專利名稱：用于使hiv失活并阻斷hiv的雙功能分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療人類免疫缺陷病毒-相關(guān)的疾病的肽化合物。
_4]
背景技術(shù)：
截至2007年底，全世界約3320萬人受到人類免疫缺陷病毒(HIV)感染，超過2500萬人死于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。因而，迫切需要發(fā)現(xiàn)和開發(fā)針對HIV感染的新 治療策略。目前，美國食品和藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration of theUnited States)批準(zhǔn)了 28種抗-HIV藥物來治療感染HIV的人們，所述藥物包括15種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RTI)UO種蛋白酶抑制劑(PI)、一種整合酶抑制劑(II)和兩種進(jìn)入抑制劑(EI)。所有的RTI，PI和II在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后抑制HIV復(fù)制。兩種EI可阻斷HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞，但它們不能在HIV附在靶標(biāo)細(xì)胞上之前使病毒失活。EI之一是基于HIV包膜蛋白(Env)跨膜亞基gp41C_末端七肽重復(fù)(CHR)區(qū)域的序列設(shè)計(jì)的合成肽，命名為T20(恩夫韋肽，)，其通過靶向gp41抑制HIV與宿主細(xì)胞融合。T20通過靶向HIV包膜蛋白(Env) gp41抑制HIV進(jìn)入，所述HIV包膜蛋白(Env)gp41由融合肽(FP)以及N-末端七肽重復(fù)和C-末端七肽重復(fù)(NHR和CHR)組成(圖I)。在天然狀態(tài)下，gp41是難以接近的，因?yàn)槠渎裨贖IV包膜蛋白gpl20的下面。HIV感染過程開始時(shí)，gpl20與靶細(xì)胞上的⑶4結(jié)合，引起gp41改變構(gòu)象(I)FP插入靶細(xì)胞膜；(2)NHR聯(lián)合形成NHR-三聚物和(3) CHR與NHR-三聚物相互作用以形成發(fā)夾樣六_螺旋束出-HB)，其使病毒和細(xì)胞膜達(dá)到對于融合而言必要的密切接近。T20和另一種CHR肽(CP)C34可與病毒gp41NHR-三聚物結(jié)合并阻斷6-HB形成，導(dǎo)致HIV融合的抑制。但是，T20不能在病毒附在靶細(xì)胞上之前使在血液中循環(huán)的HIV失活，因?yàn)門20僅能在病毒開始與靶細(xì)胞上的CD4的接觸之后與HIV相互作用。因?yàn)檫@些間題，T20肽必須在HIV/AIDS患者的血液中以恒定的高濃度保持。因而，T20不得不以90mg/劑量每天注射兩次而被施用，導(dǎo)致大多數(shù)患者注射部位的疼痛反應(yīng)和對患者而言高的花費(fèi)(> $20，000/年/患者)。因而，T20在發(fā)展中國家使用是過于昂貴的。因而，需要用于治療HIV感染和AIDS的改進(jìn)的藥物。附圖簡沭圖I描繪了 gp41功能結(jié)構(gòu)域的示意性圖。殘基數(shù)目對應(yīng)于其在HIV-1HXB2 gpl60中的位置。FP，融合肽；TR，色氨酸富集區(qū)；TM，跨膜結(jié)構(gòu)域；CP，細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。圖2描繪了在gp41的N-末端七肽重復(fù)(NHR)和C-末端七肽重復(fù)(CHR)之間以及在N-肽和C-肽之間的相互作用。在NHR和CHR之間的虛線表示在位于NHR的e和g位置的殘基和位于CHR中a和d位置的殘基之間的相互作用。圖3描繪了 gp41-介導(dǎo)的HIV融合和NHR-結(jié)合蛋白(NBP)和雙功能分子——2D-NBP的作用機(jī)制的模型。NBP (例如，C46、C34、T1144和T20)與gp41 NHR結(jié)合，導(dǎo)致HIV與靶細(xì)胞融合的抑制(iii)。2D-NBP通過其2D結(jié)構(gòu)域與gpl20結(jié)合，并通過NBP結(jié)構(gòu)域與gp41 NHR相互作用，導(dǎo)致不可逆的HIV失活(i)。像NBP—樣，2D-NBP也可抑制病毒與靶細(xì)胞融合(ii)。圖4描繪了 gp41-介導(dǎo)的HIV融合和CHR-結(jié)合蛋白(CBP)與雙功能分子——2D-CBP的作用機(jī)制的模型。CBP (例如，N46和N36)與gp41 CHR結(jié)合，導(dǎo)致HIV與靶細(xì)胞融合的抑制(iii)。2D-CBP通過其2D結(jié)構(gòu)域與gpl20結(jié)合，并通過CBP結(jié)構(gòu)域與gp41 CHR相互作用，導(dǎo)致不可逆的HIV失活(i)。像CBP—樣，2D-CBP也可抑制病毒與靶細(xì)胞融合(ii)。 圖5描繪了 gp41-介導(dǎo)的HIV融合和FP-結(jié)合蛋白(FBP)與雙功能分子——2D-FBP的作用機(jī)制的模型。FBP(例如，VIRIP-1)與gp41 FP結(jié)合，導(dǎo)致HIV與靶細(xì)胞融合的抑制(iii) ο 2D-FBP通過其2D結(jié)構(gòu)域與gpl20結(jié)合，并通過FBP結(jié)構(gòu)域與gp41 NHR相互作用，導(dǎo)致不可逆的HIV失活(i)。像FBP —樣，2D-FBP也可抑制病毒與靶細(xì)胞融合(ii)。圖6描繪了經(jīng)純化的2D和2D-NBP8的SDS_PAGE(圖6A)和Western印跡(圖6B和6C)分析。圖7描繪了 2D(s⑶4的D1D2結(jié)構(gòu)域)的生物學(xué)特征。針對⑶4的多克隆抗體(T4-4)、構(gòu)象-依賴型Sim. 4單克隆抗體和針對NBP8的多克隆抗體用來檢測結(jié)合的重組體2D分子。圖8描繪了 2D-NBP8的生物學(xué)特征。針對⑶4的多克隆抗體(T4-4)、構(gòu)象-依賴型Sim. 4單克隆抗體和針對ΝΒΡ8的多克隆抗體用來檢測結(jié)合的重組體2D-NBP8分子。圖9描繪了 2D和2D-NBP8與重組體gpl20的結(jié)合活性。

圖10描繪了 2D和2D-NBP8與5_螺旋的結(jié)合活性。圖11描繪了 2D和2D-NBP8的功能活性。如通過流式細(xì)胞計(jì)量分析檢測的，2D (圖IlB和11F)和2D-NBP8 (圖IlC和11G)都具有在表面CHO-WT上與野生型gpl20/gp41結(jié)合的能力(圖11E-H)。包括了作為對照的不表達(dá)gpl20/gp41的CH0_EE(圖· 11A-D)。圖IlA和IlE描繪了 s⑶4對照并且圖IlD和IlH描繪了 NBP8對照。圖12描繪了通過表面等離子體共振(SPR)分析的2D和2D-NBP8的結(jié)合親和性。圖 12A 2D 與 gpl20 結(jié)合。圖 12B 2D-NBP8 與 gpl20 結(jié)合。圖 12C NBP8 與 gpl20 結(jié)合。圖13描繪了在ELISA檢驗(yàn)中2D-NBP8對6-HB形成的抑制作用。圖14描繪了在熒光非變性-PAGE檢驗(yàn)(FN-PAGE)中2D-NBP8對6-HB形成的抑制作用。圖14A和14C =FN-PAGE分析。圖14B和14D =FN-PAGE凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色。圖15描繪了如通過p24檢驗(yàn)測定的，MT-2細(xì)胞中，2D和2D-NBP8對經(jīng)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的HIV-1IIIB毒株(亞型B，X4)的感染的抑制。圖16描繪了如通過熒光素酶檢驗(yàn)測定的，M7細(xì)胞中，2D和2D-NBP8對HIV_1 Bal毒株(亞型B，R5)的感染的抑制。圖17描繪了如通過p24檢驗(yàn)測定的，MT-2細(xì)胞中，通過實(shí)驗(yàn)適應(yīng)的HIV-1IIIB毒株(亞型B, X4)的2D、2D-NBP8、NBP8和T20的病毒失活活性。圖18描繪了如通過熒光素酶檢驗(yàn)測定的，M7細(xì)胞中，通過HIV-IBal毒株(亞型B，R5)的2D、2D-NBP8、NBP8和T20的病毒失活活性。圖19描繪了在4°C (圖19A)下和25°C下(圖19B)，通過與暴露的N-HR結(jié)構(gòu)域相互作用，2D-活化的包膜糖蛋白中間產(chǎn)物的通過2D-NBP8的去穩(wěn)定性作用。圖20描繪了通過2D活化的結(jié)合細(xì)胞的病毒的感染性的抑制。

發(fā)明內(nèi)容
本文中公開的雙功能分子(命名為2D-CP)含有⑴可溶的⑶4(s⑶4)或s⑶4的D1D2結(jié)構(gòu)域(2D)，其可與gpl20結(jié)合以觸發(fā)gp41中的構(gòu)象改變，導(dǎo)致NHR、CHR和FP暴露；(ii)可分別與gp41NHR、CHR或FP相互作用的NHR-結(jié)合肽、CHR-結(jié)合肽或FP-結(jié)合肽(CP) ；(iii)由10至40個(gè)氨基酸((GGGGS)n，其中η = 2-8)組成的柔性連接物以連接2D和CP，使得這兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域可自由移動(dòng)以結(jié)合HIV或HIV-感染的細(xì)胞上的對應(yīng)靶蛋白。這些雙功能分子甚至能在病毒攻擊靶細(xì)胞之前使HIV失活并抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞。這些分子還可被開發(fā)作為新穎抗-HIV療法，所述療法通過不同于當(dāng)前抗-HIV藥物的
作用機(jī)制用于治療感染HIV(包括非-B和多種藥物抗性毒株)的患者。在本文公開的一種實(shí)施方式中，提供了包含下述多肽的藥物組合物，所述多肽包含第一結(jié)構(gòu)域，其包含可溶的⑶4或可溶的⑶4的一部分；第二結(jié)構(gòu)域，其包含從由N-末端七肽重復(fù)(NHR)-結(jié)合肽、C-末端七肽重復(fù)(CHR)-結(jié)合肽和融合肽(FP)-結(jié)合肽組成的組中選擇的人類免疫缺陷病毒(HIV) gp41功能結(jié)構(gòu)域-結(jié)合序列；和連接第一結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和第二結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的柔性連接物，其中連接物包含氨基酸序列(GGGGS)n,其中η是在2和8之間的整數(shù)。在另一種實(shí)施方式中，可溶⑶4的一部分包含s⑶4的D1D2結(jié)構(gòu)域。在另一種實(shí)施方式中，NHR-結(jié)合肽從由 C46、C38、C36、C34、C28、C51、西夫韋肽、T1144、CP621-652、CP32M、T1249、PBD-4HR、CBD1 和 T20 組成的組中選擇；CHR-結(jié)合肽從由 N46、N36、N34、N51、DP107、N17和N28組成的組中選擇；FP-結(jié)合肽從由VIRIP164、VIRIP165、VIRIP353和VIRIP576組成的組中選擇。還在另一種實(shí)施方式中，多肽包含從由SEQ ID NOs :37_62組成的組中選擇的氨基酸序列。還在另一種實(shí)施方式中，組合物還包括至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在本文中公開的一種實(shí)施方式中，提供了治療病毒感染的方法，其包括給暴露于HIV感染的個(gè)體施用有效劑量的公開的藥物組合物；使HIV失活并阻斷HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，從而治療病毒感染。在另一種實(shí)施方式中，藥物組合物包含下述多肽，所述多肽包含從由SEQID NOs 37-62組成的組中選擇的氨基酸序列。在本文公開的一種實(shí)施方式中，提供了預(yù)防病毒感染的方法，其包括給已暴露于HIV或?qū)⒈┞队贖IV的個(gè)體施用有效劑量的公開的藥物組合物；使HIV失活并阻斷HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，從而預(yù)防病毒感染。在另一種實(shí)施方式中，藥物組合物被局部施用，以預(yù)防HIV的性傳播。還在另一種實(shí)施方式中，藥物組合物包含下述多肽，所述多肽包含從由SEQ IDNOs 37-62組成的組中選擇的氨基酸序列。發(fā)明詳述本文中公開的雙功能分子(命名為2D-CP)含有(i)包含可溶的CD4(sCD4)或s⑶4的D1D2結(jié)構(gòu)域(2D)的第一結(jié)構(gòu)域，其可與gpl20結(jié)合以觸發(fā)gp41的構(gòu)象改變，導(dǎo)致gp41N-末端七肽重復(fù)(NHR)、C-末端七肽重復(fù)(CHR)或融合肽(FP)暴露；(ii)包含NHR-結(jié)合肽、CHR-結(jié)合肽或FP-結(jié)合肽(CP)的第二結(jié)構(gòu)域，其可分別與gp41 NHR-、CHR-或FP相互作用；(iii)和由10至40個(gè)氨基酸((GGGGS)n，其中η = 2-8)組成的柔性連接物，以連接第一結(jié)構(gòu)域(2D)和第二結(jié)構(gòu)域(CP)，使得這兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域可自由移動(dòng)以結(jié)合在人類免疫缺陷病毒(HIV)或HIV-感染的細(xì)胞上的對應(yīng)靶蛋白。這種設(shè)計(jì)的分子在Ε. coli或293Τ細(xì)胞中表達(dá)，通過色譜純化并在HIV-介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合和HIV復(fù)制上測試其抑制活性，以及測試其使無細(xì)胞的HIV和伴隨細(xì)胞的HIV失活的能力。本文中公開了一系列雙功能分子，命名為D1D2-NHR-結(jié)合肽(2D-NBP)、D1D2-CHR-結(jié)合肽(2D-CBP)和D1D2-FP-結(jié)合肽(2D-FBP)，其通過經(jīng)由2D (可溶的CD4的D1D2結(jié)構(gòu)域)和NBP、CBP或FBP，分別與gpl20和gp41NHR、CHR或FP結(jié)合使HIV失活，和/或通過經(jīng)由其NHR、CHR或FP結(jié)構(gòu)域與gp41前發(fā)夾中間結(jié)構(gòu)相互作用來抑制HIV融合并進(jìn)入靶細(xì)胞。這些雜交分子可作為雙重保護(hù)，因?yàn)镮)它們在病毒開始與靶細(xì)胞接觸之前殺死HIV ;和2)萬一病毒逃脫分子的第一次攻擊的話，它們在病毒附著在細(xì)胞上之后阻斷HIV進(jìn)入靶細(xì)胞。 公開的雙功能分子具有將被開發(fā)為在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家都可使用的新穎抗-HIV療法的大的潛力。對比當(dāng)前的抗-HIV藥物，2D-CP具有唯一作用機(jī)制，即使HIV失活。因?yàn)樗鼈兊淖饔脵C(jī)制不同于臨床使用中的其他抗-HIV藥物的作用機(jī)制，2D-CP被期望對具有多種藥物抗性的HIV分離物有效。2D-CP與其他抗-HIV藥物的組合可具有協(xié)同抗-HIV作用。對比T20肽，2D-CP具有更高的體內(nèi)功效，因?yàn)樗鼈兛稍谌魏谓o定時(shí)間下使在血液中循環(huán)的HIV失活并還可抑制HIV融合和進(jìn)入。作為對比，T20僅可在短暫的時(shí)間窗(<20分鐘)期間，即在由gpl20與⑶4+靶細(xì)胞結(jié)合觸發(fā)的從天然至中間狀態(tài)的gp41的構(gòu)象改變期間抑制HIV融合。因此，可需要比T20更低劑量且較不頻繁注射的2D-CP來消除血液中的HIV或減少病毒載量。因而，對患者而言，2D-CP較不昂貴并且使得他們更少地遭受注射部位反應(yīng)。而且，作為重組蛋白的2D-CP可比合成肽T20具有更低的生產(chǎn)成本(因?yàn)樗鼈兛纱笠?guī)模表達(dá))和更高的穩(wěn)定性和半衰期(因?yàn)槠漭^大的分子大小)并因而期望對發(fā)展中國家而言是更為負(fù)擔(dān)得起的。示例性的CP 包括但不限于，C46 (SEQ ID NO 6)、C38 (SEQ IDNO 7)、C36 (SEQ IDNO :8)、C34(SEQ ID NO :4)、C28 (SEQ ID NO :9)、C51 (SEQ ID NO : 10)、西夫韋肽(SEQ ID NO:11)、T1144(SEQ IDNO :12)、C35_EK(SEQ ID NO :63)、CP621_652(SEQ ID NO :13)、CP32M(SEQID NO :14)、T1249(SEQ ID NO :15)、PBD_4HR(SEQ ID NO :16)、CBDI(SEQ ID NO :17)、T20 (SEQID NO :5)、N46(SEQ ID NO :18)、N36 (SEQ ID NO :1)、N34(SEQ ID NO :19)、N51 (SEQ ID NO:
20)、DP107(SEQID NO :21)、N17 (SEQ ID NO :22)、N28 (SEQ ID NO :2)、VIRIP164(SEQ IDNO 23)、VIRIP165(SEQ ID NO :24)、VIRIP353(SEQ ID NO :25)和 VIRIP576(SEQ ID NO :26)。另外，本文公開了藥物組合物，其與SEQ ID NOs :37-62的氨基酸序列具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的同一性。關(guān)于此類序列的同一性或同源性在本文中被定義為在比對序列且如果必要的話引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比同源性之后，并且不將任何保守置換考慮為序列同一性的一部分，候選序列中的氨基酸殘基與SEQ ID NOs :37-62等同的百分比。融合蛋白或N-末端、C-末端或內(nèi)部延伸、缺失或插入肽序列不應(yīng)解釋為影響同源性。因此，本文中公開的蛋白包括具有SEQ ID NOs :37_62的氨基酸序列的分子；氨基酸序列變體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已插入至公開的編碼序列的N-或C-末端或公開的編碼序列內(nèi)；已被置換至少一個(gè)殘基的所公開序列的氨基酸序列變體或如上文定義的其片段。此類片段還稱為肽或多肽，可含有抗原區(qū)域、經(jīng)鑒定作為對應(yīng)于已知蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列區(qū)域的蛋白功能區(qū)域以及明顯的親水性區(qū)域。通過使用商購的蛋白序列分析軟件比如MacVector (Oxford Molecular),所述區(qū)域都是可容易鑒定的。本文中使用時(shí)，將肽中的氨基酸殘基指定為在括弧中的氨基酸之間有斜杠的超過一種氨基酸(使用常用的單字母的氨基酸代碼)，表示任何指出的氨基酸或其模擬物(除非特別聲明除去)可占據(jù)所述殘基。例如，(I/L/V) (T/S/A/V/C)表示第一殘基可以是異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸之任一，且第二殘基可以是蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸或半胱氨酸或模擬物之任一。公開的肽的氨基酸殘基包括保守氨基酸置換。例如，可制造保守氨基酸改變，其盡管改變蛋白或肽的初級序列，但通常不會(huì)改變其功能。保守氨基酸置換典型地包括在下述組內(nèi)的置換甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體中的可抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的上述雙功能肽。公開的藥物組合物的劑量和期望的藥物濃度可取決于預(yù)期的具體用途而改變。適當(dāng)劑量或施用途徑的測定完全在普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了用于測定人療法有效劑量的可靠指南。有效劑量的物種間按比例換算(interspeciesscaling)可以按照 Mardenti, J.和 Chappell, ff. “The use of interspecies scalingin toxicokinetics”，Toxicokinetics and NewDrug Development, Yacobi et al, Eds.,Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96規(guī)定的原則進(jìn)行。本文中使用的術(shù)語“治療上有效的”量是指進(jìn)行疾病例如感染性疾病的具體治療所需的量?！爸委煛奔劝ㄖ钢委熜灾委熞舶A(yù)防性手段，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)目標(biāo)病理學(xué)狀況或疾病。需要治療的個(gè)體包括已經(jīng)患有疾病的個(gè)體，以及易于患病的個(gè)體,或要預(yù)防疾病的個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方式中，疾病是存在的。在另一實(shí)施方式中，由于本文所述的方法，細(xì)胞或個(gè)體的壽命被延長。2D-CP具有被開發(fā)作為用于治療被HIV (包括非-B和多種藥物抗性毒株)感染的患者的新穎抗-HIV療法、作為HIV感染的暴露前和暴露后預(yù)防的預(yù)防性用藥、作為預(yù)防HIV性傳播的殺微生物劑的潛能。不需要過多的實(shí)驗(yàn)就可以將上述化合物用于施用給哺乳動(dòng)物(包括人)，以適合具體的應(yīng)用。另外，使用標(biāo)準(zhǔn)的劑量-應(yīng)答方案，不需要過多的實(shí)驗(yàn)就可以確定組合物的適當(dāng)劑量。因此，通過本領(lǐng)域公知的手段，例如使用惰性稀釋劑或藥物可接受的載體，不需要過多的實(shí)驗(yàn)就可制造被設(shè)計(jì)用于口、鼻、舌、舌下、頰、頰內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)和肺施用的組合物。組合物可被封裝在明膠膠囊中或壓縮成片劑。就口服治療施用的目的而言，藥物組合物可與賦形劑摻合，并以片劑、糖錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖衆(zhòng)、薄餅(wafers)、口香糖等等形式使用。“藥學(xué)上可接受的載體”表示任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體。合適載體的例子是本領(lǐng)域公知的,可包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體,如磷酸鹽緩沖的鹽溶液、含有Polysorb80的磷酸鹽緩沖的鹽水、水、乳液如油/水乳液，和多種類型的濕潤劑。其它載體也可包括無菌溶液、片劑、有涂層的片劑和膠囊。典型地，此類載體含有賦形劑如淀粉、奶、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或硬脂酸鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或植物油、膠質(zhì)、二醇或其它已知的賦形劑。此類載體也可以包含香料和著色添加劑或其它成分。包含此類載體的組合物通過公知的常規(guī)方法配制。片劑、丸劑、膠囊、糖錠等等也可含有粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜化劑和調(diào)味劑。粘合劑的一些例子包括微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠。賦形劑的例子包括淀粉或乳糖。崩解劑的一些例子包括褐藻酸、玉米淀粉等等。潤滑劑的例子包括硬脂酸鎂或硬脂酸鉀。助流劑的例子是膠體二氧化硅。甜味劑的一些例子包括蔗糖、糖精等等。調(diào)味劑的例子包括薄荷、水楊酸甲酯、橙味香料等等。制備這些多種組合物中使用的材料應(yīng) 當(dāng)是藥物純的，并且在使用的用量下無毒?？梢员憷啬c胃外施用化合物，例如通過靜脈內(nèi)、肌肉、鞘內(nèi)或皮下注射?？梢酝ㄟ^將化合物摻入溶液或懸浮液中，來完成腸胃外施用。此類溶液或懸浮液也可以包括無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑。腸胃外配制物也可以包含抗菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯，抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，和螯合劑如EDTA。也可以添加緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或右旋糖。腸胃外制劑可以被封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量管中。直腸施用包括向直腸或大腸內(nèi)施用藥物組合物中的化合物。這可以使用栓劑、灌腸劑、凝膠、霜?jiǎng)⑵瑒┑鹊葋硗瓿??？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法容易地制造栓劑配制物。類似地，可以配制陰道施用形式，包括栓劑、凝膠、灌腸劑、霜?jiǎng)⑵瑒?、環(huán)等等。組合物可以旨在以例如栓劑的形式用于直腸或陰道施用，所述栓劑會(huì)在直腸中融化并釋放藥物。用于直腸或陰道施用的組合物可含有油脂性的基質(zhì)作為合適的非刺激性的賦形劑。此類基質(zhì)包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。對栓劑的制備而言低熔點(diǎn)蠟是優(yōu)選的，其中脂肪酸甘油酯和/或可可脂的混合物是合適的蠟。可以將蠟融化，并通過攪拌將環(huán)己胺化合物均勻地分散在其中。然后將熔融的均勻混合物倒入便利的一定尺寸的模具中，使其冷卻從而固化。旨在用于局部施用的公開的組合物可以適當(dāng)?shù)匕ㄈ芤?、乳液、軟膏劑、霜?jiǎng)┗蚰z基質(zhì)?；|(zhì)可例如包括以下一種或多種凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑如水和醇，和乳化劑與穩(wěn)定劑。增稠劑可存在于用于局部施用的藥物組合物中。經(jīng)皮施用包括組合物通過皮膚的經(jīng)皮吸收。經(jīng)皮配制物包括貼片、離子電滲裝置、軟膏劑、霜?jiǎng)?、凝膠、油膏劑(salves)等等。組合物可包括修飾固體或液體劑量單位的物理形式的多種材料。例如，組合物可包括在活性成分周圍形成涂層的材料。形成涂層殼的材料可典型地是惰性的，并且可以選自例如糖、紫膠和其他腸涂層試劑。或者，活性成分可以被包裝在明膠膠囊或扁膠囊中。
實(shí)施例實(shí)施例I雙功能分子2D-NBP8的表汰和純化
為了產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒p2D-NBP8-PDI，通過三步重疊PCR，將編碼2D、35_mer連接物(GGGGS) 7 (SEQ ID NO 34)和NBP8 (SEQ NO 12)的DNA片段連接在一起。第一，使用如在表I中描繪的對應(yīng)的引物對，通過重疊PCR產(chǎn)生2D (具有6-his標(biāo)簽)、L35和NBP8 DNA片段。第二，用引物FL35和RNBP8，通過重疊PCR將編碼L35和NBP8的DNA片段連接。第三，用DNA片段2D以及引物F2Dhis和RNBP8，通過重疊PCR，將編碼2D和L35-NBP8的兩條DNA片段連接。最后，通過BamHI和EcoRI消化編碼NBP8-L35-T20的擴(kuò)增的DNA片段并插入表達(dá)載體pGEX-6p-l中以產(chǎn)生p2D-NBP8質(zhì)粒。為了防止在E. coli中形成包涵體，將在N末端具有精確蛋白酶位點(diǎn)(稱為PP酶位點(diǎn))的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)DNA序列(aal8-508)插入位于質(zhì)粒P2D-NBP8中的His-2D-NBP8基因的C末端處的EcoR I和Xho I位點(diǎn)中，以延伸GST-his-2D-NBP8閱讀框并導(dǎo)致嵌合的GST-his-2D-NBP8-ppase_PDI的產(chǎn)生。該質(zhì)粒被稱為P2D-NBP8-PDI。通過DNA測序證實(shí)這些序列。表I.用于構(gòu)建表達(dá)載體，pTLT-Ι的引物·
權(quán)利要求
1.包含多肽的藥物組合物，所述多肽包含 第一結(jié)構(gòu)域，其包含可溶的⑶4或可溶的⑶4的一部分； 第二結(jié)構(gòu)域，其包含從由N-末端七肽重復(fù)(NHR)-結(jié)合肽、C-末端七肽重復(fù)(CHR)-結(jié)合肽和融合肽(FP)-結(jié)合肽組成的組中選擇的人類免疫缺陷病毒(HIV)gp41功能結(jié)構(gòu)域-結(jié)合序列；和 連接所述第一結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和所述第二結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的柔性連接物，其中所述連接物包含氨基酸序列(GGGGS) n，其中η是在2和8之間的整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的藥物組合物，其中所述可溶的⑶4的一部分包含可溶的⑶4的D1D2結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的藥物組合物，其中所述NHR-結(jié)合肽從由C46、C38、C36、C34、C28、C51、西夫韋肽、T1144、CP621-652、CP32M、T1249、PBD-4HR、CBDl 和 T20 組成的組中選擇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的藥物組合物，其中所述CHR-結(jié)合肽從由N46、N36、N34、N51、DP107、N17和N28組成的組中選擇。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的藥物組合物，其中所述FP-結(jié)合肽從由VIRIP164、VIRIP165、VIRIP353和VIRIP576組成的組中選擇。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的藥物組合物，其中所述多肽包含從由SEQIDNOs :37-62組成的組中選擇的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的藥物組合物，其中所述組合物還包括至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
8.治療病毒感染的方法，其包括 給暴露于HIV感染的個(gè)體施用有效劑量的權(quán)利要求I的藥物組合物； 使所述HIV失活并 阻斷所述HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，從而治療所述病毒感染。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述藥物組合物包含下述多肽，所述多肽包含從由SEQID NOs 37-62組成的組中選擇的氨基酸序列。
10.預(yù)防病毒感染的方法，其包括 給已經(jīng)暴露于或?qū)⒁┞队贖IV的個(gè)體施用有效劑量的權(quán)利要求I的藥物組合物； 使所述HIV失活并 阻斷所述HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，從而預(yù)防所述病毒感染。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中局部施用權(quán)利要求I的藥物組合物來預(yù)防HIV的性傳播。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述藥物組合物包含下述多肽，所述多肽包含從由SEQID NOs 37-62組成的組中選擇的氨基酸序列。
全文摘要
本文中公開了雙功能分子，其甚至能在病毒攻擊靶細(xì)胞之前使人類免疫缺陷病毒(HIV)失活并抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞。還公開了用于治療被HIV感染的患者的新穎抗-HIV療法。還公開了用于對HIV預(yù)防和對HIV感染治療的方法。
文檔編號C07K14/16GK102883740SQ201180022594
公開日2013年1月16日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月3日
發(fā)明者姜世勃, 潘春恩, 盧路 申請人:紐約血庫公司