能抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及能抑制MAT2A基因表達(dá)的SiRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居全 國(guó)癌癥發(fā)病率第二位，每年因肝癌死亡的人數(shù)約為35萬(wàn)。目前，手術(shù)切除和肝移植是治療 肝癌最有效的方法。但由于早期診斷率低、肝移植供體緊缺等原因，大部分患者失去了根 治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，患者5年生存率僅為10-20%。經(jīng)動(dòng)脈灌注化療栓塞（Transarterial chemoembolization，TACE)是不能手術(shù)切除肝癌的主要治療手段，可促進(jìn)腫瘤缺血性壞死， 抑制其生長(zhǎng)，但栓塞難以徹底，術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移始終是提高遠(yuǎn)期療效的瓶頸；而傳統(tǒng)的手 術(shù)、放療、化療或中藥等方法的治療效果欠佳。因此，尋求新的治療模式迫在眉睫，而基因治 療可能是從根本上解決這一難題的希望。
[0003] 肝細(xì)胞癌的多種基因出現(xiàn)異常表達(dá)，其中MAT基因較為特別。MAT基因可分為 MAT1A基因與MAT2A基因，編碼唯一能催化合成S-腺苷蛋氨酸的酶一一腺苷蛋氨酸轉(zhuǎn)移酶 (Methionine adenosyltransferase，MAT)。MAT 有三種同工酶，分別是 MATI、MATIII和 MATII，前兩種是 MAT1A (Methionine Adenosyltransferase 1A)基因編碼的產(chǎn)物，后一種 是 MAT2A(Methionine Adenosyltransferase 2A)基因編碼的產(chǎn)物。MAT1A 基因主要在成 人肝臟中表達(dá)，而MAT2A基因在除肝臟以外的人體組織器官中廣泛表達(dá)。有趣的是，胎肝中 主要表達(dá)的是MAT2A，在胎兒出生后逐步被MAT1A取代。在肝癌中MAT2A被誘導(dǎo)重新表達(dá)， MAT1A的表達(dá)則發(fā)生沉默，這種轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟┘?xì)胞生長(zhǎng)提供有利條件。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)MAT基 因已經(jīng)做了多方面的研究，也取得可喜的成果。Cai等發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)MAT1A表達(dá)的Huh-7細(xì)胞 內(nèi)SAMe的含量增加了 52%，而DNA合成速率下降了 20%，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩了 25% ; 再導(dǎo)入MAT2A反義RNA后，這些作用進(jìn)一步增強(qiáng)。Li等構(gòu)建過(guò)表達(dá)MAT1A的Huh-7穩(wěn)定表 達(dá)細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)SAMe升高將近3倍，細(xì)胞凋亡率升高超過(guò)2倍，生長(zhǎng)受抑制；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示， 過(guò)表達(dá)MAT1A的Huh-7在裸鼠成瘤速率下降約50 %，微血管密度下降40 %，SAMe含量升高 2倍。Liu等應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制MAT2A的表達(dá)，結(jié)果顯示MAT2A基因的mRNA含量和MAT II活性均降低，細(xì)胞凋亡指數(shù)接近30 %。這些研究表明，針對(duì)MAT基因的干預(yù)可明顯抑制肝 癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減緩腫瘤的生長(zhǎng)。然而，至今對(duì)于MAT1A和MAT2A聯(lián)合干預(yù) 肝癌細(xì)胞成瘤的研究仍然較少，尤其是MAT基因的表達(dá)失調(diào)對(duì)肝癌血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移是 否有影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0004] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指一些外源性或內(nèi)源性小雙鏈RNA (small interfering RNA，siRNA)在細(xì)胞內(nèi)根據(jù)堿基配對(duì)原則與相應(yīng)的mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降 解，特異性、高效地阻斷特定基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)基因表達(dá)缺失的技術(shù)。Guo等在 1995年將正義鏈或反義鏈RNA導(dǎo)入線蟲(chóng)體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其par-1基因表達(dá)被特異性抑制了。隨 后，F(xiàn)ire等在1998年證實(shí)，真正有效地抑制目的基因表達(dá)的是雙鏈RNA，從此揭開(kāi)RNAi的 神秘面紗。RNAi特異性降解同源mRNA，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程無(wú)影響，而是影響基因的翻譯過(guò) 程，因此也稱(chēng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNAi效率高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，已經(jīng)成為研究特定 基因功能的常用技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA。
[0006] 本發(fā)明的能抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA，其特征在于，包括siRNA MAT2A-1或 siRNA MAT2A-2 ；
[0007]所述的 siRNA MAT2A-1，其正義鏈為：5' -GCAACA⑶CACCAGAUAUU-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示），其反義鏈為：5' -AAUAUCUGGUGACUGUUGC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0008]所述的 siRNA MAT2A-2,其正義鏈為：5' -GCCUAUGGCCACUUUGGUA-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示），其反義鏈為：5' -UACCAAAGUGGCCAUAGGC-3'（如 SEQ ID NO. 5 所示）。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種抑制MAT2A基因表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體，其特征 在于，其是將能抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)入慢病毒載體而得到的。
[0010] 所述的載體為慢病毒載體P⑶H-U6。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供過(guò)表達(dá)MAT1A基因的慢病毒載體聯(lián)合抑制MAT2A基因 表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體在制備抑制肝癌藥物中的應(yīng)用，所述的MAT1A基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1的第256位-1443位堿基所示。
[0012] 所述的抑制肝癌的藥物是抑制肝癌血管生成、肝癌迀移和侵襲、肝癌肺轉(zhuǎn)移的藥 物。
[0013] 過(guò)表達(dá)MAT1A基因的慢病毒載體優(yōu)選是將MAT1A基因插入慢病毒載體p⑶H-CMV 的酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I之間而得到的。
[0014] 通過(guò)GenBank搜索，獲得人源MAT1A的cDNA序列（Gene ID:4143,其序列如SEQ ID NO. 1所示，具體的MAT1A基因如SEQ ID NO. 1的第256位-1443位堿基所示），設(shè)計(jì)引 物并經(jīng)PCR擴(kuò)增cDNA后，使用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切，再與經(jīng)過(guò)同樣酶切的慢病毒載 體pCDH-CMV連接；然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；進(jìn)行純化質(zhì)粒后可得到 表達(dá)MAT1A基因的慢病毒載體p⑶H-MAT1A，測(cè)序驗(yàn)證其序列的正確性；通過(guò)將慢病毒載體 轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后MAT1A基因的mRNA水平顯著升高。
[0015] 敲低MAT2A的慢病毒載體是采用siRNA表達(dá)載體法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)在GenBank 中搜索確定人源MAT2A的mRNA序列（Gene ID:4144)，設(shè)計(jì)并篩選得到了可有效抑制 SMMC-7721 中 MAT2A 的 mRNA 表達(dá)的 siRNA MAT2A-1 和 siRNA MAT2A-2,再合成對(duì)應(yīng)的 siDNA 序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，使用Cal I和BamH I進(jìn)行酶切，再與經(jīng)同樣酶切的慢病毒載體 p⑶H-U6連接；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；純化質(zhì)粒后可得到敲低MAT2A的 慢病毒載體P⑶H-sh-MAT2A-l和p⑶H-sh-MAT2A-2,測(cè)序驗(yàn)證其序列的正確性；通過(guò)將慢病 毒載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后驗(yàn)證轉(zhuǎn)染慢病毒載體pCDH-sh-MAT2A-l和pCDH-sh-MAT2A-2 的SMMC-7721細(xì)胞中MAT2A的mRNA水平顯著降低。
[0016]將構(gòu)建好的慢病毒載體 pCDH-MATIA、pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-sh-MAT2A-2 以 及空載體質(zhì)粒P⑶H-CMV、p⑶H-U6進(jìn)行慢病毒包裝，經(jīng)過(guò)293T細(xì)胞擴(kuò)增，濃縮后得到高 滴度的慢病毒。將已經(jīng)濃縮回收的5種慢病毒進(jìn)行重組，得到以下6個(gè)組合：p⑶H-CMV/ PCDH-U6 (control)、pCDH-MATlA/pCDH-U6 (MATlA+pCDH)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-l (pCDH +sh-MAT2A-l)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2 (pCDH+sh-MAT2A-2)、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT 2A-1 (MATlA+sh-MAT2A-l)和 pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 (MATlA+sh-MAT2A-2)。根據(jù)分 組，將慢病毒組合分別感染SMMC-7721細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；通過(guò)半 定量RT-PCR驗(yàn)證mRNA的表達(dá)，利用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，Western blot檢測(cè) 結(jié)果和RT-PCR的基本保持一致。
[0017] 利用內(nèi)皮細(xì)胞管形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)低表達(dá)MAT2A基因、高表達(dá)MAT1A基因抑制肝細(xì)胞 癌血管生成的能力，兩者聯(lián)合時(shí)效果更強(qiáng)。利用小室迀移、小室侵襲和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)低表達(dá) MAT2A基因聯(lián)合高表達(dá)MAT 1A基因能抑制肝癌血管生成、肝癌迀移和侵襲、肝癌肺轉(zhuǎn)移。
[0018] 本發(fā)明的利用siRNA敲低表達(dá)MAT2A基因且聯(lián)合高表達(dá)MAT1A基因的用于肝細(xì)胞 癌，具有良好的抑制肝癌血管生成、肝癌迀移和侵襲、肝癌肺轉(zhuǎn)移的效果；可進(jìn)一步將其應(yīng) 用于肝癌疾病的治療，具有很高的理論和應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后MAT2A的mRNA表達(dá)半定量RT-PCR圖。以 GAPDH 為內(nèi)參，siRNA-N、siRNA-c、siRNA-3、siRNA-2 和 siRNA-1 分別代表不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染陰 性對(duì)照 siRNA MAT2A-C、轉(zhuǎn)染 siRNA MAT2A-3、轉(zhuǎn)染 siRNA MAT2A-2、轉(zhuǎn)染 siRNA MAT2A-1 的 SMMC-7721 細(xì)胞。
[0020] 圖2是SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDH-MATIA后MAT1A的mRNA的表達(dá)半定量RT-PCR 圖。以GAPDH為內(nèi)參，SMMC-7721、pCDH和pCDH-MATIA分別代表不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pCDH-CMV空 載體和轉(zhuǎn)染pCDH-MATIA的SMMC-7721細(xì)胞。
[0021] 圖 3 是 SMMC-7721 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pCDH-sh-MAT2A-l 或 pCDH-sh-MAT2A-2 后 MAT2A 的 mRNA 的表達(dá)半定量 RT-PCR 圖。以 GAPDH 為內(nèi)參，SMMC-7721、pCDH、sh_MAT2A_l 和sh-MAT2A-2分別代表不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染pCDH-U6空載體、轉(zhuǎn)染pCDH-sh-MAT2A-l和轉(zhuǎn)染 pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 細(xì)胞。
[0022] 圖4是穩(wěn)定株中MAT1A和MAT2A的mRNA的表達(dá)半定量RT-PCR圖。以GAPDH為 內(nèi)參，Control、pCDH+sh-MAT2A-l、pCDH+sh-MAT2A-2、MATlA+pCDH、MATlA+sh-MAT2A-l、 MAT lA+sh-MAT2A-2分別代表轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體類(lèi)型為pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MATlA/pCDH-U6、pCDH-MATIA/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 細(xì)胞穩(wěn)定株。
[0023] 圖5是穩(wěn)定株中MAT1A與MAT2A蛋白含量Western blot檢測(cè)圖。以GAPDH為 內(nèi)參，Control、pCDH+sh-MAT2A-l、pCDH+sh-MAT2A-2、MATlA+pCDH、MATlA+sh-MAT2A-l、 MAT lA+sh-MAT2A-2分別代表轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體類(lèi)型為pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MATlA/pCDH-U6、pCDH-MATIA/ pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 細(xì)胞穩(wěn)定株。
[0024] 圖6是穩(wěn)定株誘導(dǎo)HUVECs (臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）管生成結(jié)果圖。SFM、TCM、MAT1A、 sh-MAT2A-2、MATlA+sh-MAT2A-2分別代表無(wú)血清培養(yǎng)基、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pCDH-MATIA細(xì) 胞、轉(zhuǎn)染 pCDH-sh-MAT2A-2 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染 pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 細(xì)胞上 清液。
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