專利名稱：一種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法。
背景技術(shù)：
食品安全歷來是各國(guó)政府、媒體、消費(fèi)者所共同關(guān)注的敏感問題。針對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性的爭(zhēng)論從始至今從未停息，也沒有任何公認(rèn)結(jié)論。蜂蜜因含有蜜源植物花粉而成為與轉(zhuǎn)基因植物相關(guān)的特殊產(chǎn)品。蜂蜜中花粉主要來源于蜂群采集，另外一些蜂農(nóng)為使蜂蜜具有了不同的香型和風(fēng)味人為地添加。如果這些花粉來自轉(zhuǎn)基因作物，則蜂蜜中可能含有轉(zhuǎn)基因成分。蜂蜜是我國(guó)傳統(tǒng)大宗出口農(nóng)副產(chǎn)品，產(chǎn)量、出口量始終穩(wěn)居于世界各國(guó)前列。歐 盟、日韓等國(guó)是我國(guó)蜂蜜重要的出口市場(chǎng)，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的限制政策，可能成為繼抗生素殘留、農(nóng)藥殘留問題后新的技術(shù)壁壘。本項(xiàng)研究以油菜蜜、棉花蜜為研究對(duì)象開展蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分快速檢測(cè)研究，正是為突破發(fā)達(dá)國(guó)家可能設(shè)置的新的技術(shù)壁壘作好技術(shù)上的應(yīng)對(duì)準(zhǔn)備；另一方面，近年來市場(chǎng)上產(chǎn)自美國(guó)、阿根廷、巴西等國(guó)的進(jìn)口蜂蜜也越來越常見，這些國(guó)家是主要的轉(zhuǎn)基因作物種植區(qū)。我們也可以設(shè)置相關(guān)技術(shù)壁壘，以保護(hù)我國(guó)的經(jīng)濟(jì)利益和消費(fèi)者權(quán)益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的建立起轉(zhuǎn)基因棉花和油菜花粉的典型特征圖譜，通過鏡檢可以快速簡(jiǎn)便地初步判斷蜂蜜中含有轉(zhuǎn)基因作物花粉的可能性，也可以用于蜂蜜品種判斷，特別是做出是否含有棉花蜜、油菜蜜的初步判斷。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的一種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，依序包括如下步驟
(I)采用負(fù)壓抽濾法和離心法分離蜂蜜樣品中的花粉；
a)負(fù)壓抽濾法分離花粉將蜂蜜樣品稀釋后負(fù)壓抽濾后，用蒸餾水沖洗濾膜以除去糖分。將濾膜置于50mL離心管中，加入5mL蒸餾水在漩渦振蕩器上激烈振蕩I分鐘，取出濾膜。3000 rpm離心30min,棄上清液，留0. 5mL備用；
b)離心法抽提花粉將蜂蜜樣品稀釋、離心后，棄去上清液，加適量蒸餾水重新震蕩懸浮，再次離心30分鐘，棄去上清液，如此重復(fù)兩次。最后剩下0. 5mL花粉溶液備用。(2)制作花粉樣品顯微觀察玻片
a)油膠的制備稱取動(dòng)物明膠Ig置于50mL小燒杯中,加入6 mL蒸懼水浸泡2小時(shí)，待其溶化后加入7mL甘油，加熱并輕輕攪拌，盡量少產(chǎn)生氣泡，至完全均勻后冷卻備用；
b)乙酸酐硫酸混合液的配置將27mL乙酸酐置于50mL小燒杯中，攪拌中緩緩加入3mL濃硫酸,攪拌均勻備用；
c)G.Erdtman乙酸酐分解法將制備好的花粉先用2mL乙酸浸泡l_2h, 3000rpm離心IOmin,棄去乙酸,再加入乙酸酐硫酸(9 1)混合液5mL,水浴煮沸2_3分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上層溶液；加入5mL蒸懼水振蕩使花粉重新懸浮,3000rpm離心IOmin,棄上層溶液。重復(fù)兩次，剩下少量處理后花粉溶液備用；
d)制片方法將一小滴熱水浴溶化的甘油膠滴在預(yù)先烤熱的載玻片上，用移液器移取IOuL花粉溶液或經(jīng)乙酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油膠上，然后將蓋玻片在酒精燈上烤熱后迅速蓋上。要求400倍顯微鏡下每個(gè)視野4-8個(gè)花粉為宜。待甘油膠冷凝后用加拿大樹膠封邊,可制成永久片。(3)花粉的測(cè)量
使用經(jīng)過校準(zhǔn)的目鏡測(cè)微尺的Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡測(cè)量自然狀態(tài)下的花粉和經(jīng)過乙酸酐分解法除去原生質(zhì)的花粉，每種花粉分別測(cè)定30個(gè)隨機(jī)樣本求平均值。( 4 )標(biāo)準(zhǔn)圖譜的攝制 拍攝棉花和油菜花粉的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。 (5)蜜源植物判別
在400倍顯微鏡下觀察已制好的花粉片，連續(xù)選擇不少于40個(gè)不同視野，觀察記錄占主要比例的1-5種花粉，總花粉數(shù)在150-300之間較為適宜。所述的蜂蜜樣品如有結(jié)晶，應(yīng)先在40°C水浴中完全融化。所述的負(fù)壓抽濾法分離花粉，樣品稀釋比例為I :10 ;離心法抽提花粉樣品稀釋比例為I : 10后，離心轉(zhuǎn)速為3000 rpm，時(shí)間為30分鐘。所述的乙酸酐硫酸混合液的配置比例為9:1。所述的花粉的測(cè)量使用的是經(jīng)過校準(zhǔn)的目鏡測(cè)微尺的Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡，分別測(cè)量自然狀態(tài)下的花粉和經(jīng)過乙酸酐分解法除去原生質(zhì)的花粉，每種花粉取隨機(jī)30個(gè)重復(fù)求平均值。所述的標(biāo)準(zhǔn)圖譜的制作使用的是Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡500萬像素?cái)?shù)碼相機(jī)和KEYENCE公司VHX-600E 5400萬像素3CXD超景深三維顯微系統(tǒng)，分別拍攝棉花和油菜花粉。所述的蜜源植物花粉的觀察選用放大400倍的顯微鏡下進(jìn)行，連續(xù)選擇不少于40個(gè)不同視野。所述的檢樣中分離的花粉，對(duì)照建立的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，未發(fā)現(xiàn)典型或疑似棉花、油菜花粉，可直接判定蜂蜜不含轉(zhuǎn)基因成分或不含棉花、油菜蜜；如果鏡檢發(fā)現(xiàn)存在典型或疑似棉花、油菜花粉，則需進(jìn)一步確定。


圖I棉花自然形態(tài)花粉三維圖像。圖2棉花自然形態(tài)花粉圖像。圖3乙酸酐分解后棉花花粉形態(tài)。圖4棉花花粉細(xì)網(wǎng)狀紋理。圖5普通顯微鏡下棉花花粉圖像(具圓形散孔，無孔蓋)。圖6自然油菜花粉形態(tài)。圖I粗網(wǎng)狀雕紋。
圖8乙酸酐分解后油菜花粉形態(tài)圖。圖9普通顯微鏡下油菜花粉圖像。圖10南瓜花粉(I)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的顯微照片(加厚凸起的孔蓋)。圖11西葫蘆花粉(1、2)和乙酸酐分解后花粉(3)的顯微照片(加厚凸起的孔蓋)。圖12洋槐花粉及局部放大的顆粒狀雕紋。圖13鴨腳木花粉(2)和乙酸酐分解后花粉(I、3)的顯微照片。圖14苕條花粉(I)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的顯微照片。圖15蘋果花粉[(1、2)和乙酸酐分解后花粉(3)的顯微照片。
圖16中國(guó)李花粉[(1)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的顯微照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。I.材料與儀器
I.I材料
棉花蜜樣品來自池州高嶺鄉(xiāng)駐架村采樣點(diǎn)；油菜蜜樣品來自廬江縣劉守鄉(xiāng)等采樣點(diǎn)；
1.2儀器
MILLIPORE MILLIFLEX PLUS過濾系統(tǒng)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN 64R)；
KEYENCE公司VHX-600E 5400萬像素3CCD超景深三維顯微系統(tǒng)；Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡。2.方法
2.I花粉的分離(如有結(jié)晶應(yīng)先在40°C水浴中完全融化)；
2. I. I負(fù)壓抽濾法分離花粉
將樣品I :10稀釋后負(fù)壓抽濾后，用蒸餾水沖洗濾膜以除去糖分。將濾膜置于50mL離心管中，加入5mL蒸餾水在漩渦振蕩器上激烈振蕩I分鐘，取出濾膜。3000 rpm離心30min,棄上清液，留0. 5mL備用；
2. I. 2離心法抽提花粉
將樣品I :10稀釋后，3000 rpm離心30分鐘，棄去上清液，加適量蒸餾水重新震蕩懸浮，再次離心30分鐘，棄去上清液，如此重復(fù)兩次。最后剩下0. 5mL花粉溶液備用；
2. 2制片
2. 2. I油膠的制備
稱取動(dòng)物明膠Ig置于50 mL小燒杯中,加入6 mL蒸懼水浸泡2小時(shí),待其溶化后加入7mL甘油，加熱并輕輕攪拌，盡量少產(chǎn)生氣泡，至完全均勻后冷卻備用；
2.2. 2乙酸酐硫酸(9 1)混合液的配置
將27mL乙酸酐置于50 mL小燒杯中，攪拌中緩緩加入3mL濃硫酸，攪拌均勻備用；
2.2. 3 G. Erdtman乙酸酐分解法
將制備好的花粉先用2mL乙酸浸泡l-2h, 3000rpm離心IOmin,棄去乙酸,再加入乙酸酐硫酸(9 I)混合液5mL，水浴煮沸2-3分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上層溶液；加入5mL蒸餾水振蕩使花粉重新懸浮，3000rpm離心lOmin，棄上層溶液。重復(fù)兩次，剩下少量處理后花粉溶液備用；2.2. 4制片方法
將一小滴熱水浴溶化的甘油膠滴在預(yù)先烤熱的載玻片上，用移液器移取IOy L花粉溶液或經(jīng)乙酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油膠上，然后將蓋玻片在酒精燈上烤熱后迅速蓋上。要求400倍顯微鏡下每個(gè)視野4-8個(gè)花粉為宜。待甘油膠冷凝后用加拿大樹膠封邊,可制成永久片；
2.3花粉測(cè)量
使用具經(jīng)過校準(zhǔn)的目鏡測(cè)微尺的Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡測(cè)量自然狀態(tài)下的花粉和經(jīng)過乙酸酐分解法除去原生質(zhì)的花粉，每種花粉分別測(cè)定30個(gè)隨機(jī)樣本求平均值；
表I自然狀態(tài)花粉測(cè)量數(shù)據(jù)表
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表2.經(jīng)乙酸酐分解法處理的花粉測(cè)量數(shù)據(jù)表
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2.4標(biāo)準(zhǔn)圖譜的攝制
使用Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡500萬像素?cái)?shù)碼相機(jī)和KEYENCE公司VHX-600E 5400萬像素3CCD超景深三維顯微系統(tǒng)分別拍攝棉花和油菜花粉；
2.5蜜源植物判別
在400倍顯微鏡下觀察已制好的花粉片，連續(xù)選擇不少于40個(gè)不同視野，觀察記錄占主要比例的1-5種花粉，總花粉數(shù)在150-300之間較為適宜；
當(dāng)檢樣中分離的花粉，對(duì)照建立的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，未發(fā)現(xiàn)典型或疑似棉花、油菜花粉，可直接判定蜂蜜不含轉(zhuǎn)基因成分或不含棉花、油菜蜜；如果鏡檢發(fā)現(xiàn)存在典型或疑似棉花、油菜花粉，則需進(jìn)一步確定。3.結(jié)果與分析
3.I花粉分離方法比較
因蜂蜜中雜質(zhì)顆粒較多，過濾超過50mL就會(huì)非常緩慢和困難，收集花粉量較少。離心法抽提花粉相對(duì)較為方便易行，并易于獲取較大量花粉；
3.2經(jīng)乙酸酐處理，會(huì)造成花粉變形、測(cè)量值會(huì)因此產(chǎn)生較大變化。大小應(yīng)以自然狀態(tài)為準(zhǔn)。原先飽滿的花粉粒變得中心塌陷變形，可能是部分內(nèi)容物溢出造成的；3.3經(jīng)乙酸酐分解后，花粉表面結(jié)構(gòu)紋飾更加清晰。圖3顯示無蓋散孔更加清晰易于分辨，是棉花花粉重要形態(tài)特征；圖8清晰顯示油菜花粉花粉壁層次清晰、外厚內(nèi)薄的特占.
3.4顯微觀測(cè)花粉時(shí)普通光學(xué)顯微鏡能分別觀測(cè)到不同焦距平面的清晰圖像(如圖5)，但無法看到如圖I這樣立體圖像。花粉直徑越大這種情況越明顯；
3.5.棉花花粉基本特征
球形或近球形，直徑100 y m左右，密布8-11 y m長(zhǎng)刺狀雕紋、除刺外尚具細(xì)網(wǎng)狀紋理；具8-16個(gè)圓形散孔，無孔蓋；
3.6油菜花粉基本特征
近球形或球形，呈草綠色，直徑28 y m左右，大多具三溝、也有部分具四溝，外壁厚約2.5um,內(nèi)層薄，層次明顯，表面具粗網(wǎng)狀雕紋；
表3與棉花、油菜花粉近似蜜源植物花粉特征比較
權(quán)利要求
1.一種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，依序包括如下步驟 (1)采用負(fù)壓抽濾法和離心法分離蜂蜜樣品中的花粉 a)負(fù)壓抽濾法分離花粉將蜂蜜樣品稀釋后負(fù)壓抽濾后，用蒸餾水沖洗濾膜以除去糖分； 將濾膜置于50mL離心管中，加入5mL蒸餾水在漩渦振蕩器上激烈振蕩I分鐘，取出濾膜；3000 rpm離心30min,棄上清液，留O. 5mL備用； b)離心法抽提花粉將蜂蜜樣品稀釋、離心后，棄去上清液，加適量蒸餾水重新震蕩懸浮，再次離心30分鐘，棄去上清液，如此重復(fù)兩次；最后剩下O. 5mL花粉溶液備用；(2)制作花粉樣品顯微觀察玻片 a)油膠的制備稱取動(dòng)物明膠Ig置于50mL小燒杯中，加入6 mL蒸懼水浸泡2小時(shí)，待其溶化后加入7mL甘油，加熱并輕輕攪拌，盡量少產(chǎn)生氣泡，至完全均勻后冷卻備用； b)こ酸酐硫酸混合液的配置將27mLこ酸酐置于50mL小燒杯中，攪拌中緩緩加入3mL濃硫酸,攪拌均勻備用； c)G.Erdtmanこ酸酐分解法將制備好的花粉先用2mLこ酸浸泡l_2h, 3000rpm離心IOmin,棄去こ酸,再加入こ酸酐硫酸(9 1)混合液5mL,水浴煮沸2_3分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上層溶液；加入5mL蒸懼水振蕩使花粉重新懸浮,3000rpm離心IOmin,棄上層溶液；重復(fù)兩次，剩下少量處理后花粉溶液備用； d)制片方法將ー小滴熱水浴溶化的甘油膠滴在預(yù)先烤熱的載玻片上，用移液器移取10 μ L花粉溶液或經(jīng)こ酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油膠上，然后將蓋玻片在酒精燈上烤熱后迅速蓋上；要求400倍顯微鏡下每個(gè)視野4-8個(gè)花粉為宜；待甘油膠冷凝后用加拿大樹膠封邊,可制成永久片；(3)花粉的測(cè)量 使用經(jīng)過校準(zhǔn)的目鏡測(cè)微尺的Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡測(cè)量自然狀態(tài)下的花粉和經(jīng)過こ酸酐分解法除去原生質(zhì)的花粉，每種花粉分別測(cè)定30個(gè)隨機(jī)樣本求平均值；(4)標(biāo)準(zhǔn)圖譜的攝制 拍攝棉花和油菜花粉的標(biāo)準(zhǔn)圖譜；(5)蜜源植物判別 在400倍顯微鏡下觀察已制好的花粉片，連續(xù)選擇不少于40個(gè)不同視野，觀察記錄占主要比例的1-5種花粉，總花粉數(shù)在150-300之間較為適宜。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，其特征是蜂蜜樣品如有結(jié)晶，應(yīng)先在40°C水浴中完全融化。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，其特征是負(fù)壓抽濾法分離花粉，樣品稀釋比例為1:10 ;離心法抽提花粉樣品稀釋比例為I :10后，離心轉(zhuǎn)速為3000 rpm,時(shí)間為30分鐘。
4.如權(quán)利要求I所述的ー種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，其特征是こ酸酐硫酸混合液的配置比例為9:1。
5.如權(quán)利要求I所述的ー種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，其特征是花粉的測(cè)量使用的是經(jīng)過校準(zhǔn)的目鏡測(cè)微尺的Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡，分別測(cè)量自然狀態(tài)下的花粉和經(jīng)過こ酸酐分解法除去原生質(zhì)的花粉，每種花粉取隨機(jī)30個(gè)重復(fù)求平均值。
6.如權(quán)利要求I所述的ー種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，其特征是標(biāo)準(zhǔn)圖譜的制作使用的是Leica DMLS型光學(xué)顯微鏡500萬像素?cái)?shù)碼相機(jī)和KEYENCE公司VHX-600E 5400萬像素3CXD超景深三維顯微系統(tǒng)，分別拍攝棉花和油菜花粉。
7.如權(quán)利要求I所述的ー種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，其特征是蜜源植物花粉的觀察是選用放大400倍的顯微鏡下進(jìn)行，連續(xù)選擇不少于40個(gè)不同視野。
8.如權(quán)利要求I所述的ー種鑒定蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉的形態(tài)學(xué)方法，其特征是當(dāng)檢樣中分離的花粉，對(duì)照建立的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，未發(fā)現(xiàn)典型或疑似棉花、油菜花粉，可直接判定蜂蜜不含轉(zhuǎn)基因成分或不含棉花、油菜蜜；如果鏡檢發(fā)現(xiàn)存在典型或疑似棉花、油菜花粉，則需進(jìn)ー步確定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蜂蜜中主要轉(zhuǎn)基因蜜源植物花粉鑒定的形態(tài)學(xué)方法。該方法包括如下操作步驟(1)蜂蜜樣品中花粉的分離；(2)制作花粉樣品顯微觀察玻片；(3)花粉粒徑測(cè)量；(4)花粉標(biāo)準(zhǔn)圖譜的攝制；(5)蜜源植物的判別；本發(fā)明通過對(duì)棉花和油菜花粉顯微形態(tài)的研究，建立標(biāo)準(zhǔn)花粉圖譜，以顯微鏡檢的方式快速排除不含上述作物花粉的蜂蜜，可用于快速甄別蜂蜜中是否還有轉(zhuǎn)基因成分。
文檔編號(hào)G01N21/84GK102830119SQ20111015815
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者余曉峰, 鄭海松, 祝長(zhǎng)青, 張霞, 姚劍, 孫娟娟, 宗凱 申請(qǐng)人:安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心