0025]圖 7 是穩(wěn)定株小室迀移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。pCDH、pCDH+sh-MAT2A-l、pCDH+sh-MAT2A-2、 MATlA+pCDH、MATlA+sh-MAT2A-l、MATlA+sh-MAT2A-2 分別代表轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體類型 為 pCDH-CMV/pCDH-U6、 pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-l、 pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、 pCDH-MATlA/pCDH-U6、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 細(xì)胞穩(wěn)定株；*#，P〈0. 001。
[0026] 圖8是穩(wěn)定株小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯微鏡掃描圖。p⑶H、p⑶H+sh-MAT2A_l、 pCDH+sh-MAT2A-2、MATlA+pCDH、MATlA+sh-MAT2A-l、MATlA+sh-MAT2A-2 分別代表轉(zhuǎn) 染的質(zhì)粒載體類型為 pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-CMV/ pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MATlA/pCDH-U6、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-MATIA/ pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 細(xì)胞穩(wěn)定株。
[0027] 圖9是穩(wěn)定株小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。***，P〈0. 001 ;各樣品標(biāo)號同圖8。
[0028] 圖10是裸鼠接種穩(wěn)定株30天后肺組織病理切片圖。裸鼠雙肺進(jìn)行連續(xù)切片， 進(jìn)行HE染色，鏡下統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目（400X)。pCDH、pCDH+sh-MAT2A-2、MATlA+pCDH、 MAT lA+sh-MAT2A-2分別代表轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體類型為pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/ pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MATlA/pCDH-U6、pCDH-MATlA/pCDH-sh-MAT2A-2 的 SMMC-7721 細(xì)胞 穩(wěn)定株。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0030] 下列實(shí)例中未具體注明的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，或按照所用產(chǎn)品生 產(chǎn)廠商的使用說明。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑 得到。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 1構(gòu)建過表達(dá)MAT1A的慢病毒載體
[0033] 為了研究MAT1A對人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的影響，我們構(gòu)建了過表達(dá)MAT1A的 慢病毒載體，基因表達(dá)質(zhì)粒載體為慢病毒載體pCDH-CMV。
[0034] 1. 1基因位點(diǎn)選擇
[0035] 在GenBank中搜索獲得人源MAT1A的cDNA序列，即Gene ID:4143 (其序列如SEQ ID NO. 1所示）。設(shè)計(jì)引物對，正向引物序列為：5 ' -CCTGTGAGACAGTGTGCAAG-3 '，反向引物序 列為：5' -ATGCACTCCTCTGTCTCGTC-3'，以該引物對PCR擴(kuò)增人基因組DNA模板得到基因片 段：MAT1A 基因 mRNA 的編碼序列（Coding sequence，CDS)，即 Gene ID: 4143 (其序列如 SEQ ID NO. 1所示）的第256-1443位。該引物對由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。
[0036] 1. 2 PCR 擴(kuò)增 MAT1A 的 cDNA
[0037] (1)逐一加入反應(yīng)物，反應(yīng)體系50 y 1 :
[0038]
[0039]
[0042] 得到PCR產(chǎn)物。
[0043] 1. 3 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收并純化
[0044] (1)稱取0. 3g瓊脂糖，加入30ml電泳緩沖液，使用微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解， 再加入1000 X SYBA 5 y 1，搖勻；
[0045] (2)將瓊脂糖溶液輕輕加入制膠模具中，插入梳子，待其自然冷卻；
[0046] (3)待瓊脂糖膠凝固后，拔出梳子，并將凝膠放入電泳槽中，確保電泳緩沖液沒過 凝膠；
[0047] (4)將loadingBuffer與DNA樣品（PCR產(chǎn)物）混勾，再把混合液加入樣品槽，每個 加入5 y 1，記錄點(diǎn)樣次序；
[0048] (5)正確連接電泳槽正負(fù)電極，打開電源，調(diào)節(jié)電壓至140V，電泳25分鐘；
[0049] (6)將瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，找到長度約為1187bp的cDNA對應(yīng)條帶， 即為MAT1A基因cDNA條帶；
[0050] (7)切下含有目的MAT 1A基因cDNA的瓊脂凝膠，使用紙巾吸凈表面液體并切碎，將 200 y 1的凝膠碎粒加入1. 5ml離心管中；
[0051] (8)加入600 y 1凝膠熔化劑，混合均勻，置于75 °C水浴鍋中，輕搖直到凝膠完全溶 解，此時溶液呈紅色；
[0052] (9)加入300 y 1結(jié)合液，上下緩慢倒置混合均勻，此時混合液呈黃色；
[0053] (10)將步驟9中的混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000Xg離心1分鐘，棄廢液；
[0054] (11)將制備管置入2ml離心管中，加入500 y 1洗滌液，12000 X g離心30sec，棄廢 液；
[0055] (12)將制備管置入2ml離心管中，加入700 y 1去鹽液，12000 X g離心30sec，棄廢 液，重復(fù)一次，確保鹽分被完全清除；
[0056] (13)將制備管置入2ml離心管中，12000Xg離心1分鐘；
[0057] (14)將制備管置入1. 5ml離心管中，在制備膜中央加入30 y 1DEPC水，室溫靜置 lmin，12000 X g離心1分鐘，洗脫目的cDNA ;
[0058] (15)得到純化的MAT1A-cDNA(MAT1A的基因編碼序列，其前后帶有酶切位點(diǎn)），將 其置于-20°C冰箱中備用。
[0059] 1. 4 EcoR I 和 BamH I 酶切純化后的 MATlA-cDNA
[0060] (1)反應(yīng)體系 30 y 1
[0061]
[0062] (2)純化并回收酶切后的MATlA-cDNA，方法同前。注意回收過程中應(yīng)將離心速度 調(diào)整為lOOOOXg，以免降低回收率。由此得到經(jīng)EcoR I和BamH I酶切后的MATlA-cDNA。
[0063] 1. 5 EcoR I 和 BamH I 酶切質(zhì)粒載體 pCDH-CMV
[0064] (1)逐一加入反應(yīng)物，反應(yīng)體系20 y 1
[0065]
[0066] (2)純化并回收酶切后的質(zhì)粒，方法同前。由此得到經(jīng)EcoR I和BamH I酶切后 的質(zhì)粒載體pCDH-CMV。
[0067] 1. 6連接酶切后的MATlA-cDNA及質(zhì)粒載體pCDH-CMV
[0068] (1)反應(yīng)體系10 y 1
[0069]
[0070]
[0071] 由此得到MATlA-cDNA與質(zhì)粒載體pCDH-CMV重組連接產(chǎn)物，命名pCDH-MATIA。
[0072] 1. 7制備并擴(kuò)大培養(yǎng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a
[0073](1)從_80°C冰箱中取出感受態(tài)大腸桿菌DH5a，置于冰上溶解。取90y 1感受 態(tài)大腸桿菌DH5 a，向其中加入10 y 1 MATlA-cDNA與質(zhì)粒載體p⑶H-CMV重組連接產(chǎn)物 (pCDH-MATIA)，混勾，置于冰上30分鐘；
[0074] (2)取出置于預(yù)加熱的42°C水浴42sec，促使大腸桿菌吞噬連接產(chǎn)物；
[0075] (3)將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在LB瓊脂培養(yǎng)板上；
[0076] (4)置于37°C恒溫箱中，倒置培養(yǎng)12h;
[0077] (5)挑選長勢良好的單個菌落，置于50ml試劑管中，加入20ml LB+10ug/ml氨節(jié)抗 生素的培養(yǎng)基中；
[0078] (6)放入細(xì)菌搖床中，室溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)12h。得到含有重組慢病毒載體p⑶H-MAT1A 的大腸桿菌。
[0079] 1. 8提取慢病毒載體pCDH-MATIA
[0080] (1)取擴(kuò)大培養(yǎng)后的含有重組慢病毒載體p⑶H-MAT1A的大腸桿菌菌液20ml，加入 離心管，5000Xg，4°C，離心10min，可見細(xì)菌團(tuán)沉積于管底，棄掉廢液；
[0081] (2)加入4ml懸液緩沖劑/RNase混合液重懸細(xì)菌，混勾；
[0082] (3)加入4ml細(xì)菌裂解液，輕輕地上下倒置EP管6-8次，混合均勻，待液體變澄清 后置于15°C孵育2分鐘；
[0083] (4)加入4ml預(yù)冷的中和液，輕輕地上下倒置EP管6-8次，直至看到白色絮狀物出 現(xiàn)，再置于冰上孵育5分鐘；
[0084] (5)使用濾紙過濾細(xì)菌裂解液，將濾紙對折2次，再分開形成漏斗狀，尖端朝下插 入50ml塑料管中；用少量雙蒸水濕潤濾紙；將細(xì)菌裂解液緩慢滴入濕潤后的濾紙，再加入 5mlPBS沖洗殘存于濾紙的裂解液；收集濾過液待其自然澄清；
[0085] (6)將洗脫柱套入密封環(huán)中，再插入集液管中，用2. 5ml平衡液濕潤洗脫柱，待其 自然濾干，棄掉過濾液；
[0086] (7)將第5步中澄清的濾過液倒入濕潤后的洗脫柱中，待其自然濾干，棄掉過濾 液；
[0087] (8)加入5ml清洗液，待其自然濾干，棄掉過濾液；
[0088] (9)重復(fù)第8步的實(shí)驗(yàn)，棄掉過濾液與集液管；
[0089] (10)將洗脫柱插入新的集液管中，加入5ml預(yù)熱到50°C的洗脫液，待其自然濾干， 收集濾過液（內(nèi)含重組質(zhì)粒）；
[0090] (11)加入3. 6ml異丙醇，置于離心機(jī)中離心，15000Xg，3. 5°C，40分鐘，小心地吸 凈上清液；
[0091] (12)加入3ml預(yù)冷至4°C的70%乙醇，離心，15000Xg，3. 5°C，10分鐘，使用移液 槍吸凈上清液，靜置10分鐘待質(zhì)粒DNA自然干燥；
[0092] (13)加入20yl超純水，收集質(zhì)粒，分裝備用；由此提取得到慢病毒載體 pCDH-MATIA 〇
[0093] 2構(gòu)建低表達(dá)MAT2A的慢病毒載體
[0094]為了研究MAT2A基因?qū)MMC-7721的影響，采用siRNA表達(dá)載體法抑制MAT2A基 因的表達(dá)，構(gòu)建了敲低MAT2A的慢病毒載體，基因的表達(dá)載體為慢病毒系統(tǒng)載體pCDH-U6。
[0095] 2. 1基因位點(diǎn)選擇
[0096]根據(jù)GenBank中的人源MAT2A基因cDNA開放閱讀框的序列（Gene ID: 4144)，設(shè)計(jì) 了 3 條 siRNA 和一條 siRNA 陰性對照序列，分別是 siRNA MAT2A-1、siRNA MAT2A-2、siRNA MAT2A-3和siRNA MAT2A-C，由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。
[0097] siRNA MAT2A-1 其正義鏈為：5' -GCAACA⑶CACCAGAUAUU-3'，其反義鏈為： 5' -AAUAUCUG⑶GAC腳UGC-3'。
[0098]siRNA MAT2A-2 的正義鏈為：5' -GCCUAUGGCCACUUUGGUAdTdT-3'，反義鏈為： 5' -UACCAAA⑶GGCCAUAGGCdTdG-3'。
[0099]siRNA MAT2A-3 其正義鏈為：5' -CCCAUCAGAGUCCACACAAdTdT-3'，其反義鏈為： 5' -UUGUGUGGACUCUGAUGGGdAdA-3'。
[0100]siRNA MAT2A-C 其正義鏈為：5' -GCACUCAGAGAGUAGUCCAdTdT-3'，其反義鏈為： 5' -UAGUGGAUGUGGACUCUGCdAdA-3'。
[0101] 2. 2將4種SiRNA分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞篩選有效的SiRNA序列
[0102] 上述4種siRNA經(jīng)退火形成小雙鏈siRNA后，使用Lipofectamine 2000將siRNA 分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染48小時后，提取細(xì)胞總RNA