專利名稱：測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的方法及其實現(xiàn)手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學，特別是涉及診斷評價T-抑制基因活性的方法，即涉及測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的方法，也涉及其實現(xiàn)手段。
來源于胎盤的β-I-糖蛋白是已知的，它是用作造血細胞的生長和增殖刺激因子的滋養(yǎng)性β-I-糖蛋白(TBG)的類似物(US專利5169835，Cl.A61K 35/50，1989)。
然而，該已知的化合物未被用于測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分。
將TBG用于診斷和預示懷孕過程是已知的(見L.G.Sotnikova等，The Role of β-I-glycoprotein Trophoblast in Diagnosing andPrognosticating Pregnancy，Metodicheskije Recomendatsii，Moscow，1984)。然而所述研究未公開將TBG用于診斷人免疫狀態(tài)抑制基因成分的可能性。
測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的方法是已知的，它包括收集外周血，獲得用來培養(yǎng)有抑制基因激活劑和無此激活劑的試驗培養(yǎng)物的純淋巴細胞懸浮液，并進一步評價增殖水平(見Dutton R.W.Inhibitory andStimulatory Effects of Concanavalin A on the Response of Mouse Spleencells Suspensions to Antigen.J.Exp.Med.，V.138，P.1496-1505，1973)。
然而，已知方法需要一種很難得到且昂貴的外來制劑，那就是作為抑制基因激活劑的伴刀豆球蛋白A。
測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的方法是已知的，它包括收集外周血，獲得單核細胞(MNCs)懸浮液，將所述懸浮液分為兩等份，在無抑制基因激活劑存在下培養(yǎng)第一份MNCs并在抑制基因激活劑存在下培養(yǎng)第二份MNCs，從培養(yǎng)基中洗出MNCs并阻斷增殖，將從正常供體中新鮮分離的MNCs加到上文所述的各份MNCs中，用等份的植物血凝素來刺激而獲得試驗培養(yǎng)物，培養(yǎng)它們并進一步評價在所述試驗培養(yǎng)物中的增殖情況，基于在所述各種試驗培養(yǎng)物中增殖水平之比來確定抑制值(見Lien Shov，Stanley A.Schwarts and Robert A Good Suppressor cellActivity after Concanavalin A treatment of Lymphocytes from NormalDonors J.Exp.Med.，1976，v.143，n.5，p.1100-1110)。
然而，所述已知方法也需要很難得到的且昂貴的外來制劑，即伴刀豆球蛋白A。
本發(fā)明的主要目的是提供一種使用易于獲得的制劑來測定人免疫狀態(tài)抑制基因活性的低費用方法，所述制劑具有免疫校正活性且不引起過敏反應。
通過將滋養(yǎng)性β-I-糖蛋白(TBG)用作測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的試劑來完成所述目的，而且本發(fā)明的測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的方法包括以每毫升MNC懸浮劑3～120μg的劑量使用滋養(yǎng)性β-I-糖蛋白，該方法包括收集外周血樣，獲得單核細胞(MNCs)懸浮液，將所述懸浮液分為兩份，在不存在抑制基因激活劑下培養(yǎng)第一份，在含抑制基因激活劑下培養(yǎng)第二份，從培養(yǎng)基中洗出MNCs，阻斷增殖，將從正常供體獲得的新鮮分離的MNCs加到各個所述MNC部分中，用等份的植物血凝素刺激來產(chǎn)生試驗培養(yǎng)物，培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，進一步評價所述培養(yǎng)物的增殖情況并基于試驗培養(yǎng)物中增殖水平之比來確定抑制值。
由細胞可制備MNC懸浮液，該細胞是從phycoll-urotrust Single-step gradient中分離而獲得的，MNCs培養(yǎng)進行48小時。用絲裂霉素C處理MNCs來阻斷增殖，并可將各個試驗培養(yǎng)物培養(yǎng)72小時。
實驗和臨床試驗已經(jīng)顯示TBG作為用來測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的抑制基因激活劑的新特性。
第一步是由細胞制備MNC懸浮液，該細胞是由phycoll-urotrustSingle-stage density gradient(Boyum’s method)中分離而獲得的。
用靜脈穿刺術(shù)從病人體中取出外周血，同時放入含肝素溶液的管中(1ml血液＝20-30肝素單位)。然后，將該血樣用不含Ca++和Mg++的Hanks溶液以1∶2稀釋并用phycoll-urotrust gradient(密度為1.078)分層。
然后在400g下離心30分鐘。將界面的MNC分散液放于離心管中，加入不含Ca++和Mg++的Hanks溶液，并進行3次連續(xù)的離心(每次10分鐘)把細胞從phycoll-urotrust溶液洗出。第三次離心后，將MNC殘余物重新懸浮在1ml的199介質(zhì)中，使用Goryajev照相機記錄單核細胞的數(shù)量。
第二步是將MNCs分為兩等份，第一份在不含抑制基因激活劑下培養(yǎng)，而第二份在抑制基因激活劑存在下培養(yǎng)，并用滋養(yǎng)性β-I-糖蛋白(TBG)作為所述激活劑。
在37℃下，在有#14.5橡皮塞的青霉素容器中培養(yǎng)MNCs。培養(yǎng)基為具有20％IV(AB)型血清和300mg谷氨酰胺的PPMI-1640。
每個容器中含有5×106個細胞，存在于2.0ml完全培養(yǎng)基中。
以3-120μg的劑量將TBG加到培養(yǎng)物中以誘導抑制基因基因。
將細胞培養(yǎng)48小時。然后將MNCs從培養(yǎng)基中洗出，用絲裂霉素C處理(40μg/ml，37℃下，30分鐘)來阻斷增殖。用含5％IV(AB)血清(冷凍的)的199介質(zhì)洗滌三次。重新懸浮細胞殘余物，記錄含核細胞的數(shù)目，用0.1％錐蟲藍溶液測定細胞生存力的百分數(shù)，并將所得懸浮液稀釋到所需濃度。所有操作都要分別針對對照細胞和TBG刺激的細胞進行，用聚硅氧烷盤來洗滌細胞。
下一步是將從正常供體新鮮分離的淋巴細胞(該淋巴細胞是預先用植物血凝素(PHA)刺激的且用作應答的試驗細胞)以等量加到對照部分和TBG刺激的淋巴細胞中(0.5×106∶0.5×106細胞/ml)以便獲得試驗培養(yǎng)物。培養(yǎng)進行72小時。再用N3-胸苷評價試驗培養(yǎng)物的增殖情況并通過增殖減小程度來評價抑制情況。用下式計算抑制指數(shù) 為了評價正常供體的抑制基因成分，使用一組正常供體(100人)來進行已知方法的診斷研究(見Lien Shov，Stanley A.Schwarts andRobert A.Good.Suppressor Cell Activity after Concanavalin ATreatment of Lymphocytes from Normal Donors.J.Exp.Med.，1976，V.143，n.5，p.1100-1110)，以及本發(fā)明方法的診斷研究?；谟纱怂@得的結(jié)果，在伴刀豆球蛋白A誘導下T-抑制基因活性的正常值為56.8％±4％，而按本發(fā)明方法測定的值為63.4％±4.7％。
在下列實施例中提供本發(fā)明進一步公開的內(nèi)容。
實施例1病人V.，30，來到醫(yī)院診斷為急性期的“多發(fā)性硬化，腦脊髓型”。在伴刀豆球蛋白A誘導下的外周血的T-抑制基因活性為15％，該值是按已知方法來測定的，該方法是用來評價人免疫狀態(tài)抑制基因成分的。同時采用本發(fā)明的方法(TBG誘導下)測定同一病人外周血的T-抑制基因活性，由此獲得的值為17％。
實施例2病人S(女)，40，來醫(yī)院診斷為急性期的“多發(fā)性硬化，腦脊髓型”。伴刀豆球蛋白A誘導下外周血的T-抑制基因活性為16％(按已知方法測定)。同時，使用本發(fā)明方法(TBG誘導下)測定同一病人外周血的T-抑制基因活性，由此獲得的值為19％。
研究了150名患有多發(fā)性硬化和類風濕性關(guān)節(jié)炎的病人。已經(jīng)顯示由本發(fā)明方法測定的T-抑制基因活性與由已知方法獲得的值相一致。
所以，已證實TBG作為測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的試劑的高效性。
本發(fā)明測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的方法的上述優(yōu)點以及所使用手段的那些優(yōu)點都能將所述方法廣泛用于臨床上的科學目的。
也應當注意，使用伴刀豆球蛋白A治療上述疾病因其毒性而產(chǎn)生相反的作用，而TBG(由人滋養(yǎng)細胞產(chǎn)生)不顯示毒性且不引起過敏反應。這一事實能使所述制劑用作藥物。
權(quán)利要求
1.將滋養(yǎng)性β-I-糖蛋白(TBG)用作測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的試劑。
2.測定人免疫狀態(tài)抑制基因成分的方法，它包括收集外周血；獲得單核細胞(MNCs)懸浮液；將所述懸浮液分為兩等份；在不含抑制基因激活劑下培養(yǎng)第一份MNCs，在所述抑制基因激活劑存在下培養(yǎng)第二份MNCs；從培養(yǎng)基中洗出MNCs；阻斷增殖；將從正常供體中新鮮分離的MNCs以等量加到所述各個MNC部分中以獲得試驗培養(yǎng)物，所述新鮮分離的MNCs已用植物血凝素刺激；培養(yǎng)所述試驗培養(yǎng)物；更進一步評價所述試驗培養(yǎng)物中的增殖情況并基于各試驗培養(yǎng)物中增殖水平之比來測定抑制值，其特征在于將滋養(yǎng)性β-I-糖蛋白(TBG)用作所述抑制基因激活劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于以每1ml MNC懸浮液3～120μg的劑量使用TBG。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于由細胞產(chǎn)生MNC懸浮液，該細胞是通過phycoll-urotrust single-step gradient分離而獲得的。
5.權(quán)利要求1的方法，其特征在于MNC培養(yǎng)進行48小時。
6.權(quán)利要求1的方法，其特征在于用絲裂霉素C處理MNCs來阻斷增殖。
7.權(quán)利要求1的方法，其特征在于各試驗培養(yǎng)物被培養(yǎng)72小時。
全文摘要
測定人免疫狀態(tài)抑制基團成分的方法，包括收集外周血，獲得單核細胞(MNC
文檔編號G01N33/53GK1146241SQ95192634
公開日1997年3月26日 申請日期1995年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月18日
發(fā)明者I·N·高拉維斯考夫, L·Y·戈沙拉娃, K·A·阿里戈漢塔夫 申請人:I·N·高拉維斯考夫, L·Y·戈沙拉娃