轉(zhuǎn)基因成分的數(shù)字pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因成分的數(shù)字PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1988年，全球首例轉(zhuǎn)基因作物耐草甘膦品系轉(zhuǎn)基因大豆由Hinchee等人 (Hinchee，1988)研發(fā)。自此之后轉(zhuǎn)基因作物得到了飛速的發(fā)展，已經(jīng)對傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn) 生了很大的沖擊。轉(zhuǎn)基因作物的迅猛發(fā)展使得轉(zhuǎn)基因食品更多地流入了商品市場，這一方 面極大地滿足并豐富了人們的物質(zhì)生活需求；另一方面，人們對轉(zhuǎn)基因食品食用安全性的 關(guān)注也越來越多，其中最核心的關(guān)注在于外源基因是否會(huì)對人體和環(huán)境產(chǎn)生影響。世界各 國針對轉(zhuǎn)基因食品出臺(tái)了嚴(yán)格的管理制度以預(yù)防轉(zhuǎn)基因生物可能存在的安全擔(dān)憂。食品轉(zhuǎn) 基因成分檢測是轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)以及監(jiān)管的首要工作，檢測技術(shù)的發(fā)展直接影響轉(zhuǎn)基因生 物安全管理的成敗。目前對于轉(zhuǎn)基因作物及食品的研宄，既有常規(guī)的定性檢測技術(shù)和定量 檢測技術(shù)，也有近幾年比較關(guān)注的安全分析技術(shù)。
[0003] 數(shù)字PCR(Digital-PCR)是一項(xiàng)檢測和定量核酸的新技術(shù)，其基本原理是通過將 微量樣品作大倍數(shù)稀釋和分液，直至每個(gè)樣品中所含有的待測分子數(shù)不會(huì)超過1個(gè)，再將 所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有PCR擴(kuò)增熒光信號記為1，無熒光信號記為0,有 熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，針對反應(yīng)結(jié)果采用泊松概率分布 公式，便可計(jì)算出樣本的最初拷貝數(shù)或濃度。該技術(shù)不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，也不 需要看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，是DNA絕對定量方法。在基因拷貝數(shù)變化分析（copynumber variation,CNV)(Qinetal.，2008)、遺傳突變檢測（Yungetal.，2009)、基因分型（Loet al.，2007)、基因定量（Warrenetal.，2010)、單細(xì)胞基因表達(dá)（Guoetal.，2010)等方面 的研宄取得了突破性的發(fā)展，在臨床方面為癌癥、腫瘤等疾病檢測提供了新的診斷工具。在 轉(zhuǎn)基因檢測方面，Corbisier等（2010)利用數(shù)字PCR分析了玉米種子DNA中外源基因和內(nèi) 標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)之比，該結(jié)果與利用普通熒光定量PCR技術(shù)以質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測 的結(jié)果相同，證明了數(shù)字PCR的可靠性。Burns等（2010)評估了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測中 檢測限（L0D)和定量限（L0Q)，探索了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測方面的可行性和反應(yīng)條件，文 章表明數(shù)字PCR能夠?qū)ζ鹗寄０蹇截悢?shù)進(jìn)行絕對定量?？傮w而言，數(shù)字PCR技術(shù)目前更多 地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷方面，已成為臨床應(yīng)用方面最具潛力的診斷技術(shù)之一，其在轉(zhuǎn)基因檢測 的研宄方面還處于起始階段。現(xiàn)行的數(shù)字PCR檢測方法都是需要經(jīng)過樣品前處理過程的， 但是在實(shí)際檢測中，前處理過程往往會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差。所以現(xiàn)有的數(shù)字PCR檢測 方法是不適合直接作為轉(zhuǎn)基因成分檢測方法的。
[0004] 為了對樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行準(zhǔn)確的定量有必要提供一種不需要進(jìn)行樣品前 處理過程的數(shù)字PCR檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種不需要進(jìn)行樣品前處理 步驟的轉(zhuǎn)基因成分的數(shù)字PCR檢測方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因成分的數(shù)字PCR檢測方法，所述方法包括利用以下引物 和探針進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
[0007] (l)CaMV35s啟動(dòng)子引物序列和探針序列：
[0008] CaMV35s-F ：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT
[0009] CaMV35s-R ：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT
[0010] CaMV35s-P :FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1 ;
[0011] (2) NOS終止子引物序列和探針序列：
[0012] NOS-F ：ATCGTTCAAACATTTGGCA
[0013] NOS-R ：ATTGCGGGACTCTAATCATA
[0014] NOS-P：FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1〇
[0015] 本發(fā)明所提供的方法選取轉(zhuǎn)基因作物中的CaMV35s啟動(dòng)子和NOS終止子為靶序列 進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
[0016] 優(yōu)選的，所述數(shù)字PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)椋?0°C熱激活300s ;95°C預(yù)變性300s ; 95°C變性15s，60°C退火及延伸60s，共50個(gè)循環(huán)；在60°C下采集熒光信號。
[0017] 優(yōu)選的，所述數(shù)字PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：
[0018] 2><MasterMix 2|iL 2〇xLoadingReagent 0.4)iL 引物探針混合液 0.2pL 50ng/|iL基因組模板 1jiL 無菌去離子水 0.4pL 總計(jì)： 4jiL。
[0019] 所述反應(yīng)體系適合于從任何動(dòng)植物組織中提取得到的基因組樣品，可以實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn) 基因作物的精準(zhǔn)檢測。
[0020] 優(yōu)選的，所述方法包括使用數(shù)字PCR芯片將數(shù)字PCR反應(yīng)體系分割成單獨(dú)的體系， 對每個(gè)單獨(dú)的體系進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增并收集每個(gè)單獨(dú)的體系中的熒光信號，獲得熒光 值和擴(kuò)增曲線。
[0021] 本發(fā)明所提供的方法將每一個(gè)加樣孔作為一個(gè)整體，加入轉(zhuǎn)基因作物數(shù)字PCR擴(kuò) 增體系，使用數(shù)字PCR擴(kuò)增平臺(tái)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增，通過監(jiān)測每一個(gè)反應(yīng)孔中的熒光信號， 獲得所有反應(yīng)孔中的總體擴(kuò)增曲線和熱點(diǎn)圖。
[0022] 在本發(fā)明所提供的方法中，檢測結(jié)果的判定按照以下方式進(jìn)行：
[0023](1)在利用數(shù)字PCR進(jìn)行擴(kuò)增的過程中，陽性孔的判定方法為：出現(xiàn)明顯區(qū)別于陰 性反應(yīng)孔的擴(kuò)增信號，這個(gè)反應(yīng)孔記為陽性擴(kuò)增孔；陽性樣品的判定方法為：在相同樣品 的三個(gè)平行組里面，至少出現(xiàn)一個(gè)組還有陽性擴(kuò)增孔，就說明檢測基因組中含有轉(zhuǎn)基因作 物成分；
[0024](2)陽性質(zhì)控品反應(yīng)孔中產(chǎn)生陽性結(jié)果以及陰性質(zhì)控品反應(yīng)孔中產(chǎn)生陰性結(jié)果 時(shí)，該實(shí)驗(yàn)視為有效實(shí)驗(yàn)，否則實(shí)驗(yàn)無效，需要重新更換反應(yīng)試劑，并重新進(jìn)行；
[0025] (3)當(dāng)待測樣品反應(yīng)管中為陰性結(jié)果時(shí)，則說明未檢測到轉(zhuǎn)基因作物成分；待測 樣品反應(yīng)管中為陽性結(jié)果，則說明待測樣品中含有轉(zhuǎn)基因作物成分。
[0026] 在本發(fā)明所提供的方法中，可以利用本領(lǐng)域常規(guī)的數(shù)字PCR檢測芯片和儀器完成 檢測過程。
[0027] 本發(fā)明所提供的方法可以直接對待檢測樣品的基因組提取物進(jìn)行檢測，從而省略 了現(xiàn)有的數(shù)字PCR方法中的樣品預(yù)處理步驟，使得檢測過程簡便易行，避免了預(yù)處理步驟 對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的不良影響。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因成分的數(shù)字PCR檢測試劑盒，所述試劑盒中包括：
[0029] (l)CaMV35s啟動(dòng)子引物序列和探針序列（SEQIDNo.1-3所示的核苷酸序列）：
[0030]CaMV35s-F：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT
[0031]CaMV35s-R：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT
[0032]CaMV35s-P :FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1 ;
[0033] 以及⑵NOS終止子引物序列和探針序列（SEQID No. 4-6所示的核苷酸序列）：
[0034] NOS-F ：ATCGTTCAAACATTTGGCA
[0035] NOS-R ：ATTGCGGGACTCTAATCATA
[0036]NOS-P：FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1 〇
[0037] 本發(fā)明還提供了所述的數(shù)字PCR檢測方法在轉(zhuǎn)基因作物成分檢測中的應(yīng)用，以及 本發(fā)明所述試劑盒在轉(zhuǎn)基因作物成分檢測中的應(yīng)用。
[0038] 利用本發(fā)明所提供的數(shù)字PCR檢測方法和試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物樣品 的精準(zhǔn)檢測，靈敏度可以達(dá)到0. 1 %。此外，該方法步驟簡便易于操作，因此在實(shí)際應(yīng)用中具 有很大的靈活性，是一種檢測轉(zhuǎn)基因成分的有效方法。
【附圖說明】
[0039] 圖1為芯片法數(shù)字PCR結(jié)果擴(kuò)增熱點(diǎn)圖。
[0040] 圖A為玉米ZssIIb內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線與熱點(diǎn)圖；圖B為CaMV35s啟動(dòng)子擴(kuò)增曲線 與熱點(diǎn)圖；圖C為N0S終止子擴(kuò)增曲線與熱點(diǎn)圖。
[0041] 圖2為不同轉(zhuǎn)基因品系CaMV35s啟動(dòng)子和N0S終止子的檢測拷貝數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 以下將對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)的說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的
【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 1?實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0045] 1. 1實(shí)驗(yàn)材料：本實(shí)驗(yàn)用到的轉(zhuǎn)基因玉米樣品：Btl76陽性樣品和MIR162陽性 樣品，以及其各自的親本非轉(zhuǎn)基因樣品均儲(chǔ)存于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研宄院。芯片廠家為 Fluidigm，型號為 48.