] (11)加入已經(jīng)稀釋好的一抗溶液，于4°C的條件下孵育過夜；
[0273] (12)使用TBS/T清洗PVDEF膜5分鐘，重復(fù)3次；
[0274] (13)加入二抗溶液，置于室溫下孵育lh ;
[0275] (14)使用TBS/T清洗PVDEF膜5分鐘，重復(fù)3次；
[0276] (15)使用ECL溶液顯色，最后進(jìn)行顯影和定影。
[0277] 結(jié)果顯示：Control組中MAT1A的蛋白含量較低，MAT2A的蛋白含量處于高水平； 與對照組相比，pCDH+sh-MAT2A-l和pCDH+sh-MAT2A-2兩組中MAT1A的蛋白含量依然處于 低水平，與對照組基本相當(dāng)，而兩者都可以降低MAT2A的蛋白含量，并且后者的抑制能力更 強。在MATlA+pCDH細(xì)胞株中，MAT1A的蛋白含量顯著提高，但是MAT2A的蛋白也處于較高水 平，與對照組相差不大。MATlA+sh-MAT2A-l以及MATlA+sh-MAT2A-2這兩組中，都能明顯提 高M(jìn)AT1A的蛋白含量，都降低了 MAT2A的蛋白含量，但后者的作用更明顯（圖5)。Western blot檢測結(jié)果和RT-PCR的基本保持一致。綜合以上情況，我們篩選出了四個穩(wěn)定表達(dá)株， 分別是：control、MATlA+pCDH、pCDH+sh-MAT2A-2、MATlA+sh-MAT2A-2 〇
[0278] 5管形成實驗
[0279] 在完成上述工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過小管形成細(xì)胞實驗研究MAT1A與MAT2A基 因?qū)ρ苌傻挠绊憽?br>[0280] 5. 1收集腫瘤細(xì)胞上清液
[0281] (1)使用Lipofectamine2000將200nM高表達(dá)MAT1A慢病毒載體（轉(zhuǎn)染 pCDH-MATIA)、低表達(dá)MAT2A慢病毒載體（轉(zhuǎn)染pCDH-sh-MAT2A-2)、高表達(dá)MAT1A慢病毒 載體和低表達(dá)MAT2A慢病毒載體（聯(lián)合轉(zhuǎn)染組p⑶H-MAT1 A+p⑶H-sh-MAT2A-2)轉(zhuǎn)染入 SMMC-7721細(xì)胞中，同時設(shè)置陰性對照組（不轉(zhuǎn)染組）；
[0282] (2)轉(zhuǎn)染36小時后吸凈培養(yǎng)基，用2ml 1 X PBS清洗細(xì)胞3次；
[0283] (3)分別加入內(nèi)皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12小時；
[0284] (4)使用移液槍吸取收集腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液；
[0285] (5)將收集管置于離心機(jī)中離心，500Xg，4°C，10分鐘，以除去漂浮細(xì)胞；
[0286] (6)再置于離心機(jī)中離心，12000Xg，4°C，10分鐘，以除去細(xì)胞碎片；
[0287] (7)將腫瘤上清液分裝并凍存于-80°C冰箱中備用。得到以下4組腫瘤培養(yǎng) 上清，分別是：未轉(zhuǎn)染組（TCM)，轉(zhuǎn)染pCDH-MATIA組（MAT1A)，轉(zhuǎn)染pCDH-sh-MAT2A-2組 (sh-MAT2A-2)和聯(lián)合轉(zhuǎn)染組（MATlA+sh-MAT2A-2)。
[0288] 5. 2內(nèi)皮細(xì)胞小管形成實驗
[0289] 使用以上4組腫瘤培養(yǎng)上清和無血清培養(yǎng)基（SFM)在基質(zhì)膠鋪設(shè)的96孔板上培 養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs)，6小時后觀察。
[0290] (1)將凍存于_80°C冰箱中的Matrigel(基質(zhì)膠）取出，放入冰盒內(nèi)，置于4°C冰箱 中12小時；
[0291] (2)將Matrigel/SFM(無血清培養(yǎng)基）以4:6混合均勾，放于4°C冰箱中；
[0292] (3)將預(yù)冷后的50y 1 Matrigel/SFM加入預(yù)冷96孔板內(nèi)，離心，500Xg，4°C，5分 鐘，使混合物平鋪于孔底；
[0293] (4)靜置于37°C中2小時，待混合物自然聚合凝成固態(tài)；
[0294](5)使用胰蛋白酶消化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)，離心后計數(shù)，使用SFM或收集 的TCM腫瘤培養(yǎng)上清液（或另外3組的腫瘤上清液）重懸細(xì)胞，濃度為1. 5 X 105細(xì)胞/ml ;
[0295] (6)將100 y 1 HUVEC重懸液加入第3步已鋪好的Matrigel/SFM96孔板內(nèi)，置于 37°C，5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時；
[0296] (7)于微鏡下觀察并記錄細(xì)胞相互連接的節(jié)點數(shù)。
[0297] 結(jié)果顯示：與SFM相比，TCM能顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠中形成管狀結(jié)構(gòu)，而單 獨過表達(dá)MAT 1A或敲低MAT2A的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管形成的能力減弱。有 意思的是：提高M(jìn)AT1A表達(dá)的同時抑制MAT2A表達(dá)的肝癌細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管形成的能力 更弱，幾乎等同于SFM(圖6)。該實驗結(jié)果表明，過表達(dá)MAT1A、敲低MAT2A抑制肝癌血管生 成。
[0298] 6小室迀移及侵襲實驗
[0299] 利用康寧（Corning)公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移小室研究MAT1A和MAT2A對SMMC-7721細(xì)胞 迀移和侵襲能力的影響。
[0300] (1)使用轉(zhuǎn)移小室進(jìn)行小室迀移實驗，其孔徑為8 ym，直徑為6. 5_ ;
[0301] (2)將實驗過程所用到的無菌槍頭及EP管放置于冰上預(yù)冷，用無血清的DMEM浸泡 轉(zhuǎn)移小室1小時；
[0302] (3)使用移液槍吸凈轉(zhuǎn)移小室中的培養(yǎng)基，并用聚碳酸酯膜包被；
[0303] (4)先構(gòu)建好 SMMC-7721 細(xì)胞表達(dá)株：pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-MATlA/pCDH-U6、 CDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-l、 p⑶H-MATlA/p⑶H-sh-MAT2A-2, 36小時后用胰蛋白酶消化并用無血清的DMEM進(jìn)行重懸，將 細(xì)胞濃度調(diào)整為5 X 105細(xì)胞/ml ;
[0304] (5)將600 y 1的10%小牛血清+DMEM加入到轉(zhuǎn)移小室下室中，將100 y 1細(xì)胞重 懸液加入到上室中，置于37°C，5% 0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12小時；
[0305] (6)吸凈上室中的培養(yǎng)基，用1 XPBS洗滌一次；
[0306] (7)使用10%的福爾馬林固定細(xì)胞30sec ;
[0307] (8)吸凈福爾馬林溶液，加入0. 1ml/孔結(jié)晶紫染液，靜置于室溫中20分鐘；
[0308] (9)吸凈染色液，使用雙蒸水洗滌，將培養(yǎng)板置于37 °C烘干；
[0309] (10)擦掉覆蓋于聚碳酸酯膜正面的細(xì)胞，并在顯微鏡下記錄轉(zhuǎn)移至聚碳酸酯膜反 面的細(xì)胞數(shù)。
[0310] 結(jié)果顯示：與control相比，單獨過表達(dá)MAT1A或敲低MAT2A的SMMC-7721細(xì)胞迀 移通過轉(zhuǎn)移小室聚碳酸質(zhì)膜的數(shù)量相差不大；而同時提高M(jìn)AT1A表達(dá)并抑制MAT2A的腫瘤 細(xì)胞迀移到轉(zhuǎn)移小室下層的細(xì)胞明顯減少（圖7)。
[0311] 同時還進(jìn)行小室侵襲實驗的研究，本研究使用基質(zhì)膠包被聚碳酸酯膜，以模擬 體外細(xì)胞外基質(zhì)，其余操作過程同小室迀移實驗。結(jié)果顯示：與對照組相比，單獨過表達(dá) MAT1A或敲低MAT2A的SMMC-7721細(xì)胞侵襲基質(zhì)膠，轉(zhuǎn)移到下室的數(shù)量相差不大，細(xì)胞密度 相當(dāng)；而同時提高M(jìn)AT 1A表達(dá)和抑制MAT2A的腫瘤細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì) 胞密度顯著降低（圖8、圖9)。該實驗結(jié)果表明，過表達(dá)MAT1A聯(lián)合敲低MAT2A抑制肝癌迀 移和侵襲。
[0312] 7動物實驗
[0313] 體外細(xì)胞實驗并不能完全反映腫瘤在體內(nèi)的生物學(xué)特性，遂進(jìn)行動物實驗進(jìn)一 步驗證MAT1A與MAT2A對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。將已經(jīng)篩選出了四個穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株 (control (pCDH)、MATlA+pCDH、pCDH+sh-MAT2A-2 和 MATlA+sh-MAT2A-2)分別接種于裸鼠肝 左葉（每組接種4只裸鼠），構(gòu)建肝癌模型，30天后檢測腫瘤及肺轉(zhuǎn)移情況，原位成瘤率為 1〇〇%。具體操作步驟如下：
[0314] (1)使用1 %戊巴比妥鈉按40mg/kg的劑量腹腔麻醉6周齡的BALB/c雄性裸鼠；
[0315] (2)待麻醉滿意后，取仰臥位，使用膠布將裸鼠四肢固定于操作臺上；
[0316] (3)使用眼科剪在裸鼠左上腹部建立長約1. 5cm的橫向切口，然后用棉簽輕挑，充 分暴露裸鼠肝左葉；
[0317] (4)使用胰島素針，將25 y 1的Matrigel/PBS/細(xì)胞株混懸液接種于裸鼠肝左葉包 膜下（可見到肝包膜下白點表示接種滿意）；
[0318] (5)迅速拔出胰島素針，使用棉簽按壓穿刺點30sec ;
[0319] (6)輕輕回納肝左葉，使用3#手術(shù)絲線縫合切口（務(wù)必將皮膚、肌層、腹膜完全對 接縫合）；
[0320] (7)肝原位接種成瘤后將裸鼠交予中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)；
[0321] (8)接種后每3天觀察裸鼠及腫瘤生長情況。接種30天后處死裸鼠，檢測胸水及 腹水情況；測量原位腫瘤長度（L)，寬度（W)，根據(jù)公式（LXW 2)/2計算腫瘤體積；取下腫瘤、 肝臟及雙肺，固定于10%福爾馬林液中備用。切片觀察肺組織病理情況。
[0322] 肺組織病理切片結(jié)果顯示：在對照組（p⑶H)、過表達(dá)MAT1A組（MATlA+p⑶H)、敲低 MAT2A組（pCDH+sh-MAT2A-2)中都出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移瘤率均為50%;而過表達(dá)MAT1A并敲低 MAT2A組（MATlA+sh-MAT2A-2)中未檢測到肺轉(zhuǎn)移（圖10)。該實驗結(jié)果表明，過表達(dá)MAT1A 聯(lián)合敲低MAT2A抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移。
【主權(quán)項】
1. 一種能抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA，其特征在于，包括siRNA MAT2A-1或siRNA MAT2A-2 ； 所述的 s iRNA MAT2A-1，其正義鏈為：5 ' -GCAACAGUCACCAGAUAUU-3 '，其反義鏈為： 5' -AAUAUCUG⑶GAC腳UGC-3' ； 所述的 s iRNA MAT2A-2，其正義鏈為：5 ' -GCCUAUGGCCACUUUGGUA-3 '，其反義鏈為： 5' -UACCAAA⑶GGCCAUAGGC-3'。2. -種抑制MAT2A基因表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，其是將權(quán)利要求1所述的 能抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)入慢病毒載體而得到的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制MAT2A基因表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，所述的 慢病毒載體為慢病毒載體pCDH_U6。4. 過表達(dá)MTIA基因的慢病毒載體聯(lián)合抑制MAT2A基因表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體在制備 抑制肝癌藥物中的應(yīng)用，所述的MATlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第256位-1443 位堿基所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制肝癌藥物是抑制肝癌血管生 成、肝癌迀移和侵襲、肝癌肺轉(zhuǎn)移的藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的過表達(dá)MATlA基因的慢病毒載體是 將MATlA基因插入慢病毒載體p⑶H-CMV的酶切位點EcoR I和BamH I之間而得到的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了能抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明的抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA？MAT2A-1，其正義鏈如SEQ？ID？NO.2所示，反義鏈如SEQ？ID？NO.3所示；抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA？MAT2A-2，其正義鏈如SEQ？ID？NO.4所示，反義鏈如SEQ？ID？NO.5所示。根據(jù)抑制MAT2A基因表達(dá)的siRNA構(gòu)建的抑制MAT2A基因表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體聯(lián)合過表達(dá)MAT1A基因(其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1的第256位-1443位堿基所示)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞成功的抑制了肝細(xì)胞癌血管生成、遷移和侵襲、肺轉(zhuǎn)移，其可進(jìn)一步應(yīng)用于制備治療肝癌疾病的藥物，具有很高的理論和應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N15/867, A61P35/00, C12N15/113, A61P35/04, A61K31/713
【公開號】CN105039342
【申請?zhí)枴緾N201510476981
【發(fā)明人】李家平
【申請人】李家平, 王銳智, 姚學(xué)華, 范文哲
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月6日