牛奶中人α-乳清蛋白篩查試紙條及制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于可食動物產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測領(lǐng)域，具體涉及一種牛奶中α-乳清蛋白篩查試紙條及制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明與免疫膠體金技術(shù)有關(guān)。公開了一種用于快速檢測轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因牛奶的免疫膠體金試紙條，在試紙條的PVC背襯上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊；結(jié)合墊上包被有抗hLALBA抗體-膠體金標(biāo)記物，通過hLALBA免疫小鼠制備得到雜交瘤細(xì)胞株LB-001(保藏號為CCTCC NO：C2014157)，利用腹水法大量制得單抗；在硝酸纖維素膜上分別包被有hLALBA蛋白構(gòu)成的檢測線和山羊抗兔IgG的質(zhì)控線。本發(fā)明的試紙條特異性強，操作簡便，檢測快速。CCTCC NO：C20141572014.08.13
【專利說明】牛奶中人α-乳清蛋白篩查試紙條及制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于牛奶轉(zhuǎn)基因成分的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白篩查試紙條及其制備方法。本發(fā)明與免疫膠體金檢測技術(shù)有關(guān)。

【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因動物及轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品以其誘人的經(jīng)濟前景，顯示出強大的生命力，其市場化將是不可扭轉(zhuǎn)的時代趨勢。然而，鑒于生物安全問題，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)都需受到嚴(yán)格的控制。因此，一套健全、科學(xué)、規(guī)范的安全評價體系是必不可少的。其中，可靠、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測方法是安全評價體系中的重環(huán)節(jié)。
[0003]在本發(fā)明申請以前，有資料報道中國農(nóng)業(yè)大學(xué)已經(jīng)成功研制出了一批轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白轉(zhuǎn)基因奶牛及其他一些轉(zhuǎn)基因奶牛。這標(biāo)志著我國轉(zhuǎn)基因奶牛新品種培育和動物乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)達到了國際先進水平，鑒于轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因奶牛生產(chǎn)技術(shù)的成熟以及其產(chǎn)品市場化的趨勢，建立一種快速、簡便的檢測人α-乳清蛋白的方法，有很重要的必要性和緊迫性。
[0004]目前對于轉(zhuǎn)基因成分的檢測可從外源基因的核酸和蛋白質(zhì)兩個水平進行，從蛋白質(zhì)水平進行轉(zhuǎn)基因成分檢測，具有必要性和可行性，這是因為:只有對目的蛋白質(zhì)進行檢測，才能反映外源基因的最終表達情況；對于生物反應(yīng)器制得的蛋白產(chǎn)品，必須對蛋白質(zhì)進行定性、定量以及生物活性分析；對蛋白質(zhì)進行檢測，蛋白質(zhì)樣品制樣較核酸簡單。諸多的蛋白質(zhì)檢測方法，大致可以分為4類:(1)基于蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性的檢測，如雙向電泳、質(zhì)譜、色譜等；(2)基于核酸與蛋白質(zhì)之間的互作的檢測，如鄰位連接技術(shù)，是一種依賴于適配子(aptamer，能夠特異地識別并結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA或RNA的總稱)的檢測技術(shù)(Mats G., Simon F., Michael T.,et al.A sense of closeness: protein detect1nby proximity ligat1n[J].Current Opin1n in B1technology, 2003, 14:82-86 ；SimonF., Mats G., Jonas J.,et al.Protein detect1n using proximity-dependent DNAligat1n assays [J].Nature, 2002, 20:473-477) ； (3)基于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的互作的檢測，如常用的免疫檢測方法，包括western blot, dot blot (不需專門的儀器,但是操作繁瑣，不適合做批量檢測)，ELISA(靈敏度高、特異性強、簡單快速、穩(wěn)定性好、便于自動化檢測等特點，應(yīng)用性強)，以及免疫組織化學(xué)染色法(具有特異性強、靈敏度高、定位準(zhǔn)確的特點，便于進行功能研究，但是操作復(fù)雜、假陽性率高)等；(4)將對蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)化為核酸的檢測，如 B1-bar code assay,靈敏度高(Khan S，Klein W，Mirkin CA, etal.Fluorescent and scanometric ultrasensitive detect1n technologies with theb1-bar code assay for alzheimer，s disease [J].Nanoscape, 2005，2 (I): 7-15)。上述提到的這些方法都比較費時費力，而且需要專業(yè)技術(shù)人員和專門的儀器設(shè)備，基本上只能在實驗室完成，不便于基層推廣。
[0005]膠體金免疫層析(gold-1mmunochromatographyassay GI CA)是 20 世紀(jì) 80 年代發(fā)展起來的一項新的免疫分析方式，是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。它具有簡便，快速，特異性強，靈敏度高，費用低的優(yōu)點。依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，在轉(zhuǎn)基因植物檢測中，已經(jīng)研制出了多種膠體金免疫層析快速檢測試紙條。
[0006]鑒于轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的應(yīng)用前景，研發(fā)快速、靈敏、準(zhǔn)確、安全、便捷的轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的檢測方法，為轉(zhuǎn)基因動物安全評價及轉(zhuǎn)基因動物的監(jiān)測和監(jiān)控提供技術(shù)支撐，對于轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的安全管理具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白篩查試紙條及其制備方法，本發(fā)明能準(zhǔn)確快速檢測出轉(zhuǎn)基因牛奶中轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白(hLALBA)，不需要特殊設(shè)備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的篩查牛奶中轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因的方法，本發(fā)明的方法同時也為轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品安全評價和管理提供借鑒。
[0008]本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見圖1所示。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]一種檢測牛奶中人α-乳清蛋白(hLALBA)的免疫膠體金篩查試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯。在所述的塑料襯板上依次搭接粘帖的樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜及吸水紙；所述的金標(biāo)墊上包被有抗人α-乳清蛋白單克隆抗體，分泌該抗人α -乳清蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株LB-001，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為:CCTCCN0:C2014157);所述的層析膜上分別包被有人α-乳清蛋白的檢測線(Τ線)和山羊抗兔IgG的質(zhì)控線(C線)；
[0011]上述人α-乳清蛋白(hLALBA)購自Sigma公司，貨號:L7269 ;山羊抗兔IgG購自Sigma 公司，貨號:91618 ；
[0012] 申請人:提供了一種人α-乳清蛋白篩查試紙條的制備方法，其包括如下步驟:
[0013](I)抗hLALBA單克隆抗體的制備；
[0014](2)用檸檬酸鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；
[0015](3)將將保藏號為CCTCC NO:C2014157的雜交瘤細(xì)胞株LB-001分泌的抗人α -乳清蛋白單克隆抗體加入到步驟(I)制備的膠體金中，得到抗人α-乳清蛋白抗體-膠體金標(biāo)記物；
[0016](4)將抗人α -乳清蛋白抗體-膠體金標(biāo)記物包被到金標(biāo)墊上；
[0017](5)將人α-乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品包被到層析膜上構(gòu)成檢測線；并將山羊抗兔IgG包被到層析膜上構(gòu)成質(zhì)控線；
[0018](6)在所述的塑料襯板上依次搭接粘帖的樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜及吸水紙，得到所述的檢測牛奶中人α-乳清蛋白的免疫膠體金試紙條。
[0019]本發(fā)明的試紙條是由樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水紙按圖示的順序依次粘附在塑料襯板上組裝而成的。金標(biāo)上包被有本發(fā)明制備的抗hLALBA抗體一膠體金標(biāo)記物，層析膜上包被有檢測線和質(zhì)控線，其中檢測線(T線)為購買的hLALBA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控線(C線)為自制的山羊抗兔IgG。所述樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水紙、塑料襯板均購自Millipore公司。
[0020]本發(fā)明試紙條檢測原理是:檢測牛奶時，將牛奶滴加到樣品墊上，通過毛細(xì)作用牛奶就會向吸水墊一端滲透，當(dāng)奶液經(jīng)過金標(biāo)墊時其中的人α-乳清蛋白就會與有色顆粒標(biāo)記的抗體起反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，使得樣品中的人α -乳清蛋白間接地被有色顆粒標(biāo)記；此后，該抗原-抗體復(fù)合物會繼續(xù)向吸水紙一端流動，經(jīng)過檢測線(Τ線)時，由于有色顆粒標(biāo)記的抗體已經(jīng)與樣品中的hLALBA結(jié)合，便失去了與檢測線處包被的人α -乳清蛋白結(jié)合的能力，因此就不會出現(xiàn)紅色的檢測線；當(dāng)溶液繼續(xù)向前流動，到達質(zhì)控線(C線)時，有色顆粒標(biāo)記的抗體被包被的相應(yīng)的抗體捕獲，因此就會形成一條紅色的質(zhì)控線，檢測結(jié)果判定為陽性，即表示牛奶樣品中含有人α-乳清蛋白成分；如果樣品中沒有人α-乳清蛋白蛋白成分，則金標(biāo)墊上的有色顆粒標(biāo)記的抗體在層析膜上遷移的過程中，會順利地先后與檢測線處的人α-乳清蛋白和質(zhì)控線處相應(yīng)的抗體結(jié)合，分別出現(xiàn)紅色的檢測線(Τ線)和質(zhì)控線(C線)，則判定檢測結(jié)果為陰性，即表示受檢的牛奶樣品中不存在人α-乳清蛋白蛋白；如果在檢測的過程中質(zhì)控線沒有出現(xiàn)，則表示該試紙條失效(見圖2)。
[0021]與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因動物外源蛋白檢測技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點:
[0022]1.本發(fā)明的檢測hLALBA的免疫膠體金試紙條，運用了層析技術(shù)，使免疫反應(yīng)在層析膜上進行，整個過程迅速，耗時少。
[0023]2.本發(fā)明的檢測試紙條不需要任何特殊儀器、設(shè)備，檢測成本低。
[0024]3.本發(fā)明的檢測試紙條操作簡便，不需由專業(yè)人員操作。
[0025]4.本發(fā)明的檢測試紙條儲存方便，對溫度要求不高。
[0026]5.本發(fā)明采用膠體金標(biāo)記特異的人α-乳清蛋白抗體，不受牛奶中其它蛋白的干擾，特異性好。
[0027]綜上所述，用本發(fā)明對轉(zhuǎn)基因牛奶中的人α-乳清蛋白進行檢測，具有反應(yīng)迅速、特異性好、無需其它的任何儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，為基層檢測機構(gòu)對轉(zhuǎn)基因牛奶進行監(jiān)控提供了適用的方法和工具。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。
[0029]圖2:本發(fā)明檢測試紙條結(jié)果判定示意圖。
[0030]圖3:本發(fā)明檢測試紙條對牛奶樣品的檢測結(jié)果。圖3標(biāo)記說明，1:為PBS溶液，
2:為非轉(zhuǎn)基因牛奶，3-5:為轉(zhuǎn)基因牛奶樣品。

【具體實施方式】
[0031 ] 實施例1 (制備實施例)
[0032]檢測hLALBA的免疫膠體金試紙條的制備方法
[0033]1.人α-乳清蛋白抗體的獲得
[0034](I)免疫小鼠:選用4周齡雌性Balb/c小鼠(購自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，首次免疫將人α -乳清蛋白(購于Sigma公司，貨號:L7269)與弗氏完全佐劑混合，采用頸背部皮下注射；3周后進行二免，蛋白與弗氏不完全佐劑融合后進行腹腔注射；3周后進行加強免疫。首免和二免后分別采用斷尾采血進行血液抗體效價檢測；
[0035](2)細(xì)胞融合:無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液，將準(zhǔn)備好的SP2/0瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇，接種到96孔板中；
[0036](3)篩選:接種5天后，加入HAT培養(yǎng)基，7-10天后，加入HT培養(yǎng)基；
[0037](4)雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化:選擇有細(xì)胞生長的孔進行多次ELISA抗體效價檢測，然后根據(jù)計算的細(xì)胞密度對其進行稀釋，稀釋至96孔板每個孔內(nèi)只有一個細(xì)胞的程度，進行克隆，保證每個孔內(nèi)的細(xì)胞為一個單細(xì)胞分裂而來；
[0038](5)單克隆抗體的大量制備:采用小鼠腹水法制備抗體。選用4-6周齡雌性Balb/c小鼠，先注射液體石蠟，一周后，注射雜交瘤細(xì)胞，10天左右后，可見小鼠腹部明顯脹大，可取腹水。然后進行純化，即得到純化后的單克隆抗體。
[0039]免疫小鼠，取免疫細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，進行篩選，得到陽性雜交瘤細(xì)胞株LB-001。將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)，得到抗人α-乳清蛋白的單克隆抗體。
[0040] 申請人:將所得的雜交瘤細(xì)胞株LB-001于2014年8月13日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為:CCTCCN0:C2014157。
[0041]2.抗人α-乳清蛋白抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0042]⑴膠體金的制備
[0043]本發(fā)明采用檸檬酸三鈉還原的方法，制得金顆粒直徑為40nm的膠體金溶液。具體步驟為:將200mL0.01%的HC14溶液煮沸后，快速向其中加入2.2mL I %的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸至溶液顏色變?yōu)榉€(wěn)定的絳紅色，冷卻至室溫后4°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0044]⑵金標(biāo)抗體的制備
[0045]向每毫升的膠體金溶液中加入13 μ L 0.01mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH，以及8 μ g的人α-乳清蛋白單克隆抗體，穩(wěn)定后加入10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，使其終濃度為1% ;緩慢攪拌30min后,在IlOOOrpm離心40min去上清,加入等體積的硼酸緩沖液(硼酸
0.1237g,中文名稱PEG-20000 Ig,用三餾水定容至1000ml，調(diào)pH至9.0)洗滌兩次，最后加入1/20體積的硼酸緩沖液，將沉淀吹起，于4°C下儲存?zhèn)溆谩?br> [0046]3.結(jié)合墊的制備
[0047]將結(jié)合墊浸泡于0.0lM pH 7.4磷酸緩沖液(20g BSA, 25g蔗糖，3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP K-30) ,0.2gNaN3 NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g, KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)中30min后，于37°C烘干。然后用點膜儀(B1Dot公司產(chǎn)品)將制備好的抗hLALBA抗體一膠體金標(biāo)記物均勻包被在結(jié)合墊上，每厘米結(jié)合墊包被6 μ L人α -乳清蛋白抗體一膠體金標(biāo)記物，于真空干燥，真空封裝，置4°C備用。
[0048]4.樣品墊的處理
[0049]將樣品墊浸泡于0.01M pH 7.4磷酸緩沖液(20g BSA，25g蔗糖，3gPVP K-30,
0.2gNaN3 NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g, KH2PO4 0.2g，用蒸餾水定容至 1000ml)中30min后，于37°C烘干，真空封裝，置4°C備用。
[0050]5.硝酸纖維素膜的包被
[0051]用0.0lM pH 7.4PBS 緩沖液(NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g, KH2PO4
0.2g,用蒸懼水定容至1000ml,再加3%的甲醇)將人α-乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至lmg/ml,用B1dot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上作為檢測線(即T線)，包被量為I μ L/cm，檢測線靠近結(jié)合墊端，距結(jié)合墊墊端約8mm ;用0.0lMpH 7.4 PBS緩沖液(含3%的甲醇)將山羊抗兔IgG抗體稀釋2.5倍，用B1dot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線，包被量為I μ L/cm,質(zhì)控線靠近吸水墊，距吸收墊約8mm，兩線距離5?8mm。37°C烘干，封裝備用。
[0052]5.試紙條的組裝
[0053]將層析膜、樣品墊、金標(biāo)墊以及吸水紙按照圖2所示的位置關(guān)系，依次粘帖搭建到試紙條底襯上。
[0054]6.切條
[0055]用切條機將試紙條切成寬度為3.6mm?4.0mm的窄條。
[0056]7.試紙條的儲存
[0057]將切好的試紙條至于干燥器中，干燥保存。
[0058]實施例2 (應(yīng)用實施例)
[0059]牛奶中PBS緩沖液篩查免疫膠體金試紙條的使用方法
[0060]1.牛奶樣品的制備:
[0061]用PBS緩沖液(0.0lM pH7.4的磷酸鹽緩沖液，配方:NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g，KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)將牛奶樣品(采集于2010年4月，-80°C保存，保存期為14個月)10倍稀釋，同時以配方:NaCl 8g，KCl 0.2g,Na2HPO4.12H20 2.9g, KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至 1000ml 配方=NaCl 8g, KCl 0.2g,Na2HPO4-12H20 2.9g, KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml人α -乳清蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)品(來源同前)和PBS溶液作為陽性和陰性對照。
[0062]2.檢測
[0063]分別取陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品和各待檢樣品100 μ L加到微孔板中用于檢測，將膠體金試紙條插入待檢樣品中，20min后觀察結(jié)果。
[0064]3.結(jié)果判定
[0065]4.其結(jié)果如圖2所示，若待檢樣品試紙條同時出現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線，則判定為陰性樣品，即為非轉(zhuǎn)基因牛奶；若試紙條只出現(xiàn)質(zhì)控線，則判為陽性樣品，即為轉(zhuǎn)基因(人α-乳清蛋白)牛奶；若質(zhì)控線沒有出現(xiàn)，則表明該試紙條失效。用本發(fā)明的試紙條對牛奶3份樣品進行了檢測，得到如圖3所示的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因牛奶中人α-乳清蛋白免疫膠體金篩查試紙條，包括樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水紙和塑料襯板，其特征在于，在所述的塑料襯板上依次搭接粘帖有樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜和吸水紙；所述的金標(biāo)墊上包被有抗人α-乳清蛋白單克隆抗體，分泌抗人α-乳清蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株LB-001，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:C2014157 ;所述的層析膜上分別包被有人α -乳清蛋白的檢測線即Τ線和山羊抗兔IgG的質(zhì)控線，即C線。
2.一種牛奶中人α-乳清蛋白免疫膠體金篩查試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)用檸檬酸鈉與氯金酸反應(yīng)制備得到膠體金； (2)將保藏號為CCTCCNO:C2014157的雜交瘤細(xì)胞株LB-001分泌的抗人α -乳清蛋白單克隆抗體加入到步驟(1)制備的膠體金中，得到抗人α-乳清蛋白單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； (3)將抗人α-乳清蛋白單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被到金標(biāo)墊上； (4)將人α-乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品包被到層析膜上構(gòu)成檢測線，即Τ線，并將山羊抗兔IgG包被到層析膜上構(gòu)成質(zhì)控線，即C線； (5)在塑料襯板上依次搭接粘帖樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜及吸水紙，得到轉(zhuǎn)基因牛奶中人α-乳清蛋白的免疫膠體金篩查試紙條。
3.權(quán)利要求1所述的試紙條在篩查轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因牛奶檢測中的應(yīng)用。
4.一株分泌抗人α-乳清蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株LB-001，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:C2014157。
5.權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞株LB-001分泌的抗人α-乳清蛋白單克隆抗體在制備轉(zhuǎn)基因牛奶中人α-乳清蛋白免疫膠體金篩查試紙條中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/68GK104267189SQ201410441846
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】劉榜, 陶晨雨, 石德時, 張慶德 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)