專利名稱：涉及miR-155對(duì)于錯(cuò)配修復(fù)和基因組穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)的材料和方法
涉及miR-155對(duì)于錯(cuò)配修復(fù)和基因組穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)的材料和方法
發(fā)明人CarloM. Croce, Nicola Valeri
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本發(fā)明大體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，其涉及癌癥相關(guān)的技術(shù)。本發(fā)明的某些方面包括與miR-155相關(guān)的病癥的診斷、治療和預(yù)后中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
錯(cuò)配的核苷酸可來源于聚合酶誤摻入差錯(cuò)，異等位基因親代染色體之間的重組， 或DNA的化學(xué)和物理損傷。MutS同源物(MSH)和MutL同源物(MLH/PMS)是高度保守的蛋白并且對(duì)于MMR切除反應(yīng)是必不可少的。在人類細(xì)胞中，hMSH2和hMLHl是MMR的基礎(chǔ)成分。hMSH2蛋白與hMSH3或hMSH6形成異二聚體，并且是錯(cuò)配/損傷識(shí)別所需的，而hMLHl 蛋白與hMLH3或hPMS2形成異二聚體，并與MSH異二聚體形成三重復(fù)合物以完成切除修復(fù)反應(yīng)。人類細(xì)胞含有比hMSH2-hMSH3/hMLHl-hMLH3復(fù)合物(其主要修復(fù)大的IDL錯(cuò)配)至少多10倍的hMSH2-hMSH6/hMLHl-hPMS2復(fù)合物(其修復(fù)單核苷酸和小的插入刪除環(huán)(IDL) 錯(cuò)配)。除了 MMR，已經(jīng)表明hMSH2-hMSH6/hMLHl-hPMS2成分獨(dú)特地識(shí)別DNA中的損傷和單細(xì)胞周期阻抑和細(xì)胞凋亡。
已證明hMSH2, hMSH6, hMLHl和hPMS2核心MMR基因中的突變與LS/HNPCC相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)為突變子假說(Mutator Hypothesis)提供了相當(dāng)大的支持，因?yàn)镸SH和MLH/ PMS基因中的缺陷顯著增加細(xì)胞突變率，然后后者可驅(qū)動(dòng)癌癥中發(fā)現(xiàn)的多個(gè)癌基因的進(jìn)化和腫瘤阻抑子基因突變。突變子表型的一個(gè)標(biāo)志是簡(jiǎn)單重復(fù)序列或微衛(wèi)星DNA的不穩(wěn)定性 (微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或MSI)。幾乎所有的LS/HNPCC腫瘤都顯示出MSI，其為核心MMR基因的突變的或遺傳性表觀遺傳失活的結(jié)果。10%-40%的顯示出MSI的散發(fā)性結(jié)腸直腸癌(sporadic CRC)、子宮內(nèi)膜、卵巢、胃和泌尿道上皮腫瘤中多數(shù)是獲得性hMLHl啟動(dòng)子甲基化的結(jié)果。 大約95%的MSI腫瘤可以至少部分由核心MMR成分的突變和/或表觀遺傳失活來解釋。剩余的5%以及很大比例的雙等位基因MMR失活機(jī)制仍然知之甚少。
微小RNA(miR)是非編碼RNA，其在超過30%的控制關(guān)鍵生物學(xué)過程(包括發(fā)育、 細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和增殖)的人類基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。已經(jīng)在CRC中觀察到 miR-155的過表達(dá)，并且相對(duì)于微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)腫瘤顯示出更經(jīng)常的MSI CRC。
本部分中公開的背景參考文獻(xiàn)不是被承認(rèn)在法律上構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。
雖然在與MMR功能失調(diào)相關(guān)的疾病中進(jìn)行了可觀的研究，但是它們?nèi)匀皇请y以診斷和有效治療的，患者中觀察到的死亡率表明需要這些疾病的診斷、治療和預(yù)防方面的改進(jìn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于下列信息和發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)(MMR)的失活是常見的癌癥易感病癥 Lynch綜合征(LS ;或;遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌，HNPCC)以及10%_40%的散發(fā)性結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜、卵巢、胃和泌尿道上皮癌癥的誘因。升高的突變率(突變子表型)(包括簡(jiǎn)單重復(fù)不穩(wěn)定性)(微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或MSI)是MMR缺陷的標(biāo)志。微小RNA(miR)已被指參與涉及發(fā)育和癌癥的關(guān)鍵細(xì)胞途徑的控制。在本文中，本發(fā)明人顯示miR-155的過表達(dá)顯著下調(diào)核心MMR蛋白，hMSH2、hMSH6和hMLHl，誘導(dǎo)突變子表型和MSI。在人結(jié)腸直腸癌(CRC) 中發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)與MLHl或MSH2蛋白表達(dá)之間具有相反關(guān)系。最后，多種具有未知起因的MMR失活的MSI腫瘤顯示出miR-155過表達(dá)。這些數(shù)據(jù)為“miR-155調(diào)節(jié)MMR作為癌癥病理發(fā)生的新機(jī)制”提供了支持。
通過閱讀優(yōu)選實(shí)施方式的下列具體描述和附圖，本發(fā)明的多個(gè)方面和優(yōu)點(diǎn)將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員變得明顯。
本發(fā)明提供了物質(zhì)組合物，其包含至少一種反義miRNA和至少一種另外的成分， 其中所述反義miRNA對(duì)于能夠下調(diào)至少一種核心MMR蛋白的miRNA是反義的，并且其中所述至少一種另外的成分對(duì)于治療MMR相關(guān)的疾病是有用的。優(yōu)選地，所述至少一種另外的成分選自化療藥物；干細(xì)胞；AG1478 ;吉非替尼(Iressa );埃羅替尼(Tareeva );西妥昔單抗；帕木單抗；zalutumamab ;尼妥珠單抗；馬妥珠單抗；和拉帕替尼。優(yōu) 選地，所述反義 miRNA是miRNA-155，和/或其中所述至少一種核心MMR蛋白選自hMSHl ；hMSH6 ;和hMLHl。
還提供了鑒定測(cè)試樣品中的MMR功能失調(diào)細(xì)胞的方法，包括將測(cè)試樣品中的 miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平進(jìn)行比較，其中差別表達(dá)的miRNA-155水平指示測(cè)試樣品包含MMR功能失調(diào)細(xì)胞。
還提供了診斷受試者是否具有或處于產(chǎn)生MMR突變體細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平進(jìn)行比較，其中差別表達(dá)的 miRNA-155水平診斷該受試者具有或處于產(chǎn)生MMR突變體細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。
還提供了診斷受試者是否具有或處于患Lynch綜合征的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平進(jìn)行比較，其中差別表達(dá)的miRNA-155 水平診斷該受試者具有或處于患Lynch綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。
還提供了診斷受試者是否具有或處于患遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平進(jìn)行比較，其中差別表達(dá)的 miRNA-155水平診斷該受試者具有或處于患遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
還提供了診斷受試者是否具有或處于患癌癥的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平進(jìn)行比較，其中差別表達(dá)的miRNA-155水平診斷該受試者具有或處于患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，其中所述癌癥選自結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌和泌尿道上皮癌。
還提供了提供患者的預(yù)后的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的 miRNA-155水平進(jìn)行比較，其中下調(diào)的miRNA-155水平指示差的預(yù)后。
還提供了在有治療需要的患者中治療MMR功能失調(diào)的方法，包括施用藥學(xué)有效量的本文的組合物。優(yōu)選的是這樣的方法其中所述MMR功能失調(diào)選自成神經(jīng)細(xì)胞瘤；肺癌； 膽管癌；非小細(xì)胞肺癌；肝細(xì)胞癌；淋巴瘤；鼻咽癌；卵巢癌；頭頸鱗狀細(xì)胞癌；鱗狀細(xì)胞子宮頸癌；胃癌；結(jié)腸癌；子宮頸癌；膽囊癌；前列腺癌；乳腺癌；睪丸生殖細(xì)胞腫瘤；大細(xì)胞淋巴瘤；濾泡性淋巴瘤；結(jié)腸直腸癌；惡性胸膜間皮瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；甲狀腺癌；基底細(xì)胞癌；T細(xì)胞淋巴瘤；t(8;17)-幼淋巴細(xì)胞白血?。还撬柙錾惓＞C合征；胰腺癌；t(5;14) (q35.1;q32. 2)白血??；惡性纖維組織細(xì)胞瘤；胃腸間質(zhì)腫瘤；和肝母細(xì)胞瘤；另外優(yōu)選的是這樣的方法其中所述癌癥選自結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜癌；卵巢癌；胃癌；和泌尿道上皮癌。
還提供了在有治療需要的MMR功能失調(diào)患者中治療癌癥的方法，包括施用藥學(xué)有效量的反義miRNA，其中所述反義miRNA對(duì)于miRNA-155是反義的。優(yōu)選的是這樣的方法，其中被治療的癌癥選自結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜癌；卵巢癌；胃癌；和泌尿道上皮癌。另外優(yōu)選的是這樣的方法，其進(jìn)一步包括施用佐劑。更優(yōu)選的是這樣的方法，其進(jìn)一步包括施用選自下列的化合物化療藥物；干細(xì)胞；AG1478 ;吉非替尼(Iressa );埃羅替尼(Tarceva ); 西妥昔單抗；帕木單抗；zalutumamab ;尼妥珠單抗；馬妥珠單抗；和拉帕替尼。
還提供了用于誘導(dǎo)MMR功能失調(diào)細(xì)胞的凋亡的方法，包括導(dǎo)入凋亡有效量的本文描述的組合物。
還提供了用于誘導(dǎo)MMR功能失調(diào)細(xì)胞的凋亡的方法，包括導(dǎo)入凋亡有效量的反義 miRNA，其中所述反義miRNA對(duì)于miR-155是反義的。優(yōu)選的是這樣的方法，其中所述細(xì)胞由于至少一種下調(diào)的核心MMR蛋白而功能失調(diào)，所述蛋白選自hMSH2 ；hMSH6 ;和hMLHl。另外優(yōu)選所是這樣的方法，其中所述細(xì)胞由于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性而功能失調(diào)。另外優(yōu)選的是這樣的方法，其進(jìn)一步包括導(dǎo)入選自下列的化合物化療藥物；干細(xì)胞;AG1478 ;吉非替尼 (Iressa );埃羅替尼(Tarceva );西妥昔單抗；帕木單抗；zalutumamab ;尼妥珠單抗； 馬妥珠單抗；和拉帕替尼。
還提供了鑒定藥學(xué)上有用的組合物的方法，包括將反義miRNA-155導(dǎo)MMR功能失調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)物中；將測(cè)試組合物導(dǎo)入MMR功能失調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)物中；和將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的測(cè)試組合物鑒定為藥學(xué)上有用的組合物。
還提供了預(yù)測(cè)患有MMR功能失調(diào)疾病的患者的臨床結(jié)果的方法，包括檢測(cè)獲自患者的MMR功能失調(diào)疾病細(xì)胞樣品中的miR-155的表達(dá)水平，其中相對(duì)于對(duì)照，miR-155水平1. 5倍或更高的增加并聯(lián)合MMR功能失調(diào)狀態(tài)預(yù)測(cè)了存活的減少。
還提供了鑒定用于治療MMR功能失調(diào)疾病的治療劑的方法，包括在體外篩選候選試劑以選擇降低miR-155的表達(dá)的試劑，從而鑒定用于治療MMR功能失調(diào)疾病的試劑。
還提供了用于鑒定MMR功能失調(diào)疾病中的差別表達(dá)的miR-155的試劑盒，包含 miR-155的至少一種分子鑒別物。
還提供了用于鑒定肺癌中的差別表達(dá)的miR-155的試劑盒，包含miR-155的至少一種分子鑒別物，其中所述分子鑒別物選自探針、引物、抗體或小分子。


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圖1A-1B。hMLHl, hMSH2 和 hMSH6 是 miR-155 的直接靶標(biāo)。
圖1A顯示了所示基因的3’ UTR和/或⑶S中的miR-155的靶位點(diǎn)的位置(另見圖6)。堿基位置從⑶S中的第一個(gè)核苷酸開始數(shù)。
圖1B :以phRL-SV40構(gòu)建體(作為對(duì)照)和螢光素酶構(gòu)建體WT或MUT-155和以 pre-miR-155或preniR對(duì)照轉(zhuǎn)染的Colo_320DM細(xì)胞。24小時(shí)后，進(jìn)行雙螢光素酶測(cè)定。 *p<0. 005 :相對(duì)于 pre-miR 對(duì)照。
圖2A-2C miR-155的過表達(dá)降低了 CRC細(xì)胞中MLH1、MSH2和MSH6的表達(dá)。以針對(duì)所選基因的pre-miR-155、pre-miR對(duì)照或siRNA轉(zhuǎn)染Colo_320DM細(xì)胞48小時(shí)。
圖2A :通過實(shí)時(shí)PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率。將miR-155表達(dá)針對(duì)RNU44進(jìn)行歸一化。誤差條表示 S. E. Μ. *ρ〈0· 001 (Ν=3)。
圖2Β :miR-155對(duì)于MMR核心蛋白具有轉(zhuǎn)錄后效應(yīng)。將所示基因的mRNA表達(dá)針對(duì)紐蛋白(vinculin)的表達(dá)進(jìn)行歸一化。誤差條表示S. E. M. $〈0. 05,相對(duì)于對(duì)照 pre-miR(N=3)。
圖2C顯示了 western印跡分析的代表性印跡以及3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和 S. E. M.。*ρ〈0· 005，相 對(duì)于對(duì)照 pre-miR。
圖3A-3D。具有miR-155過表達(dá)的穩(wěn)定克隆。miR-155過表達(dá)對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞系的功能效應(yīng)。以過表達(dá)miR-155的慢病毒載體(Colo-155)或空載體(Colo空)穩(wěn)定感染 MMR 活性 Colo-320DM 細(xì)胞。
圖3A :代表性的Western分析以及3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和S. E. M.。*p〈0. 05，相對(duì)于對(duì)照。
圖3B :通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)定的所選基因的mRNA表達(dá)(針對(duì)紐蛋白進(jìn)行歸一化)。誤差條表示 S. E. Μ. *ρ〈0· 05 (Ν=3)。
圖3C :通過Northern分析測(cè)定miR-155表達(dá)(MV-411細(xì)胞用作陽性對(duì)照)。
圖3D :使用BAT-26和BAT 25 (單核苷酸重復(fù))和D17S250 ( 二核苷酸重復(fù))標(biāo)志物進(jìn)行的Colo-155和Colo-空細(xì)胞的微衛(wèi)星分析。上面顯示了大小標(biāo)志物。
圖4A-4B miR-155表達(dá)與CRC組織中的MLHl和MSH2反相關(guān)。
圖4A :石蠟包埋的、福爾馬林固定的CRC組織與LNA探針抗-miR-155或亂序探針和針對(duì)MSH2和MLHl的IHC抗體溫育。顯示了使用Nuance系統(tǒng)軟件捕獲的代表性照片，對(duì)于miR-155和MSH2或MLHl是陽性染色。藍(lán)色和紅色染色分別鑒定出miR-155和靶蛋白。 未觀察到miR-155和MLHl或MSH2在相同細(xì)胞巢中的共定位。
圖4B :從新鮮冷凍的人結(jié)腸直腸組織提取的RNA和蛋白質(zhì)。通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)定miR-155的表達(dá)，通過Western分析測(cè)定MMR蛋白表達(dá)。顯示了具有上調(diào)(大于2倍)的miR-155表達(dá)和下調(diào)的MMR蛋白表達(dá)的CRC。觀察到相對(duì)于鄰近的正常組織，腫瘤中的 “hMLHl和hMSH2表達(dá)喪失”與“miRNA-155表達(dá)增加3倍以上”之間的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)(紅線)。 miR-155癌癥/正常組織比例小于3倍的樣品顯示出對(duì)于MMR表達(dá)的不確定的效應(yīng)。
圖5A-5B hMLHl陰性腫瘤中的miR-155表達(dá)。通過原位雜交在石蠟包埋的組織上測(cè)定了 miRNA-155表達(dá)。
圖5A CR-78癌癥組織(具有起因未知的MLHl喪失)顯示出強(qiáng)烈的miR-155表達(dá) (大箭頭)，而間質(zhì)(小箭頭)對(duì)于miR-155表達(dá)是陰性的。
圖5B CR-79組織(由于啟動(dòng)子甲基化而喪失MLH1)僅在炎性細(xì)胞中顯示出微弱的miR-155表達(dá)(大箭頭)。在癌癥組織中未檢測(cè)到信號(hào)(小箭頭)。
圖6A-6C miR-155的預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)。顯示了 miR-155在下列基因中的預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)=MLHl (分別是SEQ ID NOS 21-22，23和22，按照出現(xiàn)次序)(圖6A)、MSH2 (分別是 SEQ ID NOS 24和22，按照出現(xiàn)次序(圖6B)和MSH6(分別是SEQ ID NOS 25和22，按照出現(xiàn)次序)(圖6C)。
圖7 CRC組織中的miR-155和MMR蛋白表達(dá)。miR-155調(diào)節(jié)MLHl和MSH6的異源表達(dá)。以編碼MLHl或MSH6蛋白的質(zhì)粒和表達(dá)miRNA-155的載體或亂序載體共轉(zhuǎn)染分別缺乏MLHl和MSH6的HCT-116和DLD-1細(xì)胞系。以miR-155進(jìn)行的共轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了 MLHl和 MSH6蛋白表達(dá)的降低。MLHl和MSH6的⑶S中的結(jié)合位點(diǎn)的破壞導(dǎo)致表達(dá)截短的蛋白(分別是73KD和150KD)。使用針對(duì)MLHl和MSH6的N末端抗體來檢測(cè)WT和截短的蛋白。在 MSH6的情況下，蛋白大小上的偏移不太可檢出，這是由于較高的分子量和使用了 4-20梯度 凝膠。即使在存在截短的蛋白MLHl的情況下，仍然存在失調(diào)，這是由于保守性的3’ UTR結(jié)合位點(diǎn)。兩個(gè)MLHl種子區(qū)的破壞導(dǎo)致miR-155活性的喪失。顯示了代表性的印跡，3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)歸一化。誤差條代表平均值和S. E. Μ. *p<0. 005，相對(duì)于空載體。
圖8A-8C :miR-155的抑制增加了 MMR蛋白的表達(dá)。以抗-miR-155或抗-miR對(duì)照轉(zhuǎn)染MV4-11細(xì)胞48小時(shí)(圖8A)，通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)定miR-155的表達(dá)(針對(duì)RNU6進(jìn)行歸一化)。誤差條代表一式三份的平均值和S. E. M.。*P:0. 003。
圖8B :通過northern印跡分析測(cè)定miR-155。
圖SC :在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后獲得細(xì)胞裂解物，并以所示的抗體進(jìn)行免疫印跡。顯示了代表性印跡以及3次實(shí)驗(yàn)的定量。*p〈0.005
圖9A-9C CRC組織中的miR-155和MMR蛋白表達(dá)。
圖9A :使用對(duì)于miR-155具有陽性染色的炎性肝硬化組織作為陽性對(duì)照。
圖9B :石蠟包埋的、福爾馬林固定的CRC組織與LNA探針抗-miR-155或亂序探針和針對(duì)MSH2和MLHl的IHC抗體溫育?；诰哂锌蓹z測(cè)的表達(dá)的細(xì)胞百分率對(duì)miR-155表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。以LNA、抗-miR-155或LNA亂序探針染色的3個(gè)不同核心蛋白的代表。當(dāng)分別在>15%和>5%的細(xì)胞中檢測(cè)到陽性時(shí)，對(duì)miR-155和MMR蛋白進(jìn)行評(píng)分。
圖9C :顯示了具有對(duì)于miR-155和MLHl或MSH2的陽性或陰性染色的情況的比例的總結(jié)數(shù)據(jù)和代表性圖示。
詳細(xì)描述
本發(fā)明提供了涉及這些新發(fā)現(xiàn)的材料和方法。特別地，用于治療如本文描述的以及如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些病癥的組合物。還提供了用于鑒定對(duì)治療有用的另外的組合物的方法，診斷方法，提供預(yù)后的方法，誘導(dǎo)凋亡的方法等。還提供了與這些發(fā)現(xiàn)相關(guān)的研究工具，特別是試劑盒等。
定義
DNA :脫氧核糖核酸
mRNA :信使 RNA
PCR :聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
pre-miRNA :前體微小 RNA
qRT-PCR :定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
RNA :核糖核酸
應(yīng)該理解，上述一般性定義和下述詳細(xì)描述僅是示例性的，不是意在限制本教導(dǎo)的范圍。在本申請(qǐng)中，單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)，除非另有明確指明。
當(dāng)與術(shù)語“包含”在權(quán)利要求和/或說明書中聯(lián)合使用時(shí)，詞語“一種”的使用可以表示“一個(gè)”，但也與“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多于一個(gè)”的意思相一致。
同樣，“包含”、“含有”和“包括”或這些詞語的變體不是意在限制。術(shù)語“和/或” 意思是之前和之后的術(shù)語可以聯(lián)合或分開。舉例而言，但不是限制，“X和/或Y”可以表示 “X或Y”或“X和Y”。
應(yīng)該理解，miRNA源自基因組序列或基因。在該方面，術(shù)語“基因”用于簡(jiǎn)便地指編碼前體miRNA(對(duì)于給定 的miRNA)的基因組序列。然而，本發(fā)明的實(shí)施方式可包括涉及其表達(dá)的miRNA的基因組序列，例如啟動(dòng)子或其它調(diào)節(jié)序列。
術(shù)語“miRNA” 一般是指單鏈分子，但是在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明中使用的分子包括與相同的單鏈分子的另一區(qū)域或與另一核酸分子部分互補(bǔ)(在整條連的長(zhǎng)度上具有 10%-50%的互補(bǔ)性)、實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)(在整條鏈的長(zhǎng)度上大于50%但是小于100%互補(bǔ))或完全互補(bǔ)的區(qū)域或另外的鏈。因此，核酸可包括這樣的分子，其包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)或自我互補(bǔ)鏈或包含分子的特定序列的“互補(bǔ)物”。例如，前體miRNA可具有自我互補(bǔ)區(qū)域，其與本發(fā)明的miRNA探針至多100%互補(bǔ)，可以與它們的靶標(biāo)至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%或100%互補(bǔ)。
如本文使用的術(shù)語“其組合”是指術(shù)語前所列項(xiàng)目的所有排列和組合。例如“A、B、 C或其組合”意思包括至少下列之一 :A, B, C，AB, AC, BC或ABC，如果順序在特定的情境下具有重要意義，則還包括BA，CA, CB, ACB, CBA, BCA, BAC或CAB。
除非另有指明，否則根據(jù)常規(guī)用法使用技術(shù)術(shù)語。分子生物學(xué)中常見的術(shù)語的定義可以見 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew et al. (eds.) , The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers(ed. ), Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc. , 1995(ISBN 1-56081-569-8)。
為了促進(jìn)閱讀本公開的各個(gè)實(shí)施方式，提供了特定術(shù)語的下列解釋
輔助治療用于與主要治療組合以改善主要治療的效果的治療。
臨床結(jié)果是指患者在接受針對(duì)疾病或病癥的治療之后或不進(jìn)行治療的情況下的健康狀況。臨床結(jié)果包括但不限于生存時(shí)間的增加，生存時(shí)間的減少，生存機(jī)會(huì)的增加，死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加，生存，無疾病生存，慢性疾病，轉(zhuǎn)移，晚期或攻擊性疾病，疾病復(fù)發(fā)，死亡，以及對(duì)于治療的有利或差的應(yīng)答。
對(duì)照“對(duì)照”是指用于與實(shí)驗(yàn)樣品例如獲自患者的腫瘤樣品比較的樣品或標(biāo)準(zhǔn)物。
細(xì)胞因子由多種造血和非造血細(xì)胞產(chǎn)生的影響其它細(xì)胞的行為的蛋白。細(xì)胞因子對(duì)于先天性和獲得性免疫應(yīng)答都具有重要意義。
存活的減少如本文使用的“存活的減少”是指患者生存時(shí)間的減少，或患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加。
檢測(cè)表達(dá)水平例如，“檢測(cè)miR或miRNA表達(dá)的水平”是指定量樣品中存在的miR 或miRNA的量。檢測(cè)特定miR或任何微小RNA的表達(dá)可通過使用本領(lǐng)域已知的或本文描述的任何方法來進(jìn)行，例如qRT-PCR。檢測(cè)miR的表達(dá)包括檢測(cè)成熟形式的miRNA或與miRNA 表達(dá)相關(guān)的前體形式的表達(dá)。通常而言，miRNA檢測(cè)方法包括序列特異性檢測(cè)，例如通過 RT-PCILmiR特異性引物和探針可使用前體和成熟miR核酸序列來設(shè)計(jì)，其是本領(lǐng)域已知的并在本文中以SEQ ID NO提供。
微小RNA(miRNA):調(diào)節(jié)基因表達(dá)的單鏈RNA分子。微小RNA —般長(zhǎng)度是21_23個(gè)核苷酸。微小RNA是從被稱作pr1-miRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工為被稱作前體(pre)-miRNA的短的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，最后加工為功能性的成熟的微小RNA。成熟的微小RNA分子是與一個(gè)或多個(gè)信使RNA分子部分互補(bǔ)的，它們的主要功能是下調(diào)基因表達(dá)。微小RNA通過RNAi途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
miR表達(dá)如本文使用的“低miR表達(dá)”和“高miR表達(dá)”是相關(guān)的術(shù)語，是指樣 品中的miRNA的水平。在一些實(shí)施方式中，通過比較一組對(duì)照樣品和測(cè)試樣品中的miRNA水平來確定低和高miR表達(dá)。然后可以基于樣品中的miR的表達(dá)是高于(高)還是低于(低) 平均或中值miR表達(dá)水平而為各個(gè)樣品分配低和高表達(dá)。對(duì)于個(gè)體樣品，可通過將樣品與對(duì)照或已知具有高或低表達(dá)的參考樣品進(jìn)行比較或與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較來確定高或低miR 表達(dá)。低和高miR表達(dá)可包括前體或成熟形式miRNA或二者的表達(dá)。
患者如本文使用的術(shù)語“患者”包括人和非人動(dòng)物。用于治療的優(yōu)選患者是人。 “患者”和“受試者”在本文中可相互替換地使用。
藥學(xué)上可接受的載體用于本公開中的藥學(xué)上可接受的載體(介質(zhì))是常規(guī) 的° Remington, s Pharmaceutical Sciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 15th Edition (1975)描述了適合于藥學(xué)遞送一種或多種治療化合物、分子或試劑的組合物和制劑。
一般地，載體的性質(zhì)將取決于所采用的具體施用途徑。例如，胃腸外制劑通常包括可注射液體，其包括藥學(xué)和生理上可接受的液體，例如水、生理鹽水、緩沖的鹽溶液，水性葡萄糖，甘油等，作為介質(zhì)。對(duì)于固體組合物(例如，粉末、丸、片劑或膠囊形式)，常規(guī)的非毒性固體載體可包括例如，藥物級(jí)別的甘露糖、甘油、淀粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體之外，待施用的藥物組合物可包含少量的非毒性輔佐性物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑，防腐劑， 和PH緩沖劑等，例如乙酸鈉或山梨糖醇酐單月桂酸酯。
預(yù)防、治療或緩解疾病“預(yù)防”疾病是指抑制疾病的完全發(fā)生?！爸委煛笔侵?，在疾病或病理狀況的跡象或癥狀開始出現(xiàn)之后，緩解其的治療性干預(yù)?！熬徑狻笔侵笢p少疾病的跡象或癥狀的次數(shù)或嚴(yán)重性。
篩選如本文使用的“篩選”是指用于評(píng)價(jià)和鑒定影響疾病的候選試劑的過程。微小RNA的表達(dá)可使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的多種技術(shù)來定量，例如通過微陣列分析或通過 qRT-PCR。
小分子這樣的分子，通常具有小于大約1000道爾頓的分子量，或在一些實(shí)施方式中，具有小于大約500道爾頓的分子量，其中該分子能夠改變(在某種可測(cè)程度上)靶分子的活性。
治療包括診斷和治療的一般性術(shù)語。
治療劑當(dāng)正確地施用至受試者時(shí)，能夠誘導(dǎo)期望的治療或預(yù)防效應(yīng)的化學(xué)化合物、小分子或其它組合物，例如反義化合物，抗體，蛋白酶抑制劑，激素，趨化因子或細(xì)胞因子。
如本文使用的“候選試劑”是所選擇的用于篩選以確定其是否作為治療劑發(fā)揮作用的化合物?！皽赜卑ㄊ乖噭┡c細(xì)胞或組織接觸足夠的時(shí)間?！敖佑|”包括將固體或液體形式的試劑與細(xì)胞或組織溫育。使用試劑“處理”細(xì)胞或組織包括將該試劑與細(xì)胞或組織接觸。
治療有效量足以在以試劑進(jìn)行處理的受試者或細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)期望效應(yīng)的制定的藥物或治療劑的量。試劑的有效量將取決于多個(gè)因素，包括但不限于被治療的受試者，和治療成分的施用方式。
在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方式中，使用對(duì)照是理想的。在該方面，對(duì)照可以是獲自相同患者的非癌性組織樣品，或獲自健康受試者例如健康組織供體的組織樣品。在另一例子中，對(duì)照是從歷史值計(jì)算而來的標(biāo)準(zhǔn)物。腫瘤樣品和非癌性組織樣品可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方 法來獲得。例如，腫瘤和非癌性樣品可獲自經(jīng)歷了切除的癌癥患者，或者可使用皮下注射針頭通過提取獲得，通過微解剖，或通過激光捕獲來獲得。對(duì)照(非癌性)樣品可獲自例如尸體供者或來自健康供體。
在一些實(shí)施方式中，篩選包括將候選試劑與細(xì)胞接觸。細(xì)胞可以是獲自患者的原代細(xì)胞，或者細(xì)胞可以是永生化細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
候選試劑可以是任何類型的試劑，例如蛋白、肽、小分子、抗體或核酸。在一些實(shí)施方式中，候選試劑是細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方式中，候選試劑是小分子。篩選包括高通量篩選和篩選單個(gè)或一小組候選試劑。
微小RNA檢泖丨
在本文的一些方法中，理想的是鑒定樣品中存在的miRNA。
前體微小RNA (pre-miRNA)和成熟miRNA的序列是公眾可獲得的，例如通過 miRBase 數(shù)據(jù)庫，可通過 Sanger Institute(see Griffiths-Jones et al. , Nucleic Acids Res. 36:D154-D158, 2008;Griffiths-Jones et al. , Nucleic Acids Res. 34:D140-D144, 2006;and Griffiths-Jonesj Nucleic Acids Res. 32:D109_D111，2004) 在線獲得。本文提供了目前公開的優(yōu)選的家族成員的前體和成熟形式的序列。
RNA表達(dá)的檢測(cè)和定量可通過本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任一種來進(jìn)行(見，例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0211000和2007/0299030，通過引用方式并入本文)，并且如下文所描述。使用RNA家族成員的已知序列，可以視情況設(shè)計(jì)用于下文描述的檢測(cè)方法的特定探針和引物。
在一些情況下，RNA檢測(cè)方法需要從樣品、例如細(xì)胞或組織樣品分離核酸。核酸， 包括RNA、具體為miRNA，可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)來分離。例如，基于苯酚的提取是用于分離RNA的常用方法。基于苯酚的試劑包含變性劑和RNase抑制劑的組合，用于細(xì)胞和組織破壞和隨后從污染物中分離RNA?；诒椒拥姆蛛x程序可以回收10-200個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的RNA種類(例如前體和成熟miRNA，5S和5. 8S核糖體RNA (rRNA)，和Ul小細(xì)胞核RNA (snRNA)。另外，提取程序例如使用TRIZ0L 或TRI REAGENT 的程序?qū)⒓兓械腞NA，包括大的和小的，其是用于從包含miRNA和小干擾RNA (siRNA)的生物樣品中分離總 RNA的有效方法。
在一些實(shí)施方式中，使用微陣列是理想的。微陣列是核酸、蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞或其它能夠平行分析復(fù)雜生物樣品的物質(zhì)的微觀的、有序的陣列。DNA陣列由不同的核酸探針組成，所述核酸探針被稱作捕獲探針，其化學(xué)地附著于固體基質(zhì)，所述基質(zhì)可以是微芯片、載玻片或微球體大小的珠子。微陣列可用于例如同時(shí)測(cè)定大量的信使RNA(mRNA)和/ 或miRNA的表達(dá)水平。
微陣列可使用多種技術(shù)來制造，包括使用細(xì)琢筆印至載玻片上，使用預(yù)制的掩膜板(mask)進(jìn)行的照相平版印刷術(shù)，使用動(dòng)態(tài)微鏡裝置進(jìn)行的照相平版印刷術(shù)，噴墨打印或在微電極陣列上進(jìn)行的電化學(xué)。
miRNA的微陣列分析，可根據(jù)例如本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行(雖然這些程序可以以修改的形式用于任何RNA分析)(見，例如，PCT公開號(hào)WO 2008/054828; Ye et al. , Nat. Med. 9 (4) :416-423, 2003 ; Calinet al. , N. Engl. J. Med. 353 (17) : 1793-1801，2005 ;各自通過引用方式并入本文)。在一個(gè)實(shí)例中，從細(xì)胞或組織樣品中提取RNA，使用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳從總RNA中對(duì)于小RNA (18-26個(gè)核苷酸的RNA)進(jìn)行大小選擇。將寡核苷酸接頭連接于小RNA的5’和3’末端，得到的連接產(chǎn)物用作RT-PCR反應(yīng)的模板，進(jìn)行10個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。正義鏈PCR引物具有連接至其5’末端的熒光團(tuán)，從而熒光地標(biāo)記PCR產(chǎn)物的正義鏈。使PCR產(chǎn)物變性，然后與微陣列雜交。PCR產(chǎn)物被稱作靶核酸，其與陣列上的對(duì)應(yīng)的miRNA捕獲探針序列互補(bǔ)，將通過堿基配對(duì)與斑點(diǎn)雜交，在所述斑點(diǎn)處固定了捕獲探針。當(dāng)使用微陣列激光掃描儀激發(fā)時(shí)，斑點(diǎn)將發(fā)熒光。然后就特定miRNA的拷貝數(shù)，使用多個(gè)陽性和陰性對(duì)照和陣列數(shù)據(jù)歸一化方法來測(cè)評(píng)每個(gè)斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，這將產(chǎn)生特定miRNA的表達(dá)水平的測(cè)定。
在替代性方法中，直接使用從細(xì)胞或組織樣品提取的包含小RNA級(jí)份(包括 miRNA)的總RNA，不對(duì)小RNA進(jìn)行大小選擇，使用T4RNA連接酶或熒光標(biāo)記的短RNA接頭對(duì) 3’末端進(jìn)行標(biāo)記。通過在30° C溫育2小時(shí)來標(biāo)記RNA樣品，然后在80° C熱滅活T4RNA 連接酶5分鐘?；パa(bǔ)于陣列上的對(duì)應(yīng)miRNA捕獲探針序列的熒光標(biāo)記的miRNA將通過堿基配對(duì)與斑點(diǎn)雜交，在所述斑點(diǎn)處固定了捕獲探針。如上文所述進(jìn)行微陣列掃描和 數(shù)據(jù)處理。
有幾種類型的微陣列可以利用，包括斑點(diǎn)化的寡核苷酸微陣列，預(yù)制的寡核苷酸微陣列和斑點(diǎn)化的長(zhǎng)寡核苷酸陣列。在斑點(diǎn)化的寡核苷酸微陣列中，捕獲探針是互補(bǔ)于 miRNA序列的寡核苷酸。這種類型的陣列通常與經(jīng)兩種不同的熒光團(tuán)標(biāo)記的、來自待比較的兩個(gè)樣品(例如非癌性組織和癌性或樣品組織)的經(jīng)大小選擇的小RNA的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物雜交?；蛘?，從兩個(gè)樣品中提取包含小RNA級(jí)份(包括miRNA)的總RNA，不對(duì)小RNA進(jìn)行大小選擇，使用T4RNA連接酶和以兩種不同的熒光團(tuán)標(biāo)記的短RNA接頭對(duì)3’末端進(jìn)行標(biāo)記。然后將樣品混合并與單一微陣列進(jìn)行雜交，雖然掃描該微陣列，使得在一個(gè)陣列中可視化上調(diào)和下調(diào)的miRNA基因。
在預(yù)制的寡核苷酸微陣列或單通道微陣列中，將探針設(shè)計(jì)為與已知或預(yù)測(cè)的 miRNA的序列相匹配。有覆蓋完整基因組的商業(yè)上可獲得的設(shè)計(jì)(例如,來自Affymetrix 或Agilent)。這些微陣列提供基因表達(dá)的絕對(duì)值的估算，所以，兩種條件下的比較需要使用兩個(gè)單獨(dú)的微陣列。
斑點(diǎn)化的寡核苷酸陣列由50-mer至70_mer的寡核苷酸捕獲探針組成,通過噴墨或或自動(dòng)化打印產(chǎn)生。短的寡核苷酸陣列由20-mer至25_mer的寡核苷酸探針組成,通過照相平版印刷術(shù)合成(Affymetrix)或通過自動(dòng)化打印來產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方式中，使用定量RT-PCR是理想的。定量RT-PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的改進(jìn)，其用于迅速測(cè)定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物的量。qRT-PCR普遍用于測(cè)定基因序列、例如miR是否存在于樣品中，如果存在，測(cè)定其在樣品中的拷貝數(shù)。任何能夠測(cè)定核酸分子、 包括miRNA表達(dá)的PCR方法，都落在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域已知有qRT-PCR方法的幾種變體，以下描述其中三種。
用于定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法包括但不限于，通過瓊脂糖凝膠電泳，使用SYBR Green (雙鏈DNA染料)，和使用熒光報(bào)告探針。后兩種可以實(shí)時(shí)分析。
使用瓊脂糖凝膠電泳，制備未知樣品和已知濃度的靶DNA的類似大小的部分的已知樣品，以用于擴(kuò)增。在相同的條件下(優(yōu)選使用相同的引物，或至少相似退火溫度的引物)進(jìn)行兩個(gè)反應(yīng)，持續(xù)相同的時(shí)間。瓊脂糖凝膠電泳用于將反應(yīng)產(chǎn)物與其原始DNA和 過量引物分離。測(cè)定已知和未知樣品的相對(duì)量以確定未知的量。
SYBR Green染料的使用相對(duì)于瓊脂糖凝膠方法更精確，并且可以實(shí)時(shí)給出結(jié)果。 DNA結(jié)合染料結(jié)合所有新合成的雙鏈DNA，熒光強(qiáng)度的增加被測(cè)定，由此允許測(cè)定最初的濃度。然而，SYBR Green將標(biāo)記所有的雙鏈DNA，包括任何未預(yù)期的PCR產(chǎn)物以及引物二聚體，導(dǎo)致潛在的復(fù)雜性和假象。常規(guī)地制備反應(yīng)，加入熒光雙鏈DNA染料。進(jìn)行反應(yīng)，監(jiān)測(cè)熒光的水平(染料僅當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)才發(fā)熒光)。通過參考標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定PCR中的雙鏈DNA濃度。
熒光報(bào)告探針方法使用序列特異性的基于核酸的探針，以便僅定量探針序列而不是所有的雙鏈DNA。通常使用基于DNA的探針進(jìn)行，熒光報(bào)告分子和猝滅劑處于鄰近位置 (所謂的雙標(biāo)記探針)。報(bào)告分子與猝滅劑的緊密靠近阻止其發(fā)熒光；僅當(dāng)探針斷裂時(shí)熒光被檢測(cè)到。該過程依賴于涉及的聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性。
通過加入雙標(biāo)記探針制備實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。在雙鏈DNA模板變性之后，探針能夠結(jié)合于模板DNA的目標(biāo)區(qū)域中的它的互補(bǔ)序列。當(dāng)PCR反應(yīng)混合物被加熱以激活聚合酶時(shí)，聚合酶開始合成引發(fā)的單鏈模板DNA的互補(bǔ)鏈。隨著聚合的持續(xù)，其到達(dá)結(jié)合于其互補(bǔ)序列的探針，然后，由于聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性而使探針被水解，從而分離熒光報(bào)告分子和猝滅劑分子。這引起熒光的增強(qiáng)，該增強(qiáng)被檢出。在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的熱循環(huán)中， 熒光的增加(從每個(gè)PCR循環(huán)中水解的雙標(biāo)記的探針釋放)被監(jiān)測(cè)，這允許精確測(cè)定最終 DNA的量，并由此測(cè)定最初DNA的量。
在一些實(shí)施方式中，原位雜交的使用是理想的。原位雜交(ISH)使用核酸雜交技術(shù)并外推至單細(xì)胞水平，與細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)聯(lián)合，允許維持待維持和待鑒定的細(xì)胞標(biāo)志物的形態(tài)和鑒定，并允許定位序列至群體例如組織和血液樣品中的特定細(xì)胞。ISH是一種使用互補(bǔ)核酸的雜交，其定位組織的部分或區(qū)段中的一種或多種特異性核酸序列(原位)，或者，如果組織足夠小，則定位整個(gè)組織中的一種或多種特異性核酸序列(全標(biāo)本包埋ISH)。RNA ISH可用于測(cè)定組織中的表達(dá)樣式，例如miRNA的表達(dá)。
處理樣品細(xì)胞或組織以增加它們的通透性以允許探針，例如miRNA特異性探針進(jìn)入細(xì)胞。將探針加入至經(jīng)處理的細(xì)胞中，允許在適當(dāng)溫度雜交，將多余的探針洗掉。使用放射活性、熒光或抗原性標(biāo)簽標(biāo)記互補(bǔ)探針，從而可以使用放射自顯影、熒光顯微鏡或免疫測(cè)定法測(cè)定組織中的探針的位置和量。樣品可以是本文描述的任何樣品，例如非癌性或癌性組織樣品。由于miR-155家族成員的序列是已知的,所以可以相應(yīng)地設(shè)計(jì)miR-155探針,使得探針特異性結(jié)合miR-155。
在一些實(shí)施方式中，使用原位PCR是理想的。原位PCR是在ISH之前的基于PCR的靶核酸序列的擴(kuò)增。為了檢測(cè)RNA，引入細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄步驟以從RNA模板產(chǎn)生互補(bǔ)性DNA， 然后進(jìn)行原位PCR。這使得能夠檢測(cè)低拷貝數(shù)的RNA序列。
在原位PCR之前，將細(xì)胞或組織樣品固定并通透化以保持形狀并允許PCR試劑的可靠近細(xì)胞內(nèi)的待擴(kuò)增的序列。然后在置于懸浮液中的完整細(xì)胞內(nèi)，或直接在細(xì)胞離心制備物或載玻片上的組織切片中進(jìn)行靶序列的PCR擴(kuò)增。在前一種方法中，使用常規(guī)的熱循環(huán)儀使懸浮于PCR反應(yīng)混合物中的固定的細(xì)胞進(jìn)行熱循環(huán)。在PCR之后，將細(xì)胞離心至載玻片上，通過ISH或免疫組織化學(xué)使細(xì)胞內(nèi)的PCR產(chǎn)物可視化。載玻片上的原位PCR這樣進(jìn)行在蓋玻片下，以PCR混合物覆蓋樣品，然后將其封閉以防止反應(yīng)混合物蒸發(fā)。通過將載玻片直接置于常規(guī)加熱塊頂部或特別設(shè)計(jì)的熱循環(huán)儀上或通過使用熱循環(huán)烤箱來進(jìn)行熱循環(huán)。
細(xì)胞內(nèi)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)一般是通過兩種不同技術(shù)之一來進(jìn)行使用PCR產(chǎn)物特異性探針通過ISH的間接原位PCR，或通過直接檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸(例如地高辛-ΙΙ-dUTP、熒光素-dUTP、3H-CTP或生物素-16-dUTP)(其在熱循環(huán)中已經(jīng)被摻入PCR產(chǎn)物中)、不進(jìn)行 ISH 的直接原位PCR。
使用差別化表達(dá)的miR和miRNA作為預(yù)后的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物和用于鑒定治療劑。本文公開了 miR-155的某些表達(dá)樣式聯(lián)同狀態(tài)指示物是某些患者的生存預(yù)后的預(yù)測(cè)物。如本文使用的“差的預(yù)后”一般是指生存的減少，或換言之，死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加或存活時(shí)間的減少。 差的預(yù)后也可以指疾病的嚴(yán)重性的增加，例如癌癥向其它器官的擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)的增加。在一個(gè)實(shí)施方式中，各自的標(biāo)志物顯示出表達(dá)相對(duì)于對(duì)照至少1. 5倍增加或減少。在其它實(shí)施方式中，差的預(yù)后由相對(duì)于野生型腫瘤對(duì)照?qǐng)D的標(biāo)志物的至少2倍、至少2. 5倍、至少3 倍、至少3. 5倍或至少4倍的增加或降低來指示。
篩選候選試劑以鑒定用于治療疾病的治療劑的方法是本領(lǐng)域熟知的。檢測(cè)RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域已知的，并且在本文中公開，例如但不限于，微陣列分析， RT-PCR(包括qRT-PCR)，原位雜交，原位PCR JPNorthern印跡分析。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選包括高通量篩選。在另一實(shí)施方式中，單個(gè)地篩選候選試劑。
候選試劑可以是任何類型的分子，例如但不限于核酸分子、蛋白質(zhì)、肽、抗體、脂質(zhì)、小分子、化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、激素或可以直接或間接改變癌癥疾病狀態(tài)的任何其它類型的分子。
通常而言，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源基因，miRNA或mRNA被調(diào)節(jié)。在具體實(shí)施方式
中，核酸序列包括在核酸序列上與表I所列的一種或多種miRNA序列至少70，75，80，85，90，95或100% 同一的至少一個(gè)區(qū)段。內(nèi)源基因，miRNA或mRNA的表達(dá)或加工的調(diào)節(jié)可通過mRNA的加工的調(diào)節(jié)來進(jìn)行，此類加工包括細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)和/或翻譯。調(diào)節(jié)也可通過抑制或加強(qiáng)細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的miRNA活性來進(jìn)行。此類加工可以影響編碼的產(chǎn)物的表達(dá)或mRNA的穩(wěn)定性。在其它實(shí)施方式中，核酸序列可以包括修飾的核酸序列。在一些方面，一種或多種 miRNA序列可包括或包含修飾的核堿基或核酸序列。
應(yīng)理解在本發(fā)明的方法中，可以向細(xì)胞或其它生物材料例如生物體(包括患者) 提供miRNA或?qū)?yīng)于特定miRNA的miRNA分子，其是通過向細(xì)胞或生物體施用一旦處于細(xì)胞內(nèi)時(shí)則以對(duì)應(yīng)的miRNA發(fā)揮作用的核酸分子。向細(xì)胞提供的分子的形式可以不是一旦處于細(xì)胞內(nèi)時(shí)則以miRNA發(fā)揮作用的形式。因此，在一些實(shí)施方式中考慮到向生物材料提供合成的miRNA或非合成的miRNA，例如，在靠近細(xì)胞miRNA加工機(jī)構(gòu)后被加工成成熟和活性的miRNA的那些。在一些實(shí)施方式中，特別考慮到向生物材料提供的miRNA分子不是成熟的miRNA分子，而是在靠近miRNA加工機(jī)構(gòu)之后可以被加工為成熟miRNA的核酸分子。在 miRNA的上下文中，術(shù)語“非合成的”意思是miRNA不是合成的，如本文所定義。此外，考慮到在本發(fā)明的涉及使用合成的miRNA的實(shí)施方式中，對(duì)應(yīng)的非合成的miRNA的使用也被認(rèn)為是本發(fā)明的方面，反之亦然。應(yīng)理解術(shù)語“提供”試劑包括將試劑“施用”至患者。
在一些實(shí)施方式中，方法還包括靶向細(xì)胞或生物體中的miRNA以調(diào)節(jié)。術(shù)語“靶向 miRNA以調(diào)節(jié)”意思是利用本發(fā)明的核酸以調(diào)節(jié)所選擇的miRNA。在一些實(shí)施方式中，通過使用合成的或非合成的對(duì)應(yīng) 于被靶向的miRNA的miRNA來進(jìn)行調(diào)節(jié)，其有效地向細(xì)胞或生物體提供靶向的miRNA (正調(diào)節(jié))。在其它實(shí)施方式中，使用miRNA抑制劑來進(jìn)行調(diào)節(jié)，其有效地抑制細(xì)胞或生物體內(nèi)的靶向的miRNA(負(fù)調(diào)節(jié))。
在一些實(shí)施方式中，被靶向以調(diào)節(jié)的miRNA是影響疾病、病況或路徑的miRNA。在一些實(shí)施方式中，miRNA被靶向是因?yàn)榭赏ㄟ^負(fù)調(diào)節(jié)所述被靶向的miRNA來提供治療。在其它實(shí)施方式中，miRNA被靶向是因?yàn)榭赏ㄟ^所述被靶向的miRNA的正調(diào)節(jié)來提供治療。
在本發(fā)明的一些方法中，還有另外的步驟將所選擇的miRNA調(diào)節(jié)劑施用至需要治療(與靶向的miRNA的調(diào)節(jié)有關(guān))或需要本文討論的生理或生物結(jié)果(例如就特定的細(xì)胞路徑或結(jié)果而言，例如細(xì)胞存活性的降低)的細(xì)胞、組織、器官或生物體(合成“生物材料”)。因此，在本發(fā)明的一些方法中，有鑒定可被提供miRNA調(diào)節(jié)劑的需要治療的患者的步驟?？紤]到在一些實(shí)施方式中可使用有效量的miRNA調(diào)節(jié)劑。在具體的實(shí)施方式中，對(duì)于生物材料有被賦予的的治療上的益處，其中“治療上的益處”是指一種或多種病況或與疾病或病況相關(guān)的癥狀的改善，或疾病的預(yù)后、持續(xù)性或狀態(tài)的改善?？紤]到治療上的益處包括但不限于疼痛的減少，發(fā)病率的降低，癥狀的減少。例如，就癌癥而言，考慮到治療上的益處可以是腫瘤生長(zhǎng)的抑制、轉(zhuǎn)移的預(yù)防、轉(zhuǎn)移數(shù)目的減少、癌細(xì)胞增殖的抑制、癌細(xì)胞中癌細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)、靠近癌細(xì)胞的血管生成的抑制、癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)、疼痛的減少、 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的降低、癌細(xì)胞中化學(xué)或放射敏感性的誘導(dǎo)、生命的延長(zhǎng)、和/或與癌癥直接或間接相關(guān)的死亡的延遲。
此外，考慮到可以作為治療法的一部分向患者提供miRNA組合物，與傳統(tǒng)的治療法或預(yù)防劑聯(lián)合。此外，考慮到治療法上下文中討論的任何方法可以預(yù)防性地應(yīng)用，特別是在被鑒定為潛在地需要治療法或處于需要該治療法的病況或疾病的風(fēng)險(xiǎn)的患者中。
另外，本發(fā)明的方法涉及使用對(duì)應(yīng)于miRNA的一種或多種核酸和治療藥物。所述核酸可增強(qiáng)所述藥物的效用或功效，減少任何副作用或毒性，改變其生物可獲得性，和/或減少所需的劑量或頻率。在一些實(shí)施方式中，治療藥物是癌癥治療劑。因此，在一些實(shí)施方式中，提供了治療患者中的癌癥的方法，包括向該患者施用癌癥治療劑和有效量的至少一種改善該癌癥治療劑的功效或保護(hù)非癌細(xì)胞的miRNA分子。癌癥治療法還包括與基于化學(xué)和放射的多種組合治療法。組合化療包括但不限于，例如，貝伐珠單抗、順鉬(CDDP)、卡鉬、 EGFR抑制劑(吉非替尼和西妥昔單抗)、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、C0X-2抑制劑 (例如塞來考昔)異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、硝基脲、更生霉素、柔紅霉素、 多柔比星(亞德里亞霉素)、博來霉素、光輝霉素、絲裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合劑、泰素、泰索帝、吉西他濱、諾維本、法呢基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、 反鉬、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和甲氨蝶呤，或前述項(xiàng)的任何類似物或衍生物變體。
—般地,可以給予miRNA的抑制劑以實(shí)現(xiàn)與給予對(duì)應(yīng)于成熟miRNA的核酸分子時(shí)相反的效應(yīng)。類似地，可以給予對(duì)應(yīng)于成熟miRNA的核酸分子以實(shí)現(xiàn)與給予miRNA的抑制劑時(shí)相反的效應(yīng)。例如，可以向細(xì)胞提供增加細(xì)胞增殖的miRNA分子以增加增殖，或者，可以向細(xì)胞提供此類分子的抑制劑以減少細(xì)胞增殖。在使用本文公開的不同miRNA分子和 miRNA抑制劑觀察到的不同生理效應(yīng)的情境中，本發(fā)明涉及這些實(shí)施方式。這些包括但不限于下列生理效應(yīng)增加和減少細(xì)胞增殖，增加或減少細(xì)胞凋亡，增加轉(zhuǎn)化，增加或減少細(xì)胞存活性，減少或增加活細(xì)胞的數(shù)目，和增加或減少處于細(xì)胞周期的特定階段的細(xì)胞的數(shù)目。 本發(fā)明的方法一般被考慮到包括提供或?qū)雽?duì)應(yīng)于一種或多種不同的miRNA分子的一種或多種不同的核酸分子?？紤]到可以提供或?qū)胂铝袛?shù)目，至少下列數(shù)目，或至多下列數(shù)目的不同的核酸分子=1,2, 3,4, 5,6, 7,8,9, 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23， 24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47, 48，49 ，50，51，52，53，5 4，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，7 5，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100 ，或其中任意范圍。這也適用于可以向細(xì)胞提供或?qū)氲牟煌膍iRNA分子的數(shù)目。
miRNA-155
由于MMR功能失調(diào)而造成的突變子表型誘導(dǎo)另外的促進(jìn)癌癥進(jìn)展的基因突變的獲得。除了種系突變以外，還有多種導(dǎo)致核心MMR蛋白的減少或缺失的表達(dá)的病理性事件， 包括啟動(dòng)子甲基化和減少的組蛋白乙酰化，以及微環(huán)境因素例如炎癥和低氧。本發(fā)明的結(jié)果提供了下列發(fā)現(xiàn):miR-155在這種多因素調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，其是通過引起核心MMR異二聚體蛋白MSH2-MSH6和MLH1-PMS2的下調(diào)。miR-155對(duì)于這些基本MMR成分的同時(shí)抑制導(dǎo)致突變子表型。
不希望被任何特定理論所限制，miR-155對(duì)于整個(gè)MMR系統(tǒng)所顯示出的非凡的效應(yīng)可能是兩個(gè)不同現(xiàn)象的結(jié)果。第一，MMR蛋白穩(wěn)定性與它們形成異二聚體的能力相關(guān); 因此，hMSH2和hMLHl蛋白的喪失導(dǎo)致它們各自的異二聚體復(fù)合物蛋白的去穩(wěn)定化。第二， miR-155似乎靶向核心MMR蛋白的下調(diào)。綜合起來，這些調(diào)節(jié)性和穩(wěn)定性改變導(dǎo)致突變率的顯著增大。本發(fā)明人不能排除下列可能性miR-155影響其它相關(guān)的DNA修復(fù)蛋白，通過不相關(guān)的基因組過程增強(qiáng)MMR缺陷的表型效應(yīng)。
miR-155造成的MMR蛋白的不完整抑制不是癌癥中的腫瘤抑制基因所特有的。已經(jīng)表明結(jié)腸腺瘤性息肉(APC)基因的一個(gè)等位基因的表達(dá)的部分(50%)減少與結(jié)腸直腸癌的產(chǎn)生相關(guān)。此外，已經(jīng)表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體I (TGFBRl)基因的單一等位基因的減少的表達(dá)與CRC相關(guān)。最近提出微小RNA作為涉及等位基因和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的反式作用元件。 本發(fā)明人的結(jié)果強(qiáng)烈支持miRNA在MMR基因的非孟德爾調(diào)節(jié)中的作用。
組織特異性和靶序列中的可能的多態(tài)性使得miRNA的調(diào)節(jié)的復(fù)雜性增加。例如， 已經(jīng)表明hMLHl的3’UTR中的獲得的突變與患有急性骨髓性白血病的患者中的疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。本發(fā)明人不能排除下列可能性miR-155的過表達(dá)與MMR靶基因的3’ UTR中的獲得的突變二者聯(lián)合起來進(jìn)一步貢獻(xiàn)于這些所選擇的患者中的MSI的發(fā)展。此外，在MSI腫瘤的特定子集例如與炎性腸病相關(guān)的CRC和與HIV感染相關(guān)的非霍奇金淋巴瘤中，MMR基因的良好確定的突變和/或表觀遺傳學(xué)失活較不常見。本發(fā)明人的研究顯示了核心MMR基因的下調(diào)，這提示了這些癌癥的潛在的替代性病理發(fā)生機(jī)制可能是miR-155的過表達(dá)。
雖然本發(fā)明人觀察到miR-155與CRC中MMR蛋白的表達(dá)之間的相反關(guān)系，但是，并不是所有的具有增加的miR-155表達(dá)的腫瘤都具有MSI的特征。在人類細(xì)胞中，有多種因素可能解釋miR-155對(duì)于核心MMR蛋白的不同調(diào)節(jié)，包括涉及miRNA和基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控的閾值表達(dá)效應(yīng)或原始環(huán)(savage loop)。
具有MMR缺陷性腫瘤的患者很大程度上具有良好預(yù)后的特征，但是與具有MMR活性的腫瘤的患者相比，在5-氟尿嘧啶輔助化療之后具有較低的生存優(yōu)勢(shì)。miR-155在下調(diào)核心MMR蛋白中的貢獻(xiàn)提示miR-155可能是癌癥患者的預(yù)后和治療中的重要的分層因素。 miR-155的表達(dá)可以是MSI腫瘤的病因?qū)W的另外分析測(cè)試，其中標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試不提供結(jié)論性的診斷。
在本公開內(nèi)容的通篇，通過辨別引用的方式引用了多篇公開物、專利和公開的專利說明書。這些公開物、專利和公開的專利說明書的公開內(nèi)容在此通過引用方式并入本公開內(nèi)容，以更加完整地描述本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)狀。
本發(fā)明通過下列實(shí)施方式進(jìn)一步確定，其中所有的分?jǐn)?shù)和百分率是按重量，溫度是攝氏度，除非另有指明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例指明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是僅是通過舉例來給出。從以上討論和這些實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基本特征， 不脫離本發(fā)明的精神和范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行本發(fā)明的多種改變和修飾，以使其適用于多種用途和條件。實(shí)施例
實(shí)施例1
所用的材料和方法
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
Colo_320DM、HCT-116和DLD-1結(jié)腸直腸癌(CRC)細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 ATCC Manassas, VA)培養(yǎng)于 RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA)中，MV4-11B 骨髓單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(ATCC Manassas, VA)和裝配細(xì)胞 293TN(System Biosciences, Mountain View, CA)生長(zhǎng)于DMEM(Gibco, Carlsbad, CA)。所有的細(xì)胞均補(bǔ)充10%胎牛血清(Sigma, St.Louis, MO)和抗生素。定期檢查并在功能性實(shí)驗(yàn)之前檢查細(xì)胞的支原體污染情況，總是為陰性。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)在6孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)于過表達(dá)研究，從Ambion (Austin，TX)購買特異性miRNA或?qū)φ涨绑w寡核苷酸，以IOOnM使用。對(duì)于沉默實(shí)驗(yàn)，使用IOOnM的miRCURY LNA 抗-miR-155或?qū)φ誱iRCURY 敲低探針(Exiqon, Vedbaek, Denmark)。在48小時(shí)后,通過如下文描述的定量實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證 miRNA的表達(dá)。編碼全長(zhǎng)MLHl和MSH6cDNA的質(zhì)粒購自O(shè)rigene。使用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene, San Diego, CA)制備針對(duì)miR-155種子區(qū)的MLHl和MSH6突變體。 將0. 3x IO6個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，在24小時(shí)后使用Iug編碼WT或突變體cDNA的編碼質(zhì)粒和lugmiR-155編碼載體或空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，36小時(shí)后收獲細(xì)胞并裂解，通過Western印跡分析。
螢光素酶測(cè)定
將hMLHl、hMSH2和hMSH6的3’ -UTR和/或CDS中的預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)克隆于螢火蟲螢光素酶基因的下游，如下所述。使用特異性引物(下表2)通過PCR擴(kuò)增來自 SW-480細(xì)胞的互補(bǔ)性DNA(cDNA)。
然后使用SpeI 和 SacII (New England Biolabs Ipswich, MA)消化產(chǎn)物并插入 pGL3對(duì)照載體(Promega, Madison, WI),所述載體之前經(jīng)過修飾以使其在螢火蟲螢光素酶基因的終止密碼子的緊臨下游攜帶SpeI和SacII位點(diǎn)。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)基因構(gòu)建了具有突變的miRNA識(shí)別序列的報(bào)告子構(gòu)建體(MUT-155)。對(duì)于hMSH23’ UTR和hMLH13’ UTR結(jié)合位點(diǎn)，使用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖袆h除互補(bǔ)于miR-155的種子的序列。對(duì)于所有其它的miR-155種子區(qū)，使用定位于預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的上游或下游的引物獲得突變體構(gòu)建體，以排除種子區(qū)互補(bǔ)性位點(diǎn)。引物序列見表2。
在12孔板中使用I μ gpGL3螢火蟲螢光素酶報(bào)告子對(duì)照載體、O.1 μ g phRL_SV40 對(duì)照載體(Pro mega, Madison, WI)和IOOnM miRNA或?qū)φ涨绑w共轉(zhuǎn)染Colo_320DM細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)使用Dual Luciferase Assay (Promega)連續(xù)測(cè)定螢火蟲和海腎螢光素酶活性。
Western 印跡
對(duì)于免疫印跡分析，使用冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液加蛋白酶抑制劑(Cell Signaling Technology Inc. Danvers, MA)裂解細(xì)胞。溶解等量的蛋白并與 4X SDS-PAGE 樣品緩沖液混合，在4% - 20%和 7. 5%線性梯度Tris-HCL Criterion Precast Gels (Bio-Rad) 中跑電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或PVDF膜(Bio-Rad)。使用Tris緩沖的鹽水(pH 7. 4，含有 0. 05%Tween 20)中的5%的脫脂牛奶封閉該膜，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用一抗和二抗溫育。 使用下列一抗小鼠單克隆抗-MSH2 (1:200，Invitrogen)，小鼠單克隆抗-MSH6 (1:500，BD Biosciences San Jose, CA),小鼠單克隆抗-MLHl (1:200，Invitrogen),兔子多克隆抗-MLHl(1:200,用于小鼠實(shí)驗(yàn) SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),小鼠單克隆抗-肌動(dòng)蛋白(1: 5000, Sigma)，小鼠單克隆抗-GAPDH (1:1000, SantaCruz Biotechnology)。針對(duì) MLHl 和 MSH6 的 N 末端一抗(l/500Sigma)。
用于成熟miRNA和基因的實(shí)時(shí)PCR
使用Trizol (Invitrogen)分離總 RNA。通過單管 TaqMan MicroRNA Assay 測(cè)定成熟miRNA,通過Gene Expression Assay,使用下列探針測(cè)定目標(biāo)mRNA的表達(dá)hMLHl=Hs00979923ml, hMSH2=Hs00953523_ml, hMSH6=Hs00943001_ml (Applied Biosystems, Foster City, CA)。將miRNA的表達(dá)針對(duì)人中的RNU44和RNU48以及針對(duì)小鼠細(xì)胞中的 snoR-135進(jìn)行歸一化?；虮磉_(dá)針對(duì)紐蛋白(vinculin)進(jìn)行歸一化。在GeneAmp PCR 9700Thermocycler(Applied Biosystems)中進(jìn)行所有的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng),包括無模板對(duì)照和RT負(fù)對(duì)照。除非另有指明，否則每個(gè)樣品按照一式三份進(jìn)行測(cè)定。
Northern 印跡
對(duì)于成熟miRNA的檢測(cè),按照之前的描述進(jìn)行丙烯酰胺Northern印跡。
過表達(dá)miR-155的穩(wěn)定克隆的產(chǎn)生
使用含有在兩個(gè)不同啟動(dòng)子(System Biosciences, Mountain View, CA)控制下的全長(zhǎng)miR-155和GFP基因的pCDH-CMV-MCS-EFl-miRNA表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定感染Colo_320DM 細(xì)胞?？蛰d體用作對(duì)照。使用 pPACKHlLentivector Packaging Plasmid Mix (System Biosciences)在293-TN裝配細(xì)胞系中裝配pre-miR-155表達(dá)和對(duì)照構(gòu)建體。使用 PEG-1t Virus Precipitation Solution 濃縮病毒,使用 UltraRapid Lentiviral Titer Kit (System Biosciences)分析效價(jià)。通過 FACS 分析(FACSC alibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems)選擇感染的細(xì)胞。通過突光顯微鏡確認(rèn)感染效率大于90%,并進(jìn)一步通過針對(duì)miR-155表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
組織學(xué)測(cè)定
根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)確定腫瘤類型(腺癌和粘蛋白腺癌)和分化的級(jí)別。具有主要為固體生長(zhǎng)模式和輕度或中度核多形性的癌被分類為髓樣腺癌3。
免疫組化分析
根據(jù)之前描述的分析程序進(jìn)行MLHl和PMS2表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。顯示完全喪失細(xì)胞核MLHl或MSH2表達(dá)的腫瘤被分類為MLHl陰性或MSH2陰性。正常上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核免疫染色作為每個(gè)病例中的內(nèi)部陽性對(duì)照。所有的腫瘤由兩位病理學(xué)家獨(dú)立測(cè)評(píng)，他們不知曉臨床數(shù)據(jù)和MSI狀態(tài)。
組織收集
經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)之后，從Istituto Scientifico Romagnolo per Io Studio e la Cura dei Tumori, Meldola, Italy的83例連續(xù)CRC病例收集腫瘤和正常鄰近組織的新鮮冷凍組織。根據(jù)上文描述提取細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白和RNA提取。
激光捕獲顯微解剖(LCM)
在 OSU Laser Capture Microdissection and Image Analysis Core Facility 進(jìn)行LCM。
MLHl 和 PMS2 測(cè)序
擴(kuò)增并測(cè)序來自CRC 患者的 DNA。使用 3730DNA Analyzer 和 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (3.1版本)進(jìn)行測(cè)序分析。使用數(shù)據(jù)收集軟件ν3· O和測(cè)序分析軟件v5. 2。經(jīng)過機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)之后收集患者信息和組織。
實(shí)施例2
轉(zhuǎn)染
通過使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)轉(zhuǎn)染 Colo_320DM、 HCT-116 和 DLDl 細(xì)胞,根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，由 System Biosciences (Mountain View, CA)產(chǎn)生用于miR-155過表達(dá)的MV4-11慢病毒載體和空載體。使用診斷引物通過基因分型分析測(cè)定微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。測(cè)序來自MSI患者的基因組DNA。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表達(dá)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(S. E. M),除非另有指明。使用雙尾Student’ s t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。當(dāng)p 小于 O. 05 時(shí)認(rèn)為有顯著性。使用 Graphpad Prism v5. O (Graphpad Software Inc.)分析用于Pearson校正。
實(shí)施例3
hMLHl、hMSH2 和 hMSH6 是 miR-155 的靶標(biāo)
本發(fā)明人使用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)模型來鑒定核心MMR基因的mRNA中的miR-155的潛在結(jié)合位點(diǎn)。使用 RNAhybrid(BiBiServ, Germany;NCBI NM_000249. 2)發(fā)現(xiàn) hMLHl 中的 2 個(gè)推測(cè)的位點(diǎn)1個(gè)在3’ -UTR中，另一個(gè)在(NCBI NM_000249. 2)的編碼序列(CDS)中；使用 TargetScan (Whitehead Institute, MIT; NCBI NM_000251.1)發(fā)現(xiàn) hMSH2 的 3，-UTR 中的 I 個(gè)位點(diǎn)；使用 RNAhybrid(BiBiServ, Germany;NCBI NM_000179. 2)發(fā)現(xiàn) hMSH6 的 CDS 中的 I 個(gè)位點(diǎn)(圖1A ;圖6)。
作為功能篩選，本發(fā)明人將編碼區(qū)和3’ -區(qū)(包括預(yù)測(cè)的MLHl、MSH2或MSH6的 miR-155種子區(qū))亞克隆至螢光素酶基因的下游并記錄了螢光素酶蛋白活性。本發(fā)明人使用MMR活性的Colo-320DM CRC細(xì)胞用于這些研究，因?yàn)樗鼈兒械偷幕A(chǔ)miR-155水平。 使用螢光素酶報(bào)告子構(gòu)建體和使用miR-155前體(pre-miR-155)或?qū)φ涨绑w(pre-miR對(duì)照)轉(zhuǎn)染Colo-320DM細(xì)胞。
本發(fā)明人觀察到在存在pre-miRNA-155的情況下，以含有MLH1、MSH2或MSH6的 miR-155種子區(qū)的構(gòu)建體分別觀察到37%、38%和24%的螢光素酶活性降低(p〈0. 001 ;圖1Bb ;見每一個(gè)的WT)。當(dāng)構(gòu)建體含有miR-155種子區(qū)的刪除時(shí)，未觀察到螢光素酶活性的變化(圖1B ;對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體，見MUT-155)。有趣的是，hMLHl基因中的單個(gè)miR-155結(jié)合位點(diǎn)的效應(yīng)顯示是加和性的(圖1B ;將11]\0^謹(jǐn)^'1553’-^1 和願(yuàn)1'-1550^與11'進(jìn)行比較)。
核糖體從CDS靶位點(diǎn)置換miRNA-RISC復(fù)合物
該過程導(dǎo)致微小RNA調(diào)節(jié)靶蛋白的失能。MLHl和MSH6都包含⑶S種子區(qū)(圖1 ; 圖6)。
為了測(cè)定miRNA-155-RISC置換的可能性，本發(fā)明人使用含有相應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA (含有或不含miR-155前體)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染缺乏MLHl的細(xì)胞系(HCT116)或缺乏 MSH6的細(xì)胞系(DLDl)，并檢測(cè)蛋白表達(dá)(圖7)。
本發(fā)明人刪除了 hMLHl和hMSH6cDNA中的⑶S miR-155靶位點(diǎn)，以測(cè)定表達(dá)是否受到miRNA-RISC核糖體置換的影響。⑶SmiR-155種子區(qū)的框內(nèi)刪除導(dǎo)致產(chǎn)生截短的hMLHl 和hMSH6蛋白(圖7 ；160kD hMSH6的大小上的減小僅可在較長(zhǎng)的凝膠運(yùn)行中被檢出)。以 miR-155表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染MMR cDNA導(dǎo)致hMLHl和hMSH6蛋白的下調(diào)(圖7 ;見hMLHlWT 和hMSH6WT)。從cDNA刪除CDSmiR-155種子序列引起hMLHl的表達(dá)部分恢復(fù)(圖7 ;見 hMLHlMUTCDS)和 hMSH6 的表達(dá)完全恢復(fù)(圖 7 ;見 hMSH6MUT)。hMLHlCDS 和 3，-UTR 種子序列的突變引起hMLHl蛋白表達(dá)完全恢復(fù)(圖7 ;見hMLHl雙突變體)。這些結(jié)果定性地類似于含有來自hMLHl和hMSH6的miR-155種子序列的基于螢光素酶的系統(tǒng)(圖1B)，并且顯示miRNA-RISC核糖體置換在miR-155對(duì)于MMR蛋白的調(diào)節(jié)中不可能是個(gè)問題。
在colo_320DM細(xì)胞中測(cè)定了 miR-155對(duì)于內(nèi)源MMR基因和蛋白表達(dá)的影響(圖2)。通過定量PCR(qPCR)，對(duì)于轉(zhuǎn)染的Colo-320DM細(xì)胞測(cè)定出與亂序pre-miR對(duì)照相比的 pre-miR-155的一致性增加(圖2A)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)hMLHl、hMSH2和hMSH6的mRNA表達(dá)不受pre-miR-155過表達(dá)的影響(圖2B，比較白色和藍(lán)色條柱)。相反，在以pre-miR-155轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，hMLHl、hMSH2 和 hMSH6 蛋白分別減少 53 ±14% (p=0. 02)、37±10%(p=0. 01)和 32 ±7. 4%(p=0. 004)(圖 2C ; 左側(cè)圖板，比較右側(cè)圖板中的白色和藍(lán)色條柱)。
為了確保本發(fā)明人能夠檢測(cè)mRNA表達(dá)的變化，本發(fā)明人在Colo-320DM細(xì)胞中進(jìn)行了 siRNA敲低研究(圖2B和2C)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 mRNA表達(dá)的siRNA MMR基因特異性降低，如所預(yù)期的那樣(圖2B ;左側(cè)陰影、淺藍(lán)色，右側(cè)陰影條柱)。mRNA的減少翻譯為對(duì)應(yīng)的MMR蛋白的減少(圖2C;左側(cè)陰影，淺藍(lán)色，右側(cè)陰影條柱)。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)hMSH6 蛋白的穩(wěn)定性與hMSH2蛋白的表達(dá)相關(guān)。這些結(jié)果表明miR-155是通過翻譯后抑制而發(fā)揮其對(duì)于MMR蛋白的最大影響。
為了確認(rèn)miR-155對(duì)于MMR蛋白的調(diào)節(jié)，本發(fā)明人檢測(cè)了過表達(dá)miR-155的 MV4-11細(xì)胞(圖8)。在這些研究中，使用序列特異性鎖核酸(LNA)修飾的寡核苷酸(其靶向miR-155敲低)(抗-miR-155 ；Ambion)以及對(duì)照LNA抗-miRNA轉(zhuǎn)染MV4-11細(xì)胞。通過qPCR觀察到，當(dāng)以LNA抗-miR-155寡核苷酸轉(zhuǎn)染時(shí)，相對(duì)于非特異性LNA抗-miR對(duì)照， miR-155降低至1/6. 7(圖1A),通過Northern印跡分析確認(rèn)(圖6B)。
本發(fā)明人通過Western分析還觀察到在以LNA抗-miR-155轉(zhuǎn)染的MV4-11細(xì)胞中，相對(duì)于LNA抗-miR對(duì)照轉(zhuǎn)染，hMLHl、hMSH2和hMSH6蛋白的增加(圖8)。與colo_320DM miR-155過表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)合起來，這些結(jié)果說明細(xì)胞miRNA-155水平對(duì)于核心MMR蛋白的表達(dá)具有直接影響。
實(shí)施例4
miR-155的過表汰誘導(dǎo)突變子表型
為了測(cè)定miRA-155對(duì)于MMR調(diào)節(jié)的生物作用，本發(fā)明人使用了慢病毒載體系統(tǒng)產(chǎn)生了過表達(dá)miR-155的Colo-320DM CRC細(xì)胞的穩(wěn)定克隆(圖3)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相對(duì)于表達(dá)空載體的細(xì)胞(Colo-空；圖3B)，在過表達(dá)miR-155的Colo_155DM細(xì)胞中(Colo-155), MLHl、MSH2和MSH6蛋白表達(dá)分別降低72%、42%和69%。本發(fā)明人還觀察到MSH6mRNA的減少(圖3C)。由于不可能對(duì)于轉(zhuǎn)錄有直接效應(yīng)，所以這些結(jié)果顯示miR-155可能靶向影響從MSH6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的其它調(diào)節(jié)因子。
簡(jiǎn)單重復(fù)序列的長(zhǎng)度變化(微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或MSI)是MMR缺陷的診斷指征。本發(fā)明人檢測(cè)了過表達(dá)miR-155的Colo-320DM細(xì)胞中的MSI (圖3D)。檢測(cè)了所有三個(gè)診斷 (圖3D)。這些結(jié)果顯示miR-155過表達(dá)誘導(dǎo)復(fù)制差錯(cuò)，這與減少的或缺失的核心MMR功能是一致的。
實(shí)施例5
miR-155表汰與CRC組織中的hMLHl和hMSH2反相關(guān)
本發(fā)明人檢測(cè)了含有70例非選擇的CRC和5例良性腸損傷的組織微陣列中的 miR-155、MLHl和MSH2的表達(dá)。使用了共標(biāo)記方法，其中將LNA抗-miR-155或非特異性 LNA抗-miR對(duì)照與針對(duì)hMLHl或hMSH2的免疫組織化學(xué)(IHC)抗體組合。當(dāng)分別在>15% 或>5%的細(xì)胞中檢出時(shí)，miR-155和MMR蛋白表達(dá)被評(píng)為陽性(圖9A和圖9B)。
超過50%的CRC顯示出miR-155的升高的表達(dá)(圖9C)。分別在28%和22%的CRC 中觀察到hMSH2和hMLHl表達(dá)的降低(圖9C)。miR-155與MSH2或MLHl的共表達(dá)顯示出反相關(guān)，對(duì)于 MSH2，r 值是-O. 74(p〈0. 001);對(duì)于 MLHl，r 值是-O. 6 (ρ〈0· 001)。在 67% 的 CRC組織中，miR-155不與hMSH2共表達(dá)；在50%的CRC組織中，miR-155不與hMLHl共表達(dá)。當(dāng)僅使用miR-155陽性CRC組織進(jìn)行分析時(shí)，對(duì)于hMLHl (p=0. 0003)和hMSH2 (p=0. 001) 仍然可見顯著的反相關(guān)。在具有大于50%的miR-155表達(dá)的組織的亞組中，仍然具有反相關(guān)，對(duì)于 MSH2，r 值是-O. 7(ρ〈0· 0002);對(duì)于 MLH1，r 值是-O. 55 (ρ〈0· 005)。有趣的是，在 miRNA-155和“hMSH2或hMLHl之一”陽性的CRC組織中，在同一癌巢中從未觀察到共表達(dá) (圖 9A)。
本發(fā)明人檢測(cè)了 83例新鮮冷凍腫瘤隊(duì)列(可獲得其癌癥和正常鄰近組織)中的 miR-155和MMR蛋白的表達(dá)(圖9B)。本發(fā)明人通過qPCR分析檢測(cè)了腫瘤和相關(guān)的正常組織，并且發(fā)現(xiàn)在18例樣品中(22%)，miR-155的表達(dá)升高2倍以上。通過Western印跡測(cè)定了這18例樣品的腫瘤和相關(guān)正常組織中的hMLHl和MSH2蛋白的表達(dá)。在12例樣品中 (67%)觀察到hMLHl表達(dá)的明顯下降，而在11例樣品中(61%)觀察到hMSH2表達(dá)的明顯下降(圖9B)。
當(dāng)miR-155的表達(dá)水平相對(duì)于相關(guān)的正常組織為小于3倍的增加時(shí)，似乎發(fā)生對(duì)于MMR表達(dá)的不確定的影響的閾值(圖9B ;紅色的線)。一般地，miR-155表達(dá)高于該閾值時(shí)，顯示出下調(diào)hMLHl和hMSH2的表達(dá)。與組織陣列研究綜合起來，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明 miR-155在人類腫瘤中的過表達(dá)導(dǎo)致核心MMR蛋白hMLHl和hMSH2的下調(diào)。
實(shí)施例6
miR-155表汰是MSI腫瘤中麗R失調(diào)的誘因
在核心MMR基因之一的兩個(gè)等位基因都失活之后，獲得MSI。在LS/HNPCC攜帶者中，大多數(shù)突變被發(fā)現(xiàn)于hMSH2和hMLHl基因中。導(dǎo)致LS/HNPCC患者中的MSI腫瘤的“第二命中”很大程度上是喪失異質(zhì)性(LOH)或未受影響的等位基因的體細(xì)胞突變的結(jié)果。在 CRC中，LS/ HNPCC導(dǎo)致2-5%的MSI腫瘤。大約10-15%的散發(fā)性CRC腫瘤顯示出很大程度上(90%)由于hMLHl啟動(dòng)子的雙等位基因失活而造成的MSI。在1066例CRC患者的非選擇系列中，有135例(12.7%)被發(fā)現(xiàn)顯示MSI。在這些之中，23例(5.9%)被確定具有核心 MMR基因之一的種系突變，有106例(78. 5%)被發(fā)現(xiàn)具有hMLHl啟動(dòng)子的甲基化。大約5% 的這些MSI腫瘤顯示出至少一個(gè)核心MMR蛋白的表達(dá)喪失，無明顯的遺傳或表觀遺傳誘因。
本發(fā)明人回顧性地檢測(cè)了 40例顯示出MSI和至少hMLHl和hPMS2的IHC表達(dá)喪失的CRC腫瘤。發(fā)現(xiàn)其中34例CRC腫瘤具有hMLHl基因序列中的突變或hMLHl啟動(dòng)子的甲基化。在激光捕獲顯微解剖腫瘤和鄰近的正常組織之后，本發(fā)明人通過qPCR檢測(cè)了 6例樣本，其保留了足夠用于miR-155表達(dá)分析的樣品(表I)。
由于一份樣本含有極少的組織，所以本發(fā)明人在原位和IHC分析中檢測(cè)了 miR-155和hMLHl的表達(dá)(圖5)。所有6例剩余的MSI腫瘤顯示出至少2倍的miR-155表達(dá)增加(相對(duì)于鄰近的正常組織)(表I)。
miR-155在這些樣品中的過表達(dá)不與腫瘤級(jí)別或階段相關(guān)。3例樣品具有超過所述3倍閾值的miR-155的增加，其一般性地導(dǎo)致減少的hMLHl和/或hMSH2表達(dá)。另外，CR78 顯示出在大于50%的腫瘤組織中的miR-155的升高的表達(dá)和對(duì)應(yīng)的hMLHl的表達(dá)喪失(圖5A和5B)。這些結(jié)果與下列結(jié)論一致具有未知的MMR缺陷的MSI腫瘤可能源于miR-155 的過表達(dá)。
權(quán)利要求
1.包含至少一種反義miRNA和至少一種另外的成分的物質(zhì)組合物，其中所述反義 miRNA對(duì)于能夠下調(diào)至少一種核心MMR蛋白的miRNA是反義的,并且其中所述至少一種另外的成分對(duì)于治療MMR相關(guān)的疾病是有用的。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述至少一種另外的成分選自化療藥物；干細(xì)胞; AG1478 ;吉非替尼；埃羅替尼；西妥昔單抗；帕木單抗；zalutumamab ;尼妥珠單抗；馬妥珠單抗；和拉帕替尼。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述反義miRNA是miRNA-155。
4.權(quán)利要求4的組合物，其中所述至少一種核心MMR蛋白選自hMSHl;hMSH6和hMLHl。
5.鑒定測(cè)試樣品中的MMR功能失調(diào)細(xì)胞的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平相比較，其中差別表達(dá)的miRNA-155水平鑒定所述測(cè)試樣品為含有MMR功能失調(diào)細(xì)胞。
6.診斷受試者是否具有MMR突變體細(xì)胞或處于產(chǎn)生MMR突變體細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)的方法， 包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平相比較，其中差別表達(dá)的 miRNA-155水平診斷該受試者具有MMR突變體細(xì)胞或處于產(chǎn)生MMR突變體細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。
7.診斷受試者是否患有Lynch綜合征或處于患Lynch綜合征的風(fēng)險(xiǎn)的方法,包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平相比較，其中差別表達(dá)的miRNA-155 水平診斷該受試者患有Lynch綜合征或處于患Lynch綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。
8.診斷受試者是否患有遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌或處于患遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平相比較， 其中差別表達(dá)的miRNA-155水平診斷該受試者患有遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌或處于患遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
9.診斷受試者是否患有癌癥或處于患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括將測(cè)試樣品中的 miRNA-155水平與對(duì)照的miRNA-155水平相比較，其中差別表達(dá)的miRNA-155水平診斷該受試者患有癌癥或處于患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，其中所述癌癥選自結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜癌；卵巢癌； 胃癌；和泌尿道上皮癌。
10.提供患者的預(yù)后的方法，包括將測(cè)試樣品中的miRNA-155水平與對(duì)照的 miRNA-155水平相比較，其中下調(diào)的miRNA-155水平指示差的預(yù)后。
11.治療有此治療需要的患者中的MMR功能失調(diào)的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求I的組合物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中MMR功能失調(diào)選自成神經(jīng)細(xì)胞瘤；肺癌；膽管癌；非小細(xì)胞肺癌；肝細(xì)胞癌；淋巴瘤；鼻咽癌；卵巢癌；頭頸鱗狀細(xì)胞癌；鱗狀細(xì)胞子宮頸癌；胃癌；結(jié)腸癌；子宮頸癌；膽囊癌；前列腺癌；乳腺癌；睪丸生殖細(xì)胞腫瘤；大細(xì)胞淋巴瘤；濾泡性淋巴瘤；結(jié)腸直腸癌；惡性胸膜間皮瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；甲狀腺癌；基底細(xì)胞癌；T細(xì)胞淋巴瘤；t (8; 17)-幼淋巴細(xì)胞白血??；骨髓增生異常綜合征；胰腺癌；t(5;14) (q35.1;q32. 2) 白血??；惡性纖維組織細(xì)胞瘤；胃腸間質(zhì)腫瘤；和肝母細(xì)胞瘤。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所治療的癌癥選自結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜癌；卵巢癌 ’胃癌；和泌尿道上皮癌。
14.治療有此治療需要的MMR功能失調(diào)患者中的癌癥的方法，包括施用藥學(xué)有效量的反義miRNA，其中所述反義miRNA是對(duì)于miRNA-155反義的。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所治療的癌癥選自結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜癌；卵巢癌；胃癌；和泌尿道上皮癌。
16.權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括施用佐劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其進(jìn)一步包括施用選自下列的化合物化療藥物；干細(xì)胞； AG1478 ;吉非替尼；埃羅替尼；西妥昔單抗；帕木單抗；zalutumamab ;尼妥珠單抗；馬妥珠單抗；和拉帕替尼。
18.誘導(dǎo)MMR功能失調(diào)細(xì)胞的凋亡的方法，包括導(dǎo)入凋亡有效量的權(quán)利要求1的組合物。
19.誘導(dǎo)MMR功能失調(diào)細(xì)胞的凋亡的方法，包括導(dǎo)入凋亡有效量的反義miRNA，其中所述反義miRNA是對(duì)于miR-155反義的。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述細(xì)胞由于至少一種下調(diào)的核心MMR蛋白而功能失調(diào)， 所述蛋白選自hMSH2 ；hMSH6 ;和hMLHl。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述細(xì)胞由于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性而功能失調(diào)。
22.權(quán)利要求20的方法，其進(jìn)一步包括導(dǎo)入選自下列的化合物化療藥物；干細(xì)胞； AG1478 ;吉非替尼；埃羅替尼；西妥昔單抗；帕木單抗；zalutumamab ;尼妥珠單抗；馬妥珠單抗；和拉帕替尼。
23.鑒定藥學(xué)上有用的組合物的方法，包括將反義miRNA-155導(dǎo)入MMR功能失調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)物中；將測(cè)試組合物導(dǎo)入MMR功能失調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)物中；和鑒定誘導(dǎo)凋亡的測(cè)試組合物為藥學(xué)上有用的組合物。
24.預(yù)測(cè)被診斷患有MMR功能失調(diào)疾病的患者的臨床結(jié)果的方法，包括檢測(cè)獲自所述患者的MMR功能失調(diào)疾病細(xì)胞樣品中的miR-155的表達(dá)水平，其中相對(duì)于對(duì)照，miR-155水平的1. 5倍或更高的增加聯(lián)同MMR功能失調(diào)狀態(tài)預(yù)測(cè)存活的減少。
25.鑒定用于治療MMR功能失調(diào)疾病的治療劑的方法，包括在體外篩選候選試劑以選擇降低miR-155表達(dá)的試劑，從而鑒定用于治療MMR功能失調(diào)疾病的試劑。
26.用于鑒定MMR功能失調(diào)疾病中的差別表達(dá)的miR-155的試劑盒，其包含miR-155的至少一種分子鑒別物。
27.用于鑒定肺癌中的差別表達(dá)的miR-155的試劑盒，其包含miR-155的至少一種分子鑒別物，其中所述分子鑒別物選自探針；引物；抗體或小分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了涉及miR-155對(duì)于錯(cuò)配和基因組穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)的材料和方法。
文檔編號(hào)C07H21/02GK103025384SQ201180022637
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者C·M·克羅斯, N·瓦萊莉 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)