一種檢測中華鱉出血病病毒的特異性擴(kuò)增引物及其檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測中華鱉出血病病毒的特異性擴(kuò)增引物及其檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]中華鱉因其特有的營養(yǎng)保健價值，成為我國淡水名優(yōu)養(yǎng)殖品種，主要分布于浙江、廣東、廣西、湖南、湖北、江西等省份。其中浙江是中華鱉養(yǎng)殖大省，2014年產(chǎn)量達(dá)14萬噸，產(chǎn)值達(dá)80億元，是漁業(yè)增效、漁民增收的重要支柱產(chǎn)業(yè)。鱉病害威脅是養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。常見細(xì)菌性病害大多可通過養(yǎng)殖密度控制、水質(zhì)調(diào)控等良好的養(yǎng)殖管理模式來加以控制。但病毒性病害，尤其是高致病性病毒常導(dǎo)致爆發(fā)性死亡，給中華鱉養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅。加之苗種的省際、國際流通日益頻繁，給鱉病毒性病害的爆發(fā)帶來了更多不確定因素。苗種產(chǎn)地檢疫是水產(chǎn)動物病毒性病害的有效防控措施之一。但由于鱉病毒相關(guān)研究滯后，對種鱉或鱉苗開展檢疫無從談起。加之病害一旦發(fā)生，因病毒基礎(chǔ)信息的缺失，無法確診，易與細(xì)菌性病害混淆，導(dǎo)致濫用藥，給食品安全和生態(tài)環(huán)境也帶來極大隱患。加強(qiáng)對中華鱉病毒性病害的基礎(chǔ)研究，有利于采取有效的防控措施，為漁業(yè)增效、漁民增收保駕護(hù)航，并減少食品安全與生態(tài)安全的隱患。
[0003]據(jù)2014年全國中華鱉病害監(jiān)測報告，在紅底板病、腐皮病、胃腸炎病、鰓腺炎病、潰瘍綜合癥5種常見病害中，鰓腺炎死亡率最高，養(yǎng)殖戶對該病也是談之色變。但現(xiàn)有的病害監(jiān)測手段僅根據(jù)臨床表現(xiàn)來診斷，無相關(guān)的確診技術(shù)。養(yǎng)殖戶常提到的“鰓腺炎病”僅是從鰓腺紅腫、吐血等癥狀來判斷，實際上各病例病原及發(fā)病機(jī)理不盡相同，致死率也有很大差異。
[0004]中華鱉(Tr1nyx sinensis)在分類學(xué)上隸屬爬行綱，主要分布于中國、日本及東南亞等國家和地區(qū)。相對于魚病而言，有關(guān)鱉病害的基礎(chǔ)研究較為薄弱，大部分報道只是疾病的診斷和治療試驗。我國對于中華鱉病毒病的研究較為零星，大都基于電鏡觀察結(jié)果。國內(nèi)已先后報道過中華鱉虹彩病毒(Irido-like virus)、皰疹病毒(Herpes-likevirus)、呼腸孤樣病毒(Reo-like virus)、彈狀樣病毒(Rhabdo-like virus)、30_39nm 球狀病毒等。胡嗣基曾報道皰疹病毒可引起中華鱉體表明顯潰瘍，腹部有紅色出血點或出血斑塊(胡嗣基.用鹽酸嗎啉呱防治甲魚皰疹病[J].水產(chǎn)科技情報，1995，22 (1):21-22.);葉普仁報道了鱉鰓腺炎病的病原體可能是病毒，其證據(jù)主要來自抗菌藥物不能治療的控制疾病，而病毒靈可很快治愈(葉普仁.鱉鰓腺炎病及治療[J].淡水漁業(yè)，1996，26 (I):
42-43.)。陳在賢等從患“紅脖子病”的鱉體內(nèi)分離到一種虹彩病毒，直徑120-160 nm左右(陳在賢，鄭堅川，江育林.從患“紅脖子病”甲魚體分離到虹彩病毒[J].中國獸醫(yī)學(xué)報1998，18(2):135-139.)，是目前唯一分類地位被確定、全基因組序列被解析的中華鱉病毒。在此基礎(chǔ)上，虹彩病毒相關(guān)的免疫學(xué)研究、分子生物學(xué)鑒定方法等報道也相繼出現(xiàn)。但有關(guān)虹彩病毒在養(yǎng)殖中未見單獨弓I起爆發(fā)性死亡的報道。
[0005]目前中華鱉出血病只能臨床觀察診斷，存在主觀性和不確定性，現(xiàn)在尚無引發(fā)中華鱉出血病病毒的核酸分子檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有引發(fā)中華鱉爆發(fā)性死亡的病毒性病原無法確診的局限，提供一種檢測中華鱉出血病病毒的特異性擴(kuò)增引物，采用該特異性擴(kuò)增引物檢測中華鱉出血病病毒，檢測結(jié)果特異，結(jié)果易判斷，有利于中華鱉病毒病的確診。
[0007]同時本發(fā)明還提供了包含上述引物的檢測中華鱉出血病病毒的檢測試劑盒，具有普通RT-PCR和熒光定量RT-PCR兩種，兩種試劑盒特異性強(qiáng)，靈敏度高，而且操作簡便快捷，填補(bǔ)了目前尚無引發(fā)中華鱉出血病病毒的核酸分子檢測方法的空白，適合中華鱉出血病病毒的確診、篩查和預(yù)防。
[0008]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種檢測中華鱉出血病病毒的特異性擴(kuò)增引物，包括用于普通RT-PCR的特異性擴(kuò)增引物和用于熒光定量RT-PCR的特異性擴(kuò)增引物，所述用于普通RT-PCR的特異性擴(kuò)增引物為引物對 TSHSV-Fl 和 TSHSV-Rl，TSHSV-Fl 的核苷酸序列為 SEQ ID No:1 所示，TSHSV-Rl的核苷酸序列為SEQ ID No:2所示；所述用于熒光定量RT-PCR的特異性擴(kuò)增引物為引物對 TSHSV-F2 和 TSHSV-R2，TSHSV-F2 的核苷酸序列為 SEQ ID No:3 所示，TSHSV-R2 的核苷酸序列為SEQ ID No:4所示。
[0009]一種檢測中華鱉出血病病毒的普通RT-PCR病毒核酸檢測試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，20-50 μ L的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括:10-15mmol/L的ρΗ8.0-8.5Tris-HCl，50_80mmol/L 氯化鉀，10-50 mmol/L 氯化鎂，l_2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F1 引物，20_200nmol/L TSHSV-Rl 引物，1-3U DNA 聚合酶，1-4 μ L 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；TSHSV-Fl的核苷酸序列為SEQ ID Νο:1所示，TSHSV-Rl的核苷酸序列為SEQ IDNo: 2所示。
[0010]反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液反應(yīng)后得到。
[0011]作為優(yōu)選，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括反應(yīng)液A和反應(yīng)液B，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液總體積10-20 μ L中反應(yīng)液A的體積為5-10 μ L，余量為反應(yīng)液B ;反應(yīng)液A包括:0.2-0.4 ymol/L引物Olig (dT)15，l-3yg待檢樣品RNA作為模板；反應(yīng)液B包括:30-50mmol/L的ρΗ8.0-8.5Tris-HCl，50-80mmol/L 氯化鉀，10-50 mmol/L 氯化鎂，2-1OmmoI/L 二硫蘇糖醇，l-2mmol/L dNTP, 10-15vol% DMSO，5-15wt% PEG-6000,0.1-0.2 μ g/ μ L BSA，10-20URNase抑制劑，50-200U的MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑(Takara，大連來源)。
[0012]待檢樣品RNA的提取方法為:取20_30mg病毒感染的中華鱉肺、脾、腎等組織勻漿，加入350-500 μ L裂解液勻漿，離心；取上清液，與等體積的70%無水乙醇混合均勻后，將混合液與玻璃纖維素膜結(jié)合；依次用去蛋白液和漂洗液洗滌玻璃纖維素膜；用(無核糖核酸酶水，洗脫玻璃纖維素膜上吸附的RNA。
[0013]一種檢測中華鱉出血病病毒的熒光定量RT-PCR病毒核酸檢測試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和熒光定量P CR擴(kuò)增反應(yīng)液，2 O - 5 O μ L的熒光定量P CR擴(kuò)增反應(yīng)液包括:10-15mmol/L 的 ρΗ8.0-8.5Tris_HCl，50_80mmol/L 氯化鉀，10-50 mmol/L 氯化鎂，
l-2mmol/L dNTP，20_200nmol/L TSHSV-F2 引物，20_200nmol/L TSHSV-R2 引物，0.3_0.5 μ LSYBGreen熒光染料，1-5 μ L稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，1-3U熱啟動DNA聚合酶；TSHSV_F2的核苷酸序列為SEQ ID No:3所示，TSHSV-R2的核苷酸序列為SEQ ID No:4所示。
[0014]作為優(yōu)選，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括反應(yīng)液A和反應(yīng)液B，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液總體積10-20 μ L中反應(yīng)液A的體積為5-10 μ L，余量為反應(yīng)液B ;反應(yīng)液A包括:0.2-0.4 ymol/L引物Olig (dT) 15，1-3 μ g待檢樣品RNA作為模板；反應(yīng)液B包括:30-50mmol/L的ρΗ8.0-8.5Tris-HCl，50-80mmol/L 氯化鉀，10-50 mmol/L 氯化鎂，2-1OmmoI/L 二硫蘇糖醇，l-2mmol/L dNTP, 10-15vol% DMSO，5-15wt% PEG-6000,0.1-0.2 μ g/ μ L BSA, 10-20URNase抑制劑，50-200U的MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑(Takara，大連來源)。
[0015]作為優(yōu)選，稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5-10倍所得