由胚胎干細(xì)胞向特定功能性神經(jīng)細(xì)胞分化的能力與效率已成為治療神經(jīng) 系統(tǒng)疾病的一個重要議題之一。2003年，Austin Smith領(lǐng)導(dǎo)的研究小組建立了無血 清單層貼壁培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞成為Soxl陽性神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，這些神經(jīng)前體 細(xì)胞可進(jìn)一步被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，操作簡捷且誘導(dǎo)效率高等特點(diǎn) 使該方法成為了研究早期神經(jīng)分化的良好系統(tǒng)(Ying, Q. L., M. Stavridis， et al. (2 003). "Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adhe rent monoculture." Nat Biotechnol 21(2): 183-6)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供Dpys12基因在制備抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的Dpysl2基因在制備抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用， 即可表達(dá)Dpysl2基因的小干擾RNA的真核表達(dá)載體或Dpysl2基因的小干擾RNA 在制備抑制早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用；可表達(dá)Dpys12基因的的真核表達(dá)載體在 制備促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。
所述抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生為抑制或促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化。 所述抑制早期神經(jīng)發(fā)生的藥物以可表達(dá)Dpysl2基因的小干擾RNA的真核表達(dá) 載體為有效成分。
所述小干擾RNA為對應(yīng)靶標(biāo)序列為序列表中序列1的DNA序列的小干擾RNA 和/或靶標(biāo)序列為序列表中序列2的DNA序列的小干擾RNA。所述靶標(biāo)序列為序列 表中序列1的DNA序列的小干擾RNA的編碼序列為序列表中序列3所示的核苷酸 序列；所述靶標(biāo)序列為序列表中序列2的DNA序列的小干擾RNA的編碼序列為序 列表中序列4所示的核苷酸序列。
所述可表達(dá)Dpysl2基因的小干擾RNA的真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為p113.7。
所述促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物以可表達(dá)Dpysl2基因的真核表達(dá)載體為有效成分。
本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)Dpysl2基因的表達(dá)可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分 化，通過Dpysl2基因的過表達(dá)或者利用Dpysl2小干擾RNA干擾Dpysl2表達(dá)活性可 促進(jìn)或抑制胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的效率，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究和治療 提供重要的基礎(chǔ)。通過抑制Dpysl2來抑制早期神經(jīng)分化，可以作為神經(jīng)系統(tǒng)以外干 細(xì)胞移植治療中的藥物靶點(diǎn)之一，使移植的干細(xì)胞避免向神經(jīng)細(xì)胞分化從而增加目 的分化細(xì)胞的純度，從而增強(qiáng)治療效果。本發(fā)明提供的Dpysl2小干擾RNAi載體可 作為抑制離體胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的藥物，為研究早期神經(jīng)分化機(jī)制的 科學(xué)研究提供生物材料。


圖1為Dpysl2基因在小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化過程中的表達(dá)檢測 圖2為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dpysl2基因RNA干涉載體的胚胎干細(xì)胞細(xì)胞株的建立 圖3為Dpysl2 RNAi抑制胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞的分化
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法 實施例l、基因Dpysl2在促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生中的應(yīng)用
一、利用胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化體系檢測Dpysl2基因在早期神經(jīng)發(fā)生 過程中的表達(dá)情況
利用由胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的體系，以Soxl和Nestin為神經(jīng)前體細(xì) 胞的標(biāo)志基因，探討了Dpysl2基因在神經(jīng)分化過程中的表達(dá)情況。以小鼠胚胎干細(xì) 胞系R1 (可通過ATCC組織購得，ATCC Number: SCRC-1036 )按照文獻(xiàn)(Yi ng, Q. L., M. Stavridis, et al. (2003). "Conversion of embryonic stem cells into ne uroectodermal precursors in adherent monoculture." Nat Biotechnol 21(2): 183-6)報 道的方法進(jìn)行神經(jīng)分化，用Soxl和nestin為標(biāo)志蛋白和神經(jīng)前體分化的情況，具體 方法如下所述
1)在小鼠胚胎干細(xì)胞系R1神經(jīng)分化的第1， 3， 5天(將開始更換無血清誘導(dǎo) 分化培養(yǎng)基的時間記為0天)分別提取分化細(xì)胞的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用 Real-Time PCR檢測Soxl (GenBank Number, GI:164663796)(神經(jīng)前體細(xì)胞分子 標(biāo)記之一)的表達(dá)情況，Real-Time PCR弓I物序歹U為F1:5'-TTACTTCCCGCCAGCT CTTC-3'， R1: 5'-TGATGCATTTTGGGGGTATCTCTC-3'。以未進(jìn)行神經(jīng)分化小鼠胚
胎干細(xì)胞系Rl進(jìn)行如上相同的Real-Time PCR結(jié)果作為對照(圖1中A中的ES)。 結(jié)果如圖1中的A所示，結(jié)果表明，小鼠胚胎干細(xì)胞系R1神經(jīng)分化天數(shù)增加，Sox 1的表達(dá)量也不斷增加。而對照的Soxl的表達(dá)量最低，表明神經(jīng)前體分化過程成功。 圖1中A的ld、 3d、和5d分別為Real-time PCR檢測小鼠胚胎干細(xì)胞系Rl分化1 、 3、和5天神經(jīng)前體標(biāo)志基因Soxl的表達(dá)。
2) 同時在小鼠胚胎干細(xì)胞系Rl神經(jīng)分化第5天通過免疫熒光技術(shù)用鼠抗Nest in (神經(jīng)前體細(xì)胞分子標(biāo)記之一)的抗體(Chemicon International公司購得)檢測N estin的表達(dá)情況。具體方法為將六孔板中培養(yǎng)的神經(jīng)分化第5天的小鼠胚胎干細(xì) 胞系Rl細(xì)胞先用pH為7.4的PBS緩沖液潤洗一遍，之后用濃度為0.4g/L的多聚甲 醛溶液交聯(lián)20分鐘，然后依次用pH為7.4的PBS潤洗，0.2g/L的Triton-X-100溶 液處理5分鐘，用濃度為0.3g/L的BSA溶液處理20分鐘， 一抗(抗nestin抗體， 購自Chemicon International公司，使用濃度按抗體說明書)染1小時，熒光二抗(F ITC抗兔二抗，購自Jackson ImmunoResearch公司，使用濃度按抗體說明書)染l 小時，洗去未結(jié)合抗體后用封片劑及蓋玻片封片并在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖1 中B所示，結(jié)果表明，神經(jīng)分化第5天的細(xì)胞有明顯的Nestin抗原表達(dá)，神經(jīng)前體 分化過程成功。圖1中B中左側(cè)為細(xì)胞在明視野下的圖像，右側(cè)為相同細(xì)胞在經(jīng)抗 Nestin抗體進(jìn)行免疫熒光染色后所顯示的熒光信號圖像。
3) 通過Real-time PCR檢測Dpysl2基因(GenBank Number, GI: 162287190) 在未分化小鼠胚胎干細(xì)胞系R1 (圖1中C中的ES)及小鼠胚胎干細(xì)胞系Rl神經(jīng)分 化第l， 3， 5天時的表達(dá)情況，引物序列為F2: 5'-CAGAATGGTGATTCCCGGAG G-3', R2: 5'-CAGCCAATAGGCTCGTCCC-3'。 Real-time PCR檢測小鼠胚胎干細(xì) 胞系R1分化1、 3、和5天Dpysl2基因的表達(dá)分別如圖l中C的ld、 3d、和5d所 示。
上述實驗結(jié)果表明，將上述小鼠胚胎干細(xì)胞系R1向神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過 程中Soxl (圖1中A)和Nestin (圖1中B)表達(dá)量增加，結(jié)果表明胚胎干細(xì)胞已 經(jīng)成功向神經(jīng)前體細(xì)胞分化；在此分化過程中Dpysl2基因的表達(dá)量不斷增高(圖1 中C)，表明Dpysl2基因可能作為早期神經(jīng)發(fā)生中的一個效應(yīng)因子調(diào)控該生理過程。 圖1中A為Real-time PCR檢測分化不同時期(天數(shù))神經(jīng)前體標(biāo)志基因Soxl的表 達(dá)；B為免疫熒光染色檢測分化第5天神經(jīng)前體標(biāo)志基因nestin的表達(dá)；C為神經(jīng)分 化過程中不同時期(天數(shù))Dpysl2基因的表達(dá)變化。
二、 Dpysl2基因的RNA干擾(RNAi)表達(dá)載體在胚胎千細(xì)胞中表達(dá)
1、 Dpysl2基因的RNA干擾(RNAi)表達(dá)載體的構(gòu)建
按照文獻(xiàn)(Mimura, F.， S. Yamagishi， et al. (2006). "Myelin-associated glycopr otein inhibits microtubule assembly by a Rho誦kinase-dependent mechanism." J Biol Chem 281(23): 15970-9; Vincent, P., Y. Collette, et al. (2005). "A role for the n euronal protein collapsin response mediator protein 2 in T lymphocyte polarization and migration." J Immunol 175(11): 7650-60)合成兩個耙向Dpysl2基因的RNAi序 列，以排除RNAi方法上的潛在脫靶效應(yīng)，并將其裝入帶有嘌呤霉素抗性的RNAi 表達(dá)載體pU3.7構(gòu)建得到Dpysl2基因(GenBank Number, GI: 162287190)的RNA i表達(dá)載體，Dpysl2基因的RNAi表達(dá)載體具體構(gòu)建方法為
1) Dpysl2基因的siRNA (小干擾RNA)的編碼基因的合成 直接合成引物F3和R3 (上海生工公司)，F(xiàn)3和R3為互補(bǔ)序列，基因(GenB
ank Number, GI: 1622871卯)小干擾RNA (命名為siRNAl)的編碼序列；
正向弓I物F3: 5' -TGATGGGTTGATCAAGCAAATTCAAGAGATTTGCTTGAT CAACCCATCTTTTTTC-3，(序列表中序列3);反向引物R3: 5， -TCGAGAAA
3' c
該互補(bǔ)序列最終翻譯得到的小干擾RNA序列對應(yīng)的耙標(biāo)Dpysl2序列為5'-GATGGGTTGATCAAGCAAA-3，(序列表中序列l(wèi))。
直接合成引物F4和R4 (上海生工公司)，F(xiàn)4和R4為互補(bǔ)序列，基因(GenB ank Number, GI: 162287190)小干擾RNA (命名為siRNA2)的編碼序列
正向弓I物F1: -5' -TACTCCTTCCTCGTGTACATTTCAAGAGAATGTACACG AGGAAGGAGTTTTTTTC-3，(序列表中序列4);反向引物R4: 5， - TCGAG
A國3'。
該互補(bǔ)序列最終翻譯得到的小干擾RNA序列對應(yīng)的靶標(biāo)Dpysl2序列為5'-ACTCCTTCCTCGTGTACAT國3，(序歹iJ表中序歹U 2)。
2) Dpysl2基因的RNA干擾(RNAi)表達(dá)載體的構(gòu)建
首先將步驟l)所示的合成好的RNA干擾引物F3和R3， F4和R4分別退火， 分別形成互補(bǔ)配對的雙鏈DNA， F3/R3， F4/R4退火形成的雙鏈DNA都包括一個X hol酶切位點(diǎn)和一個平末端，以備和酶切后的RNA干擾表達(dá)進(jìn)行連接。
將RNA干擾表達(dá)載體p113.7 (可通過http://www.addgene.org/獲得)用^Tzo1和// pal進(jìn)行酶切后，分別與上述得到的F3/R3或F4/R4退火形成的雙鏈DNA連接，分 別得到可表達(dá)siRNAl或siRNA2的重組表達(dá)載體，用Xhol和Xbal雙酶切鑒定后測
序確認(rèn)插入片段是否正確。將驗證表明正確的可表達(dá)siRNAl重組表達(dá)載體命名為D pysl2-siRNAl，將驗證表明正確的可表達(dá)siRNAl重組表達(dá)載體命名為Dpysl2-siRN A2。
2、 Dpysl2基因表達(dá)量被穩(wěn)定下調(diào)的胚胎干細(xì)胞株的獲得
將Dpysl2基因的RNAi表達(dá)載體Dpysl2-siRNAl或Dpysl2-siRNA2分別用脂質(zhì) 體Lipofectamine2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染到Rl胚胎干細(xì)胞系，對于六孔板中培養(yǎng)的R l細(xì)胞，每孔細(xì)胞用8ul脂質(zhì)體和4ug質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染過程按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。轉(zhuǎn) 染48小時后將細(xì)胞按照1: 3比例傳代，并在24小時后更換含有l(wèi)pg/ml嘌呤霉素 的干細(xì)胞培養(yǎng)液篩選約10天得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株或Dpysl2-siRN A2細(xì)胞株。
同時篩選以靶向熒光素酶(Luciferase)蛋白序列的RNAi穩(wěn)定細(xì)胞株作為對照。 具體方法如下所述合成對照小干擾RNA的編碼序列:正向引物5-TGCGACCAAC GCCTTGATTGTTCAAGAGACAATCAAGGCGTTGGTCGCTTTTTTC-3;反向弓I物
TGGTCGCA-3
該正向引物序列和反向引物序列為互補(bǔ)序列為對照小干擾RNA的編碼序列，該 序列編碼的小干擾RNA的靶向序列為5， -GCGACCAACGCCTTGATTG-3'。
將合成得到的編碼序列(上述正向引物和反向引物)退火得到雙鏈DNA，然后 將該DNA插入到p113. 7的Hapl和Xhol酶切位點(diǎn)之間得到重組載體，將該重組載 體進(jìn)行酶切和測序鑒定，將鑒定表明含有上述對照小干擾RNA的編碼序列的重組載 體命名為Control-RNAi質(zhì)粒。
將Control-RNAi質(zhì)粒用脂質(zhì)體Lipofectamine2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染到Rl胚胎 干細(xì)胞系，用lpg/ml嘌呤霉素的干細(xì)胞培養(yǎng)液篩選約IO天后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對照 細(xì)胞株。
用Real-time PCR方法檢測Dpysl2基因在轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株或Dpysl2 -siRNA2細(xì)胞株中的RNAi效果，具體方法為將培養(yǎng)中的對照細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株或Dpysl2-siRNA2細(xì)胞株分別用Trizol (Invitrogen)處理并提取RN A，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后按照步驟一的步驟3)的方法檢測Dpysl2基因的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果用AACt法(Livak， K. J. and T. D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-8.)處理后得到相對mRNA的表達(dá)量。
結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株(圖2中的Dl-RNAi) 和Dpysl2-siRNA2細(xì)胞株(圖2中的D2-RNAi) ， Dpysl2基因表達(dá)量比對照細(xì)胞株 (圖2中的ctrl-RNAi)明顯降低，該轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株(圖2中的D1-RN Ai)和Dpysl2-siRNA2細(xì)胞株(圖2中的D2-RNAi)即為受到Dpysl2基因的小干擾 RNA干擾后Dpysl2基因表達(dá)量降低的細(xì)胞株。圖2中，Dl-RNAi和D2-RNAi分別 為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 Dpysl2-siRNAl的細(xì)胞株和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 Dpysl2-siRNA2的細(xì)胞株；Ctr l-RNAi為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 Control-RNAi質(zhì)粒的細(xì)胞株。
3、 Dpysl2穩(wěn)定RNAi后對神經(jīng)前體細(xì)胞分化的影響
將上述獲得的對照RNAi轉(zhuǎn)染細(xì)胞株與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株 和Dpysl2-siRNA2細(xì)胞株同時按照步驟一的方法進(jìn)行神經(jīng)分化誘導(dǎo)，分別提取分化 第l， 3， 5天的cDNA，按照步驟一的步驟l)的方法檢測Soxl的表達(dá)，同時在第 5天按照步驟一的步驟2)的方法檢測Nestin的表達(dá)。
結(jié)果如圖3中A和B所示，與對照組RNAi相比，上述Dpysl2 RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 細(xì)胞株中Soxl (圖3中A)和Nestin (圖3中B)的表達(dá)量明顯降低，表明干擾了 Dpysl2基因的表達(dá)，可抑制胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化，即Dpysl2基因是胚胎 干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的必需因子，Dpysl2的表達(dá)可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前 體細(xì)胞分化，利用Dpysl2基因的干擾RNA或可表達(dá)其干擾RNA的表達(dá)載體可抑制 胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化。圖3中A為Real-time PCR檢測對照細(xì)胞株(Ctr l-RNAi)與兩個轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株(Dl-RNAi)和Dpysl2-siRNA2細(xì)胞株 (D2-RNAi)細(xì)胞株在神經(jīng)分化過程中Soxl的表達(dá)；圖3中B為免疫熒光檢測對 照細(xì)胞株(Ctrl-RNAi)與轉(zhuǎn)染Dpysl2-siRNAl細(xì)胞株(Dl-RNAi)和Dpysl2-siRNA 2細(xì)胞株(D2-RNAi)在神經(jīng)分化第5天時nestin的表達(dá)情況。
序列表
〈160〉 4
<210〉 1 <211〉 19 〈212> 麗 〈213〉人工序列
〈220〉
<223> 〈400〉 1
gatgggttg atcaagcaaa 20
〈210〉 2 <211> 19 〈212> 畫 〈213>人工序列
〈220>
〈223> <400> 2
actccttcc tcgtgtacat 19
〈210> 3 <211> 55 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉 <400> 3
tgatgggttg atcaagcaaa ttcaagagat ttgcttgatc aacccatctt .ttttc 55
<210> 4 <211〉 55 <212〉 腿 <213〉人工序列
<220〉
<223〉 <400> 4
tactccttcc tcgtgtacat ttcaagagaa tgtacacgag gaaggagttt ttttc 5權(quán)利要求
1、Dpysl2基因在制備抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生為 抑制或促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制早期神經(jīng)發(fā)生的藥物以 可表達(dá)Dpysl2基因的小干擾RNA的真核表達(dá)載體或Dpysl2基因的小干擾RNA為 有效成分。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述小干擾RNA為耙標(biāo)序列為 序列表中序列1的DNA序列的小干擾RNA和/或耙標(biāo)序列為序列表中序列2的DNA 序列的小干擾RNA。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述耙標(biāo)序列為序列表中序列1 的DNA序列的小干擾RNA的編碼序列為序列表中序列3所示的核苷酸序列；所述 靶標(biāo)序列為序列表中序列2的DNA序列的小干擾RNA的編碼序列為序列表中序列 4所示的核苷酸序列。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述可表達(dá)Dpysl2基因的小干 擾RNA的真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為p113.7。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物以 可表達(dá)Dpysl2基因的真核表達(dá)載體為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了Dpysl2基因抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用中的抑制或促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生為抑制或促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化。所述抑制早期神經(jīng)發(fā)生的藥物以可表達(dá)Dpysl2基因的小干擾RNA的真核表達(dá)載體為有效成分。所述促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)生的藥物以可表達(dá)Dpysl2基因的真核表達(dá)載體為有效成分。本發(fā)明為調(diào)控胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的效率提供了一條有效的途徑，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究和治療提供重要的基礎(chǔ)。
文檔編號A61P25/00GK101361984SQ20081022227
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者凱 夏, 騰 費(fèi), 陳曄光, 韓敬東 申請人:清華大學(xué);中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所