一種鑒別生長(zhǎng)性能優(yōu)異的晉南牛的igf2基因分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒別生長(zhǎng)性能優(yōu)異的晉南牛的IGF2 基因分子標(biāo)記SNP、SNP的引物、SNP的試劑盒及鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生長(zhǎng)性狀是肉牛主要的經(jīng)濟(jì)性狀，其主要包括體高、體重、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍、腰 腳寬、坐骨端寬及十字部高等指標(biāo)。同時(shí)生長(zhǎng)性狀是受多基因座位控制的數(shù)量性狀，表型選 擇遺傳進(jìn)展緩慢，影響生長(zhǎng)性狀的主基因的確定對(duì)我國(guó)地方黃牛品種向肉用方向培育有重 要意義。
[0003] 單核苷酸多態(tài)性（SNP)是1996年由美國(guó)麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心學(xué) 者Lander提出的一類遺傳標(biāo)記，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的 DNA序列多態(tài)性。SNP表現(xiàn)出的多態(tài)性僅涉及到單個(gè)堿基的變異，表現(xiàn)形式有轉(zhuǎn)換、顛換、插 入和缺失等。測(cè)序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)及飛行時(shí)間質(zhì)譜等技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)SNP的檢測(cè)。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因 定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。
[0004] 胰島素樣生長(zhǎng)因子2 (insulin-like growth factor 2)又稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素A，是 由67個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)有絲分裂、胚胎形成、調(diào)控機(jī)體 生長(zhǎng)發(fā)育的作用。前人研究證明IGF2在牛的骨骼肌再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于鑒別生長(zhǎng)性能優(yōu)異的晉南牛的IGF2基因分子標(biāo) 記SNP及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于鑒別生長(zhǎng)性能優(yōu)異的晉南牛的IGF2基因分子標(biāo)記SNP，所 述分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，第71位點(diǎn)處的堿基為C或T，此處堿基為C 的晉南牛的生長(zhǎng)性能顯著高于此處堿基為T的晉南牛。
[0008] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)所述分子標(biāo)記SNP的引物對(duì)，核苷酸序列如下：
[0009] 正向引物 F : 5 ' -TGGCAGCGACTGCTACTATTG-3 '，
[0010] 反向引物R :5 ' -GAGCACTCCAAAGGCAGCTTT-3 '，
[0011] SNP 分型延伸引物：5 ' -AGTCGAGAGCCTGGGGCACCAG-3 '。
[0012] 所述引物對(duì)特異性擴(kuò)增出SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種用于鑒別生長(zhǎng)性能優(yōu)異的晉南牛的試劑盒，所述試劑盒包括 引物F、引物R、SNP分型引物、Premix TaqTM、ExoI、FastAP、ExoI bufTer、Snapshot Mix中 的一種或多種，其中Premix TaqTM由dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、PCR緩沖液組成。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種利用SNP標(biāo)記鑒定生長(zhǎng)性能高的晉南牛的方法，包括如下步 驟：
[0015] (1)提取待檢測(cè)晉南牛的基因組DNA ;
[0016] (2)以第一步獲得的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的引物F和R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得晉南牛IGF2基因上203bp的目的片段；PCR反應(yīng)體系為25 y L，其中100ng/ yL 基因組 DNA 模板 1 yL，10pmol/yL 引物 F 和R 各 1 yL，12. 5yL Premix TaqTM，9. 5yL ddH20, PCR 反應(yīng)條件為：95 °C lOmin ;94 °C 30sec，60 °C 30sec，72 °C 30sec，35 個(gè)循環(huán)； 72〇C lOmin ；4°C forever ；
[0017] (3)利用SnaPshot技術(shù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，首先對(duì)PCR產(chǎn)物純化：取PCR產(chǎn)物用Exol 和FastAP純化，主要是用Exol去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP去除反應(yīng)中剩余的 DNTP，反應(yīng)體系為 PCR 產(chǎn)物 3ul，Exol 0.2ul，F(xiàn)astAP 0.8ul，Exol buffer 0.7ul，補(bǔ)水至 7ul，反應(yīng)條件為37°C 15min，80°C 15min ;然后進(jìn)行延伸反應(yīng)：體系為已純化PCR產(chǎn)物2ul， Snapshot Mix試劑lul，延伸引物混合2ul，補(bǔ)水至6ul，條件為96°C lmin ;96°C 10sec， 52°C 5sec，60°C 30sec，30 個(gè)循環(huán)；取 lul 延伸產(chǎn)物，加 lOul 上樣 loading，95°C變性 3min， 立即冰水浴，上測(cè)序儀，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中71bp處為C，則待測(cè)晉南牛屬于生長(zhǎng)性能高的 優(yōu)勢(shì)個(gè)體。
[0018] 本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0019] (1)上述分子標(biāo)記SNP在鑒定生長(zhǎng)性能高的晉南牛優(yōu)勢(shì)品種中的應(yīng)用；
[0020] (2)上述引物對(duì)在鑒定生長(zhǎng)性能高的晉南牛優(yōu)勢(shì)品種中的應(yīng)用；
[0021] (3)上述試劑盒在鑒定生長(zhǎng)性能高的晉南牛優(yōu)勢(shì)品種中的應(yīng)用；
[0022] (4)上述方法在鑒定生長(zhǎng)性能高的晉南牛優(yōu)勢(shì)品種中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明原理及有益效果：
[0024] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)晉南牛IGF2基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，利用SAS9. 2軟件的 GLM過(guò)程把基因分型結(jié)果與晉南牛的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)CC型個(gè)體的體重、體斜 長(zhǎng)和胸圍極顯著高于TT型個(gè)體（P〈0. 01)，CC型個(gè)體的體重和胸圍顯著高于CT型個(gè)體 (P〈0. 05)。該位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)行分子育種提供了新的標(biāo)記。
[0025] 本發(fā)明提供的鑒定生長(zhǎng)性能高的晉南牛優(yōu)勢(shì)品種的方法準(zhǔn)確可靠，方便易行，而 且本發(fā)明提供的SNP標(biāo)記不受年齡、性別等限制，可用于早期選育，加快育種進(jìn)程。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0027] 圖1為本發(fā)明中晉南牛三種基因型SnaPshot測(cè)序分型圖，其中（a)為CT型，（b) 為CC型，（c)為TT型；
[0028] 圖2為本發(fā)明中晉南牛三種基因型測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030] 實(shí)施例1與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的IGF2基因分子標(biāo)記的獲得及鑒定
[0031] L 1待測(cè)晉南牛血液基因組DNA的提取
[0032] 尾靜脈采集待測(cè)晉南牛血液，常溫放置3-4小時(shí)待血液凝固，此時(shí)血液分為血清 和凝血塊兩部分，血清呈清亮黃色，凝血塊為暗紅色，牛血液中只有白細(xì)胞內(nèi)含有DNA，存在 于凝血塊中。
[0033] 利用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA樣品提取試劑盒從凝血塊中提取基因組 DNA，具體步驟如下：
[0034] 用眼科剪剪取0. 2-0. 3mL的凝血塊放入已滅菌的2mL圓底離心管中，加入500 y L 的細(xì)胞裂解液CL ;
[0035] 利用手持勻漿儀將血塊充分勻漿，振蕩15s，12000rpm離心lmin，棄去上層暗紅色 上清液；
[0036] 再次加入700 y L細(xì)胞裂解液CL，充分振蕩使下層沉淀散開懸浮，12000rpm離心 lmin，棄去上清液；
[0037] 加入200 y L緩沖液GS，充分渦旋至沉淀充分懸??；
[0038] 加入20 y L蛋白酶K和250 y L緩沖液GB，充分混勻；
[0039] 將離心管用封口膜封好放入到56°C雜交爐中消化3-4小時(shí)，為確保充分消化，消 化過(guò)程中需要顛倒混勻數(shù)次，最終溶液變成清亮透明，簡(jiǎn)短離心；
[0040] 加入200 ii L冰鎮(zhèn)無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀；
[0041] 將上一步所得溶液轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000rpm離心30s， 棄去收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0042] 向吸附柱CB3中加入500 y L去蛋白緩沖液⑶，靜置2min，12000rpm離心30s，棄 去收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0043] 向吸附柱CB3中加入700 y L漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄去收集管中的廢液， 將吸附柱放入收集管中；
[0044] 向吸附柱CB3中加入500 y L漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄去收集管中的廢液；
[0045]