專利名稱:結(jié)合反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及在含有羧基或磷酸酯基(特別是磷酸酯(V)基團)的反應(yīng)物和含有胺基的反應(yīng)物之間的結(jié)合反應(yīng),和涉及用于這樣的反應(yīng)的試劑。
背景技術(shù):
已知如何使用羧基活化試劑例如碳二亞胺(R1N=C=N R2),使含有羧基的反應(yīng)物和含有胺基的反應(yīng)物結(jié)合,這種碳二亞胺起零長度交聯(lián)劑的作用。碳二亞胺與羧基的反應(yīng)為最重要的反應(yīng)之一,并且用于使分子或生物分子偶合到多種表面,包括用于親和色譜法的載體;用于衍生化用于側(cè)向流動試驗或凝集分析的膠乳微粒;和用于衍生化芯片表面以使用表面等離子體(plasmon)共振研究分子間的相互作用。碳二亞胺也已用于量化蛋白中的羧基,和用于將抗原/分析物共價連接于載體蛋白,以 提高免疫原性。碳二亞胺與羧基的反應(yīng)產(chǎn)生高度不穩(wěn)定的O-?;愲?acylisourea),后者可進一步與胺反應(yīng)形成酰胺。在沒有氨基的情況下,O-酰基異脲與另一分子的酸反應(yīng)形成酸酐,或者經(jīng)歷分子內(nèi)的O-至N-?;嘏乓孕纬煞€(wěn)定的N-酰基脲。在水溶液(但不是在有機溶劑)中,O-酰基異脲被水(濃度為 55M)快速水解,重新生成原來的羧基并將碳二亞胺轉(zhuǎn)化成非反應(yīng)性的取代脲。由于與水分子競爭,可能胺難以反應(yīng)形成酰胺,除非胺前體以高濃度存在。最后,在沒有羧基的情況下,碳二亞胺可與胺反應(yīng)形成胍。碳二亞胺的主要應(yīng)用之一是在生物偶聯(lián)領(lǐng)域,在一種實體物質(zhì)(例如蛋白、微?;蛐酒砻?上的羧基官能團借以被活化,然后與另一種實體物質(zhì)上的胺基反應(yīng),形成酰胺連接的軛合物,所述另一種實體物質(zhì)通常為蛋白或肽或分析物。通常,在這樣的反應(yīng)中,實體物質(zhì)的羧基在pH 4-pH 6的緩沖溶液中與胺化的分子接觸,并加入水溶性的碳二亞胺以啟動所述結(jié)合反應(yīng)。在有機溶劑中進行的反應(yīng)(例如肽的合成)通常采用疏水性碳二亞胺例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或N,N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)。然而,涉及生物分子的反應(yīng)通常需要水性條件,或者基本上為水溶液,并且在這些情況下,水溶性的碳二亞胺例如I-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺(EDC;也稱為EDAC)或環(huán)己基-(β-DV-甲基嗎啉代]乙基)碳二亞胺(CMC)為優(yōu)選的。當(dāng)不能獲得足夠高濃度的胺(例如由于水溶性有限或者成本高)時,通過加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),以將高度不穩(wěn)定的ο-?;愲逯虚g體轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的琥珀酰亞胺基(或‘NHS’)酯,后者也易于與胺反應(yīng),可增大結(jié)合反應(yīng)的效率(Staros et. al.,Anal. Biochem. , 156,220-222,1986)。NHS可大大地加速反應(yīng)并促使一些生物分子發(fā)生不受控制的交聯(lián),因此對于NHS的需要必須視情況的不同來確定。EDC 與竣基的反應(yīng)在 pH 3. 5-4. 5 下最有效(Nakajima and Ikada, BonconjugateChem. 6,第123-130頁,1995)。對于EDC介導(dǎo)的酰胺鍵形成最佳的pH通常稍高一點,通常在pH 4和pH 6之間。這種最佳值反映了多種因素的平衡,這些因素包括ο-酰基異脲的形成和水解速率、胺親核試劑的pKa,其pH可基本上高于ο-酰基異脲中間體優(yōu)先形成時的pH。考慮到胺與EDC在沒有羧基時的潛在反應(yīng),假設(shè)目的是形成酰胺鍵,胺在加入羧基化物質(zhì)種類之前通常不與EDC接觸,盡管常見的實踐是向包含含有胺-和羧基-的物質(zhì)的溶液中加入新鮮制備的EDC。這樣的反應(yīng)混合物理想的情況下不存在帶有能夠與碳二亞胺或ο-?;愲逯虚g體反應(yīng)的官能團的其它組分。增大碳二亞胺介導(dǎo)的磷酸酯基與胺之間的縮合反應(yīng)的反應(yīng)效率的一種類似方法使用甲基咪唑作為穩(wěn)定劑。通常認為碳二亞胺在水性溶液中是不穩(wěn)定的。例如,EDC的特性普遍被描述為高度不穩(wěn)定的分子,并且在先有技術(shù)中關(guān)于在生物結(jié)合反應(yīng)中需要使用新鮮制備的EDC溶液存在許多警示。例如,BioconjugateTechniques (GT Hermanson 1996; ISBN 0_12_342335-χ ;Ρ170)指出“···.儲備溶液應(yīng)快速溶解并立即使用,以防止廣泛喪失活性”。一個較新的版本的Bioconjugate Techniques (2008)指出EDC在水性環(huán)境中不穩(wěn)定,并應(yīng)在溶液制備之后立即使用(GT Hermanson 2008; ISBN 978-0-12-370501-3,第688 頁)。在用于結(jié)合羧基SiMAG磁性顆粒的方法中,制造商Chemicell GmbH在方案Al中建議如下“向顆粒中僅加入新鮮制備的EDC···.(被下劃線的文字在原始方案中以粗體顯示)”。用于Carboxylink凝膠(Pierce,產(chǎn)品編碼20266)的方案指出“注意EDC對水分敏感,并當(dāng)溶解于水性緩沖液時快速水解….使用之前快速并立即溶解需要一定量的試齊U,并丟棄任何未使用的溶液?!?br>
Sigma-Aldrich產(chǎn)品信息(EDC,產(chǎn)品編碼E7750)指出“產(chǎn)品為水溶性的,但是不穩(wěn)定。建議使用之前立即制備新鮮溶液?!?br>
Nanopartz GmbH在描述其羧基聚合物球形金納米顆粒結(jié)合試劑盒的正確使用中指出“僅使用必要量的EDC-—旦溶解于水中其使用期少于I小時。”
微米顆粒的另一個供應(yīng)商(Seradyn)在‘推薦的吸附和共價偶聯(lián)程序’(1999)中指出“請注意EDAC對水分非常敏感,并在水溶液中經(jīng)歷快速水解?!?br>
EDC 一般作為鹽酸鹽得自商業(yè)供應(yīng)商,并且常規(guī)地以粉末狀,通常于_20°C下儲存于玻璃瓶中。通常的實踐是與干燥劑儲存在一起,并在打開之前使儲備瓶與室溫平衡以免水分在瓶內(nèi)冷凝。關(guān)于EDC在水性環(huán)境下的穩(wěn)定性已進行幾項研究(Gilles et al. , Anal.Biochem. 184, 第 244-248 頁,[1990] ; Nakajima and Ikada, Bioconjugatechemistry, 6, 123-130 [1995] ; Williams and Ibrahim; J. Am. Chem. Soc. 103,7090-7095 [1981] ; Lei et al. , Anal Biochem. 310,122-124 [2002])。盡管不同的實驗設(shè)計妨礙任何直接的數(shù)據(jù)比較,但是主要的研究結(jié)果可因此進行概述
隨著pH從pH 7減少至約所述值(即約pH 4),在該pH下發(fā)生ο-酰基異脲中間體的有效形成,EDC 的分解增大(Lei et al. , Anal Biochem. 310,122-124 [2002])。酸催化的EDC水解為相應(yīng)的脲,這為酸性介質(zhì)喪失的主要途徑。確實,涉及EDC的反應(yīng)有時用HCl猝滅。已在堿性緩沖液中觀察到EDC的較低速率的分解(Nakajima and Ikada; BonconjugateChem. 6,第 123-130 頁,1995),盡管 Williams and Ibrahim (J. Am. Chem. Soc. 103,7090-7095, 1981)記錄了在氫氧化鈉存在下的高速率水解。在Molecular Biology volume 394,沙門氏菌屬方法和方案(SalmonellaMethods and Protocols) (SA Dunbar & J W Jacobsen;第 I5 頁)的方法中,給出以下建議“EDC在水存在下不穩(wěn)定。活性物質(zhì)種類在水性溶液中以僅僅幾秒鐘的速率常數(shù)水解,因此應(yīng)小心地最大限度的減少對空氣和水分的暴露”。已知EDC在水溶液中的水解分解由于羧基的存在被大大加速,羧基催化循環(huán)反應(yīng),包括反復(fù)形成和水解高度不穩(wěn)定的ο-?;愲逯虚g體。在pH 4下觀察到,在三羧酸(枸橡酸)存在下,EDC 損失速率增大 1000 倍(Wrobel et. al. , Anal. Biochem. 305,135-138 [2002])。這些作者也顯示在pH 4下單羧酸(乙酸鹽)和磷酸鹽的顯著加速作用。也注意到各種緩沖劑,包括Tris、M0PS和HEPES的催化效果,盡管在這些情況下的催化機制尚不清楚。對于無機磷酸鹽和對于三磷酸腺苷也觀察到加速分解,推測無機磷酸鹽的加速分 解是通過形成不穩(wěn)定的O-磷酰異脲(phosphoisourea)衍生物發(fā)生的(Gilles et al.,Anal. Biochem. 184,第 244-248 頁,[1990])。乙二胺(其廣泛用于EDC介導(dǎo)的反應(yīng)中,以向羧酸載體或聚合物中引入胺)和單胺(甘氨酸甲酯,其用于封閉/量化羧基),也可加速EDC的分解(Gilles et al.,Anal.Biochem. 184,第 244-248 頁,[1990])。碳二亞胺的水解分解不是EDC獨有的,例如I-乙基-3-(4-氮陽離子_4,4_ 二甲基戊基)碳二亞胺(EAC)比EDC在各種添加劑存在下降解快一個數(shù)量級(Gilles et al.,Anal. Biochem. 184, 244-248, [1990])。在當(dāng)代EDC結(jié)合方案中,含蓄或明確地承認先前技術(shù)中關(guān)于以下方面的各種敘述,這些敘述涉及EDC缺乏穩(wěn)定性,O-?;愲逯虚g體對水解極其敏感,和在通常用于生物結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)(例如羧基)存在下大大加速分解。事實上所報道的EDC的不穩(wěn)定性,和由于多元羧酸加速的分解,毫無疑問已經(jīng)形成了一些非常詳細的用于產(chǎn)生含有EDC的干燥混合物的程序,例如采用通過相變暫時間隔反應(yīng)物的方法(美國專利6809186)。在這種方法中,依序通過閃凍溶液,然后冷凍干燥生成的分層結(jié)構(gòu),以得到干燥產(chǎn)品,使反應(yīng)物結(jié)合。如果人們希望優(yōu)化多個反應(yīng)參數(shù)并且不適合于對任何商業(yè)應(yīng)用按比例放大,這種方法是極其乏味的。美國專利6809186的作者也提到‘在接近中性PH下EDAC的使用期短…’(第8列第47排)。本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn),羧基活化的物質(zhì),例如碳二亞胺,實際上不像文獻中反復(fù)指出的那樣不穩(wěn)定,并且已經(jīng)使用該發(fā)現(xiàn)開發(fā)了一些方法,這些方法使得羧基活化的物質(zhì),例如EDC,易于與含有羧基-或胺-的物質(zhì)(例如蛋白、小分子、微粒)結(jié)合,形成均勻的溶液或混懸液,它們可被凍干而沒有各種組分的顯著分解,并且成功用于生物結(jié)合反應(yīng)。發(fā)明概述
一方面,本發(fā)明提供一種產(chǎn)生試劑的方法,該試劑用于含有羧基或磷酸酯基的第一反應(yīng)物與含有胺基的第二反應(yīng)物之間的結(jié)合反應(yīng),方法包括
a)形成以下組分的溶液或混懸液
i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物質(zhì),這種物質(zhì)能夠作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分,以促使在羧基和胺基之間形成酰胺鍵,或在磷酸酯基和胺基之間形成氨基磷酸酯鍵,和
)第一反應(yīng)物或第二反應(yīng)物;和
b)干燥所述溶液或混懸液。提及的羧基和磷酸酯基包括以解離或未解離形式的這類基團。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)意識到,通常磷酸酯基將以解離形式存在,而羧基的解離或其它狀態(tài)將根據(jù)PH變化。所生成的試劑用于結(jié)合反應(yīng),特別是與生物分子的結(jié)合(生物結(jié)合反應(yīng)),例如用于偶聯(lián)分子例如蛋白與微粒,和用于制備免疫原,如以下更詳細討論的那樣。這種試劑通過重新構(gòu)成為溶液或混懸液并與第二反應(yīng)物或第一反應(yīng)物接觸(無論哪一種不存在于試劑中)來使用。這可通過加入第二或第一反應(yīng)物的溶液,以單一步驟進行,或者以幾個步驟進行(步驟的順序通常不重要)。提供合適的反應(yīng)條件,例如溫度、pH (pH優(yōu)選地為少于8、 少于7或少于6),以使得能夠發(fā)生結(jié)合反應(yīng),第一反應(yīng)物和第二反應(yīng)物通過酰胺鍵連接在一起。通常,在合適的反應(yīng)時間之后,例如通過加入合適的猝滅劑終止所述結(jié)合反應(yīng)。步驟b)優(yōu)選地在步驟a)之后不久進行,例如在約I小時內(nèi),盡管這不一定是關(guān)鍵的。羧基活化或磷酸酯活化的物質(zhì)(為了簡便起見將其稱為活化物質(zhì))和第一或第二反應(yīng)物優(yōu)選地以溶液,優(yōu)選地以水溶液的形式混合。溶液或混懸液優(yōu)選地為均勻的?;罨镔|(zhì)在本領(lǐng)域為已知的,并且包括碳二亞胺、伍德沃德氏(Woodward)試劑K(WRK)和各種其它物質(zhì)。活化物質(zhì)的選擇應(yīng)考慮反應(yīng)混合物中的溶劑類型。對于在水性條件或基本上水性條件下的反應(yīng),至少部分溶于水的活化物質(zhì)為優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的活化物質(zhì)為I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺.HCl (EDC,也稱為EDAC)。其它優(yōu)選的活化試劑包括例如N-乙基-5-苯基異噁唑鎗-3 ’ -磺酸鹽(伍德沃德氏(Woodward)試劑K)、N_環(huán)己基tV’ - ( β - [N-甲基嗎啉代]乙基)碳二亞胺(CMC)、4-氮陽尚子-4,4-二甲基戍基)碳二亞胺(EAC)、2,2-二氯-5-(2-苯基乙基)-4-三甲基甲娃燒基)-3-呋喃酮(DPTF) [Murakama et al. , TetrahedromLetters 37,7541-7544 (1996)]和 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎗氯化物(DMT-MM) [Kuniishima et al. , Tetrahedron 57,1551-1558 (2001)]。其它活化物質(zhì)的實例包括N,N’- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N,N’- 二異丙基碳二亞胺(DIC)、氰胺、1,I’羰基二咪唑(⑶I)、N,N’ - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)、1,2-苯并異噁唑-3-基-二苯基磷酸酯(BDP)和2-乙氧基-I-乙氧基羰基-1,2- 二氫喹啉(EEDQ)。Montalbetti 和Falque [Tetrahedron 61, 10827-10852,(2005)]也描述了這些試劑以及可用于促使自含有羧基和胺的物質(zhì)形成酰胺鍵的其它試劑中的一些試劑。步驟b)優(yōu)選地包含冷凍干燥。合適的方案為本領(lǐng)域熟知的。其它可能的干燥技術(shù)包括噴霧干燥、超臨界干燥和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。該方法優(yōu)選地使用第一反應(yīng)物,即含有羧基的反應(yīng)物進行,含有羧基的第一反應(yīng)物用于與含有胺的第二反應(yīng)物例如蛋白的結(jié)合反應(yīng),例如生物結(jié)合反應(yīng)。所述反應(yīng)物可含有一個或多個羧基。
用于所述方法的第一或第二反應(yīng)物通常包含標記,后者提供可測量性,但不需要這樣做。合適的標記為熟知的,并且特別感興趣的那些標記例如包括有色或熒光微粒、磁性微?;蛑榱?、量子點(Quantum dots) (Q點)、金顆粒、熒光染料、熒光蛋白和酶。第一或第二反應(yīng)物不必起標記作用,例如當(dāng)生成的結(jié)合物用作生產(chǎn)抗體的免疫原時。其它合適的試劑包括核酸和寡核苷酸、羧基化或胺化的葡聚糖、適當(dāng)官能化的珠粒包括瓊脂糖和玻璃;蛋白,包括抗體、抗體片段;糖蛋白、代謝物、分析物、肽,以及具有羧基、胺或磷酸酯基或者這些基團的組合的其它物質(zhì)或表面。微粒優(yōu)選地具有保護性涂覆層,以減少顆粒聚集的可能性。涂覆層便利地包含糖聚合物,例如葡聚糖。合適的涂覆層材料和技術(shù)為熟知的。溶液或混懸液合乎需要地也包括多羥基材料例如糖,海藻糖為目前優(yōu)選的材料。 這種材料可起穩(wěn)定劑作用,特別是在冷凍干燥方法中,并且也可助于所生成的干燥產(chǎn)物隨后在使用中溶解。溶液或混懸液通常包括緩沖劑。這不是必需的,但是緩沖劑可助于在冷凍干燥過程期間穩(wěn)定,并且也可在使用所生成的干燥產(chǎn)物中帶來穩(wěn)定性益處。合適的緩沖劑包括MES、HEPES、MOPS、EPPS (或HEPPS)和CHES。如果存在的話,緩沖劑適當(dāng)?shù)匾韵鄬Φ偷臐舛仁褂?,?yōu)先地為IM或者更少,更優(yōu)先地為100 mM或者更少,還更優(yōu)先地為10 mM或者更少,例如在1-10 mM范圍內(nèi)。溶液或混懸液的pH —般地等于或大于4,優(yōu)選地等于或大于6,更優(yōu)選地等于或大于7或者等于或大于8,并且優(yōu)選地等于或少于14,更優(yōu)選地等于或或少于12,并且最優(yōu)選地等于或少于11。溶液或混懸液任選地包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),以提高結(jié)合反應(yīng)效率,如果要求的話。溶液或混懸液任選地包括清潔劑,以在使用所生成的干燥產(chǎn)物中消除可能的非特異性或其它不需要的結(jié)合相互作用。另一方面,本發(fā)明提供通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的試劑。本發(fā)明也提供干燥的試劑,所述干燥的試劑用于含有羧基或磷酸酯基的第一反應(yīng)物與含有胺基的第二反應(yīng)物之間的結(jié)合反應(yīng),反應(yīng)物包含以下組分的均勻混合物i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物質(zhì),這種物質(zhì)能夠作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分,以促使在羧基和胺基之間形成酰胺鍵,或在磷酸酯基和胺基之間形成氨基磷酸酯鍵,和ii)第一反應(yīng)物或第二反應(yīng)物。所述試劑優(yōu)選地不包括NHS。其它的優(yōu)選和任選特征如以上闡述的那樣。本發(fā)明的試劑便利地以用于結(jié)合反應(yīng)的合適量,優(yōu)選地存在于容器例如小瓶中,特別是對于生物分子,例如對于用于要標記的100 Ug抗體樣品時。一般地,在具有10 ul,40ul、400 ul或I ml溶液或混懸液的玻璃小瓶中制備的冷凍干燥的混合物,分別含有約2_20ug,7. 7-77 ug,77-770 Ug 和 192-1920 Ug 的量的 EDC (基于 EDC. HCl 的摩爾重量 191. 7)。所述試劑任選地通過用本發(fā)明的方法在容器中就地進行干燥來制備,但是或者可以原料藥(bulk)和分配于容器例如小瓶中進行制備。 本發(fā)明也提供結(jié)合試劑盒,試劑盒包含供給本發(fā)明的試劑和使用說明書。
所述試劑盒任選地包括供給猝滅劑,例如β -巰基乙醇。所述試劑盒任選地包括供給緩沖劑,例如在ρΗ5或ρΗ6下的MES。在使用中,緩沖劑優(yōu)選地被加入到要結(jié)合的反應(yīng)物例如抗體中,后者然后被加入到本發(fā)明的試劑中。本發(fā)明也提供實施結(jié)合反應(yīng),尤其是生物結(jié)合的方法,所述方法包括使用如上文定義的依據(jù)本發(fā)明的試劑,或者使用結(jié)合試劑盒。結(jié)合反應(yīng)方法的步驟通常包括以合適的液體(優(yōu)選地為水性的,例如蒸餾水或緩沖水溶液,或者任選地為無菌溶液)重新構(gòu)成所干燥的試劑,并且使重新構(gòu)成的試劑與要結(jié)合的分子(例如抗體等)接觸。本發(fā)明因此可(i)簡化許多生物結(jié)合程序,(ii)消除了對于每一次試驗必須制備碳二亞胺的新鮮溶液的繁瑣和浪費的做法,和(iii)提供超過涉及短暫/受空間隔離條件限制的反應(yīng)物分離的方法的明確的技術(shù)進步。本發(fā)明基于在各種各樣條件下,再檢查EDC在溶液中的穩(wěn)定性的工作,并且導(dǎo)致 形成用于生產(chǎn)含有羧基活化的物質(zhì)例如EDC的多組分均勻冷凍干燥的混合物的有用起點。EDC受到各種處理,并用包括濃蛋白質(zhì)溶液的凝膠化的蛋白結(jié)合試驗,或者更直接地,通過與芳胺(苯胺)反應(yīng),形成可測量的胍化合物,測量殘留活性。從這些試驗中我們能夠識別其中EDC出人意外地對水解穩(wěn)定的多種條件。另一種羧基反應(yīng)性分子,Woodward氏試劑K (WRK),其也被報道在水性環(huán)境下不穩(wěn)定,也使用本發(fā)明的方法成功地得到配制。在我們的實驗室中,經(jīng)數(shù)月時間,其中我們堅持所接受的關(guān)于EDC處理的指導(dǎo)方針,在水性介質(zhì)中,我們使用碳二亞胺進行了大量反應(yīng)。我們擔(dān)憂粉狀EDC儲存品的可能降解,其降解可由于反復(fù)開啟和關(guān)閉常規(guī)于_20°C下儲存于冰箱中的儲存瓶而加劇,促使我們開發(fā)BSA凝膠試驗(實施例I)以檢查EDC溶液的完整性。然而,自瓶中取出的EDC粉末,其已老化或者在反復(fù)使用期間似乎已經(jīng)變得潮濕(即顯示凝結(jié)成塊的跡象,而不是在首次開啟時的明顯細粉),不能得到在水中的溶液,在BSA凝膠試驗中顯示明顯劣質(zhì)。這促使我們在使溶液‘老化’幾小時之后測試EDC,其結(jié)果不一定與快速水解速率一致,并且使得我們對先前技術(shù)中關(guān)于EDC穩(wěn)定性的一些敘述的可靠性表示懷疑。EDC可放置于水中相當(dāng)長的時間而明顯沒有活性的顯著喪失的研究結(jié)果,提出這樣的問題,即是否也可使EDC與含有羧基的物質(zhì)結(jié)合,并將混合物儲存至少短的時間期間,之后進行與其它適當(dāng)官能化分子的反應(yīng)。我們認為,制備冷凍干燥的混合物可使得能夠在數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或者甚至數(shù)年后進行結(jié)合反應(yīng)。我們意識到,沒有關(guān)于包含EDC和含有羧基或胺的物質(zhì)的均勻多組分混合物的冷凍干燥和在與其它分子的結(jié)合反應(yīng)中使用這樣的物質(zhì)的報告。最初,我們研究了當(dāng)在寬的pH值范圍,以及還在官能團(例如羧基,羧基被報道加速EDC的分解)存在下,與生物緩沖劑或其它試劑結(jié)合時EDC的穩(wěn)定性。文獻中缺乏關(guān)于EDC與其它分子之間在含水堿性緩沖液中反應(yīng)的信息。在EDC于每一種條件下預(yù)先溫育5分鐘或24小時后,將每一種EDC/緩沖劑混合物加入到BSA在MES緩沖液中于pH 6下的濃溶液中,并測定形成凝膠需要的時間(實施例I)。在該試驗中,通過EDC的快速水解(即與水反應(yīng)),或通過EDC與混合物中另一種組分之間的快速反應(yīng),可引起在短時間的預(yù)先溫育之后的膠凝時間增加。甚至在預(yù)先溫育期沒有損失EDC,混合物中的組分仍可造成干擾BSA試驗的第二(膠凝)期,例如通過特別是在用于膠凝反應(yīng)的PH下進攻EDC,或者通過一些其它方式干擾形成O-酰基異脲基團,或干擾那些基團與其它BSA分子上的賴氨酸殘基的反應(yīng),其對分子間交聯(lián)和膠凝是必要的。不管任何干擾的實際機制,BSA膠凝試驗為EDC介導(dǎo)的生物結(jié)合反應(yīng)的一個實例,并且因此使得能夠確定可能喜歡從打算冷凍干燥并用于EDC介導(dǎo)的生物分子的結(jié)合的混合物中排除的物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn),在預(yù)先溫育期的pH與膠凝時間之間沒有簡單的關(guān)系,也許因為多種因素的作用影響生物結(jié)合試驗的結(jié)果。在預(yù)先溫育24小時之后,EDC/HC1混合物未能弓I起膠凝,符合基于所報道的EDC在酸中不穩(wěn)定性的預(yù)期。奇怪的是,在預(yù)先溫育5分鐘之后,EDC/100 mM HCl混合物始終呈現(xiàn)短的膠凝時間。我們沒有進一步研究該觀察結(jié)果,但是這可通過EDC轉(zhuǎn)化為更具反應(yīng)性的互變異構(gòu)體來解釋。幾種緩沖條件得到確定,其中在預(yù)先溫育24小時之后EDC活性僅受到適度影響。出人意外地,這組條件包括EDC/乙酸鹽在pH 5下的混合物,結(jié)果重復(fù)幾次,盡管先前 報道EDC在O. IM乙酸鈉/0. IM EDC, pH 5的混合物中半衰期僅為兩分鐘(Jacobson andFairman, Anal. Biochem. 106, 114-117 [1980])。不太意外地,不管預(yù)溫育時間,注意到用多元羧酸(例如枸櫞酸鈉,EDTA)的嚴重干擾。多種其它緩沖劑包括磷酸鹽、碳酸鹽和硼酸鹽也引起明顯的干擾。幾種混合物即使在25°C下預(yù)先溫育6天之后,仍然含有足夠的EDC活性,以引起B(yǎng)SA的膠凝。一些有希望的條件使用更直接的EDC活性試驗進行進一步評價,試驗包括將苯胺轉(zhuǎn)化為苯基胍,基本上使用Williams等的方法(Anal. Biochem. 114,173-176 [1981])(實施例2)。該試驗允許要測量的EDC的濃度低于引起B(yǎng)SA膠凝的閾值Γ20 mM),并且允許在不需要活化羧基的情況下測量EDC的穩(wěn)定性(對于水解或?qū)τ谄渌磻?yīng))。一些緩沖液配方在苯胺試驗中得到確定,這些配方在預(yù)先溫育和/或冷凍干燥之后對EDC具有很小的影響。另外,我們確定了其中EDC可與三-或四價羧酸物質(zhì)(EDTA,枸櫞酸鹽)結(jié)合而沒有任何證據(jù)表明EDC的廣泛催化破壞的條件??傮w上講,我們關(guān)于EDC穩(wěn)定性的研究結(jié)果證實了先前技術(shù)的一些陳述,但是與其它的發(fā)生矛盾。我們的數(shù)據(jù)清晰地顯示,EDC比通常認可的穩(wěn)定得多,并且更重要的是能夠在溶液中使EDC與低分子量的多元羧酸物質(zhì)結(jié)合,而沒有明顯損失EDC。因此我們被鼓勵去觀察其它的多價羧酸物質(zhì)(例如微粒)是否能夠在用于與胺化分子的生物結(jié)合反應(yīng)之前與EDC結(jié)合并且冷凍干燥。微粒在生命科學(xué)中被廣泛開發(fā)利用,在診斷化驗中用于檢測流體例如血液或尿液中的分析物(例如橫向流動免疫層析試條試驗和凝集試驗)。熒光微粒和量子點用于流式細胞術(shù),以檢測表達特定抗原的細胞群。磁性顆粒在研究實驗室和診斷裝置具有多種用途。也存在許多其它類型的微粒,這些微粒自各種材料構(gòu)成,每一種類型通常具有多個變體,例如不同大小、顏色、表面官能度等。對于用于生物測定,微粒必須涂覆可與其它生物分子或分析物相互作用的物質(zhì)。這種物質(zhì)通常為抗原或抗體,盡管廣泛范圍的分子可通過非共價或共價手段連接于微粒的表面。在包括固定抗體的大多數(shù)診斷應(yīng)用中,使用被動的非共價方法來涂覆。共價連接更常用于小分子或分析物,并且可獲得具有各種表面官能團(例如羧基、胺、醛)的微粒。羧基化或胺表面可使用碳二亞胺或其它同等功能的活化物質(zhì)與抗體或分析物共價偶聯(lián)。膠乳微粒為疏水性的并且眾所周知容易聚集。為了被動涂覆,使用過量的結(jié)合實體(例如抗體)以致覆蓋整個表面,這減少疏水性表面之間或在顆粒之間起橋梁作用的抗體接觸弓I起聚集的風(fēng)險。在一些情況中,抗體可與另一種蛋白(例如BSA)混合,這提供了控制或調(diào)整呈現(xiàn)于顆粒表面的抗體的量的機制,并助于保持膠體穩(wěn)定性。應(yīng)需要任何離心清洗步驟,以自微粒的混懸液除去過量的試劑,離心步驟趨向于壓緊顆粒并促使聚集。聚集物一旦形成便極其難以破碎,并且可能需要聲波破碎。被動涂覆通常在接近覆層物質(zhì)的isolelectic點的pH下進行。因此對于抗體,尤其是那些單克隆種類,涂覆方法可能必須對每一種抗體試劑進行優(yōu)化。共價偶聯(lián)策略具有一些益處將結(jié)合實體安全連接于微??赡苁沟卯?dāng)進行試驗時具有更大的穩(wěn)定性,更長的保存期限和更少的約束。例如,通常用于在免疫測定中減少非特異性結(jié)合的清潔劑可自微粒剝?nèi)ケ粍游降目贵w,并干擾免疫診斷測定。在羧基顆粒的情況中,抗體上的氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在胺化顆粒的情況中,連接酰胺鍵顛倒,但是在其它方面卻是等同的。如果分析物僅具有羧基用于偶聯(lián),或者如果感興趣的抗體在抗原結(jié)合域含有關(guān)鍵賴氨酸殘基,使用胺涂覆的顆??蔀楹虾跣枰?。然而,還應(yīng)該指出,抗體可聚合,尤其是如果以高濃度存在,并且關(guān)鍵賴氨酸仍可參與與其它抗體分子的聚合反應(yīng)?!?br>
盡管共價結(jié)合具有許多優(yōu)勢,用于實施這樣反應(yīng)的程序冗長并且仍然保持具有聚集的風(fēng)險。微粒也被報道在冷凍時聚集(例如Polysciences技術(shù)數(shù)據(jù)表238; rev #010,活性2009年2月18日),在開發(fā)EDC與微粒的冷凍干燥混合物方面提出了另外的挑戰(zhàn)。為了用于本發(fā)明,主要地因為羧基化微粒在EDC存在下或在離心之后聚集的趨勢,我們采用了具有保護性葡聚糖涂覆層的微粒。葡聚糖已被其他人用于涂覆微粒,以得到更具親水性的表面。葡聚糖被化學(xué)修飾引入官能團,以使得能夠共價連接于核心微粒,并提供能夠參與與其它分子的結(jié)合反應(yīng)的表面官能團。官能團可被設(shè)計成為葡聚糖以適合于感興趣的具體微粒的化學(xué)。例如,羧基甲基(CM)可使用本領(lǐng)域熟知的方法,采用溴乙酸或氯乙酸引入到葡聚糖中。這類葡聚糖的衍生物可以碳二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)共價連接于胺化的微粒中。CM-葡聚糖衍生物可與過量的低分子量二胺例如乙二胺進一步反應(yīng),產(chǎn)生胺化的葡聚糖(AM-葡聚糖)分子,后者然后可連接于羧基化的微粒。通過變化用于初始羧基化反應(yīng)的鹵代乙酸的量和/或通過控制隨后胺化反應(yīng)的效率,可控制在葡聚糖分子表面上的羧基或胺基的密度。胺也可在用高碘酸鹽處理之后引入到葡聚糖中,高碘酸鹽裂解順式-二醇,產(chǎn)生醛基。該醛基可進一步與二胺反應(yīng)產(chǎn)生SchifT堿,后者可使用本領(lǐng)域熟知的方法穩(wěn)定。在本發(fā)明中,胺化的葡聚糖使用碳二亞胺共價連接于羧基化的微粒。在一個優(yōu)選的實施方案中,葡聚糖覆層上的胺然后與琥珀酸酐反應(yīng),得到羧基化表面。如果有效涂覆微粒需要的葡聚糖胺的數(shù)目大于用于隨后與其它分子的結(jié)合反應(yīng)需要或希望的數(shù)目,可得到的胺的數(shù)目可通過在用琥珀酸酐處理之前,與封閉劑的不完全反應(yīng)得到減少。例如橫基-NHS 乙酸鹽(Bioconjugate Techniques. GT Hermanson 1996;ISBN 0-12-342335-x;第127頁)可用于封閉胺。另一方面,如果對于涂覆步驟或?qū)τ陔S后的結(jié)合反應(yīng)不能得到足夠的胺,CM-葡聚糖可不與二胺而是代之以與低分子量三胺或多元胺反應(yīng),得到另外的胺官能度。本發(fā)明的方法不限于任何具體的涂覆方法,并可應(yīng)用于含有或不含葡聚糖涂覆層的微粒。另外微??赏扛惨粚踊蚨鄬悠暇厶?。葡聚糖覆層的主要目的是防止顆粒聚集,并且就這一點而言,具有高平均分子大小的葡聚糖為優(yōu)選,因為大的分子大小通常似乎更有效地保持膠體穩(wěn)定性。 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中,EDC或其它羧基活性物質(zhì)與膠乳顆粒結(jié)合,膠乳顆粒優(yōu)選地涂覆有保護性聚合物例如葡聚糖。這種保護層攜帶有多個胺基或羧基,并且微??膳cEDC或另一種合適的碳二亞胺在具有其它添加劑的合適的緩沖液中結(jié)合,并將生成的 均勻混合物分配至小瓶中并冷凍,之后冷凍干燥并隨后應(yīng)用于結(jié)合反應(yīng)。用這種方式產(chǎn)生的小瓶可以便利的一步法結(jié)合試劑盒的形式組裝,其中簡單地通過用生物分子的溶液重新構(gòu)成冷凍干燥的混合物啟動感興趣的生物分子與微粒之間的反應(yīng)。在將這種試劑盒應(yīng)用于生物結(jié)合反應(yīng)中,人們需要仔細考慮碳二亞胺在冷凍干燥的混合物中的量,兩者按絕對值計算并且考慮混合物中的其它實體物質(zhì),以及考慮可在后來引入的其它實體物質(zhì)(例如以溶液形式加入的親核試劑)。人們還必須考慮要引入的液體體積是否大于或小于含有EDC溶液的初始體積(即冷凍干燥之前),以預(yù)測每一種組分在最終反應(yīng)混合物中的濃度。人們也必須考慮在用于溶解冷凍干燥的混合物的實體物質(zhì)中存在組分的可能性,存在的組分可改變EDC或其它羧基活性物質(zhì)介導(dǎo)的反應(yīng)的效率或速率。例如,許多實驗室實施結(jié)合反應(yīng)以將抗體連接于羧基表面,或連接于其它含有羧基的生物分子,并且市售可得到的抗體通常含有據(jù)報道干擾碳二亞胺作用的物質(zhì)(例如tris,磷酸鹽緩沖液)。這些潛在的困難可以幾種方法中的一種解決。首先,抗體可除去鹽分或透析,以提供更有利的緩沖液配方。這樣的處理通常采用約O. I ml或以上的體積。對于大得多的體積,可使用其它技術(shù)例如交叉流過濾。有可能使用顆粒凈化材料去除一些不需要的物質(zhì),例如混合床離子交換器已經(jīng)用于自蛋白溶液去除不需要的離子組分。第二,可生產(chǎn)一系列冷凍干燥的組合物,以適應(yīng)可在結(jié)合反應(yīng)中遭遇的抗體(或其它實體物質(zhì))的各種制劑。例如,具有優(yōu)選的緩沖液配方的抗體可需要相對小量的EDC等以實現(xiàn)結(jié)合。相比之下,用已知加速EDC等分解的物質(zhì)(例如磷酸鹽)配制的抗體可加入到含有更高含量碳二亞胺的冷凍干燥的多元羧酸物質(zhì)(例如膠乳珠粒)中。第三,可生產(chǎn)具有相對高含量EDC等的單一冷凍干燥的制劑。這樣的混合物,即使與具有不利配方的抗體接觸,仍可使反應(yīng)在合理的時間段內(nèi)完成。至于什么時間段是合理的看法可在實驗室操作員之間變化,但是I小時的反應(yīng)時間并非不同尋常。如果然后在優(yōu)選的緩沖液制劑中呈現(xiàn)相同的抗體,反應(yīng)將可能更快,并可在約幾分鐘內(nèi)進行至要求的終點,在此情況下,為了限制因過度暴露于EDC等的潛在的損害,可使用合適的方法猝滅反應(yīng)。第四,‘pH改性劑’可在與冷凍干燥的混合物接觸之前加入到抗體中,以使最終反應(yīng)pH向上或向下移動,因此改變碳二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)速率。在研究中的特定抗體或生物分子對PH的敏感性將影響其中pH可有效地變化的范圍限制。在這種方法中,理想地,冷凍干燥的混合物的緩沖能力相對低,以便于通過僅加入適量的改性劑調(diào)節(jié)pH。如果用相對低容量的緩沖系統(tǒng)開始,如后來可要求的那樣,例如作為猝滅程序的部分,也易于實現(xiàn)PH的任何進一步的變化。也可開發(fā)利用改性劑以優(yōu)化不同pKa的胺的反應(yīng)程度。在冷凍干燥的混合物包含碳二亞胺和多元羧酸物質(zhì)的情況中,與胺的兩步和一步反應(yīng)都是可能的,正如同傳統(tǒng)的EDC結(jié)合方法使用新鮮制備的溶液。例如,在兩步法中,冷凍干燥的混合物的pH起初可通過加入低PH緩沖液來減少,以利于形成ο-酰基異脲。在合適的時間段后,引入胺化分子或與較高PH的緩沖液一起引入,以使反應(yīng)物pH向上移動,因此增大更高活性的未質(zhì)子化狀態(tài)的胺的比例,因此促進酰胺鍵形成。 對于許多胺,尤其是具有多個胺官能團(主要來自賴氨酸側(cè)鏈),具有一定范圍的PKa值的生物分子(例如蛋白),由于其中每一個賴氨酰殘基所在的微環(huán)境的影響,最簡單的方法是一步法反應(yīng),其中冷凍干燥的羧酸物質(zhì)/EDC混合物用含有胺的生物分子的緩沖溶液重新構(gòu)成。N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)也可任選地在冷凍干燥之前或與用于溶解冷凍干燥的混合物的溶液一起加入到反應(yīng)混合物中。如果效率太低,NHS可為有用的。同樣地,人們也可設(shè)想一種情況,其中可有意引入引起干擾的物質(zhì)例如磷酸鹽,以使太快的反應(yīng)減速。通過改變反應(yīng)物的濃度,也可變化反應(yīng)速率或效率。例如,冷凍干燥的混合物用兩種體積,‘X’和‘5X’提供的固定量的抗體重新構(gòu)成將導(dǎo)致微粒、EDC等、抗體以及任何其它成分的濃度相差5倍。在反應(yīng)物體積為‘X’的情況下,反應(yīng)速率可能比體積為‘5x’的快得多。因此,如果計劃以相對小的體積溶解,可能或者希望在冷凍干燥的混合物中使用較少的EDC 等。從以上討論顯而易見的是,甚至對于固定組成的冷凍干燥的混合物,存在非常簡單的策略用于改變結(jié)合反應(yīng)的效率。從以上討論也顯而易見的是,本發(fā)明的方法使得能夠簡單地通過以不同比例混合各種組分的溶液,快速和容易地制備幾乎無限數(shù)量的冷凍干燥的制劑。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,所述組分的最終混合物的pH在冷凍干燥之前在pH1-14的范圍內(nèi)。用于穩(wěn)定EDC 的優(yōu)選緩沖劑為 MES,pH 6. O ;HEPES, pH 7. 5 ;M0PS, pH 7. 5 ;EPPS, pH 8. 5 ;EPPS, pH 9. 0 ;CHES, pH 9. 2。WRK在所有檢驗的緩沖液中得到穩(wěn)定MES緩沖液在pH 5、pH 6和EPPS pH 8. 5。然而對于結(jié)合反應(yīng),WRK在pH 5下顯示最高效率。優(yōu)選地,緩沖溶液的pH在用于保持pH的任何緩沖物質(zhì)的pKa的5 pH單位內(nèi),更優(yōu)選地在2. O pH單位內(nèi),甚至更優(yōu)選地在I pH單位內(nèi)。在冷凍干燥方法中,通常認為緩沖液和鹽的濃度應(yīng)盡可能低,并且值得注意的是EDC在水中最穩(wěn)定(實施例I)。
在混合物中簡單存在任何緩沖劑,以實現(xiàn)在制備和冷凍干燥多組分混合物期間有效控制PH,其中所述組分可具有在溶液中或在冷凍干燥方法本身期間將pH改變至不太希望的趨勢,即其中發(fā)生不需要的反應(yīng)。優(yōu)選地,被采用的任何緩沖物質(zhì)以相對低濃度存在,優(yōu)選地為IM或者更少,更優(yōu)選地為100 mM或者更少,甚至更優(yōu)選地為10 mM或者更少。顯而易見的是可以在本發(fā)明中,在稍微不同于以上提及的pH值下使用相同的緩沖劑,或者使用其它基本上具有相同緩沖功能的其它緩沖物質(zhì)。在本發(fā)明便利的是使用10x、50x或IOOx緩沖液濃度向要冷凍干燥的混合物中加入緩沖液。人們應(yīng)意識到,稀釋濃儲備液可導(dǎo)致PH的顯著變化。因此如果有必要實現(xiàn)特定的最終PH,人們應(yīng)考慮自稀釋效果預(yù)計的任何變化因素,以及混合物中其它組分的影響。微粒與羧基活性物質(zhì)的混合物任選地含有多羥基物質(zhì)。 這種羥基物質(zhì)優(yōu)選地為糖,其許多實例為本領(lǐng)域已知的。許多糖已經(jīng)用作冷凍干燥方法的穩(wěn)定劑。在一個特別優(yōu)選的實施方案中,糖為海藻糖。盡管蛋白例如抗體含有大量的胺和羧基官能團兩者,EDC廣泛用于將這類分子連接于顆?;蚱渌砻?。在這樣的情況下明顯存在自身聚合的風(fēng)險,這可改變和/或損害抗體的生物活性,所述風(fēng)險隨著抗體或EDC的濃度增大而增大??蓾撛诘赜糜谔岣呓Y(jié)合效率的一個策略為使用較低濃度的抗體,并在加入碳二亞胺之前使抗體移至與目標分子(例如顆粒、表面)接近。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,用于葡聚糖涂覆的顆粒和實體物質(zhì)之間結(jié)合反應(yīng)的緩沖劑的離子強度相對低,以促進要結(jié)合的分子的初始非共價靜電相互作用??贵w上的質(zhì)子化的胺與微粒上的羧基接近允許以相對低濃度的EDC進行有效反應(yīng)。使用低濃度的EDC也減少終止反應(yīng)需要的猝滅劑的量。當(dāng)不能容易采用低離子強度的溶液時,通過使用更多的羧基活性物質(zhì)例如EDC或在7-4范圍內(nèi)的較低的pH (潛在增大EDC的反應(yīng)活性),并增大抗體上的正電荷,這可便于與荷負電的表面非共價相互作用,可提高反應(yīng)效率。在結(jié)合反應(yīng)之后使用本領(lǐng)域熟知的方法,改變由于打算的應(yīng)用需要的緩沖液配方,并除去過量的反應(yīng)物或副產(chǎn)物,可進一步處理微粒。取決于微粒的性質(zhì)和粒度,并取決于要除去的分子大小,可采用方法例如脫鹽、滲析或離心/洗滌。如果僅有小分子打算除去,脫鹽是符合要求的。滲析可應(yīng)用于更大范圍的分子大小,選擇具有適當(dāng)分子量截留的滲析膜。結(jié)合反應(yīng)本身和/或用于自顆粒洗掉過量的反應(yīng)物的緩沖液可含有清潔劑,以消除非特異性或其它不需要的相互結(jié)合作用,例如去除與微粒非共價締合的抗體,或者減少所結(jié)合的微粒與用于橫向流動裝置的材料的相互作用。清潔劑便利地可在干燥例如冷凍干燥顆粒之前與羧基活性物質(zhì)一起引入,或者與用于溶解冷凍干燥的混合物的抗體一起引入,或者在結(jié)合反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束或者已經(jīng)通過加入猝滅劑終止之后引入。與抗體一起或在結(jié)合之后引入清潔劑提供最大的靈活性,因為這使得反應(yīng)混合物或最終結(jié)合物的組成能夠變化以適合于每一種實驗?zāi)康摹.?dāng)未涂覆的顆粒與羧基活性物質(zhì)結(jié)合時,所采用的條件優(yōu)選地不允許與物質(zhì)反應(yīng),因為這可促使顆粒在冷凍干燥之前聚集。所采用的條件可在冷凍干燥之后,通過加入在適當(dāng)緩沖的溶液中的親核試劑進行調(diào)整,以提供用于活化物質(zhì)介導(dǎo)的反應(yīng)的合適條件。本發(fā)明的方法也可用于金顆粒,金顆粒在光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、免疫印跡和橫向流動方面具有應(yīng)用。一定范圍大小的金顆粒為市售可得到的,最常見的球形顆粒用于生物應(yīng)用。對每一種應(yīng)用最佳的直徑可以變化。與膠乳微粒一樣,金顆粒易于聚集,并且用于附著抗體的方法費力,通常需要對一定范圍的蛋白濃度和pH值進行廣泛試驗,以實現(xiàn)穩(wěn)定的結(jié)合。結(jié)合的機理不完全理解,但是如果PH被調(diào)整到稍微高于要涂覆的蛋白的pi的數(shù)值,成功的結(jié)果更有可能。金也可與蛋白中的硫原子(發(fā)現(xiàn)于半胱氨酸和蛋氨酸殘基中)通過配位鍵相互作用。在本發(fā)明中,金顆粒優(yōu)選地涂覆具有氨基和硫醇官能團兩者的葡聚糖,其提供涂覆層物質(zhì)的多點附著。所涂敷的顆粒然后用琥珀酸酐處理,得到羧基化的表面用于隨后的結(jié)合反應(yīng)。硫醇化的葡聚糖可使用本領(lǐng)域熟知的幾種方法之一進行制備。在一個優(yōu)選的實施 方案中,CM葡聚糖在EDC的存在下,與兩種二胺即乙二胺和胱胺的混合物反應(yīng)。改性的葡聚糖然后用DTT還原并脫鹽,以除去過量的還原劑。在葡聚糖表面胺硫醇的比例可通過改變兩種二胺的比例進行調(diào)整。優(yōu)選地,乙二胺胱胺的摩爾比為80:20。這并不一定導(dǎo)致胺硫醇官能團的比例相同,通常這些官能團的比例為約90:10。通過采用本領(lǐng)域熟知的方法轉(zhuǎn)化胺官能團的比例,硫醇基團也可被引入到胺化的分子中,例如氨基-葡聚糖。將硫醇化的葡聚糖與金顆粒一起溫育,以使涂覆層能夠通過與硫醇基團形成配價鍵附著。也可存在其它相互作用的模式,但是這些相互作用的詳細知識不一定適用本發(fā)明的方法。發(fā)現(xiàn)對于相對大分子量的葡聚糖膠體穩(wěn)定性最大。對于40 kDa大小或以下的胺化葡聚糖聚集明顯。在優(yōu)選的實施方案中,約150 kDa-500 kDa的硫醇化葡聚糖對于40 nm金顆粒的涂覆層為優(yōu)選的。在涂覆之后,金顆粒優(yōu)選地用過量的琥珀酸酐處理,以得到具有高膠體穩(wěn)定性的涂覆顆粒,這些顆??膳cEDC接觸并使用本發(fā)明的方法冷凍干燥。在優(yōu)選的實施方案中,在MOPS緩沖液pH 7. 2中的涂覆的金顆粒在冷凍干燥之前與海藻糖和EDC混合。量子點(Q點)也可使用本發(fā)明的方法與其它分子結(jié)合。Q點為明亮的熒光無機半導(dǎo)體納米微粒,其對于細胞和組織成像具有多種超過有機染料和熒光蛋白的優(yōu)點。Q點的核心一般由硒化鎘(CdSe)制成,用硒化鋅涂覆,以減少光化學(xué)漂白和增加量子產(chǎn)率。通常Q點的發(fā)射特性取決于顆粒大小,因此Q點可通過在制造過程期間仔細控制大小調(diào)整到光譜的特定部分,但是對于其它類型的Q點可通過改變組成同時保持固定大小來變化熒光性能。Q點通常非常疏水,但是它們可通過例如用兩親聚合物包封而被制備為適合于生物應(yīng)用。與其它類型的顆粒一樣,具有多種官能團的Q點可得自商業(yè)來源。我們發(fā)現(xiàn)Q點甚至對于兩親聚合物表面有聚集的趨勢,并且在本發(fā)明中,羧基化的Q點優(yōu)選地用胺化葡聚糖涂覆以提高膠體穩(wěn)定性。主要地對于相對大的尺寸,優(yōu)選地大于40 kDa,優(yōu)選地為150 kDa或者更大的葡聚糖可見這種穩(wěn)定作用。在特別優(yōu)選的實施方案中,EDC-介導(dǎo)的涂覆反應(yīng)用在MOPS緩沖液,pH 7. 2中的150 kDa AM-Dextran 實施。
在琥珀?;?,在合適緩沖液中的具有覆層的Q點與海藻糖和EDC混合并冷凍干燥。除了其在使分子偶聯(lián)于微粒中的用途以外,碳二亞胺也用于制備免疫原。例如,EDC可用于介導(dǎo)含有胺-或羧基-的分析物與‘載體蛋白’例如KLH (匙孔血藍蛋白)或BSA (牛血清白蛋白)的交聯(lián)。載體蛋白通常具有羧基和胺官能團兩者,它們可在羧基活性物質(zhì)的存在下導(dǎo)致均聚合,盡管聚合不一定有害,并且如果結(jié)合用于在宿主動物中引起形成抗體的目的甚至可為有益的。然而,必須存在足夠的分析物與載體蛋白的結(jié)合,以使載體用其表面上的分析物分子修飾。陽離子化的載體蛋白通常支持產(chǎn)生免疫原,因為這樣引起更強的免疫反應(yīng)。在這種情況下,在冷凍干燥期間均聚合的可能性減小,但是分析物必須含有羧基官能團。胺與羧基活性物質(zhì)例如EDC直接反應(yīng)產(chǎn)生胍在這種情況下可為不需要的副反應(yīng)。BSA用乙二胺陽離子化并在堿性緩沖液中的EDC存在或不存在下冷凍干燥。這種冷凍干燥的物料與羧基熒光素反應(yīng),以觀察羧基官能團是否能與胺化的BSA在冷凍干燥周期之前和期間,在陽離子化的BSA暴露于EDC之后反應(yīng)。觀察到在存在但是不缺乏EDC下顯著反應(yīng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,載體蛋白被陽離子化并在略微堿性緩沖液中的EDC存在下冷凍干燥。本發(fā)明的方法也可用于低分子量分子,這種分子可與羧基活性物質(zhì)接觸并干燥。隨后用含有適當(dāng)官能化的分子的混合物溶解可用于引發(fā)結(jié)合反應(yīng)。例如,羧基熒光素可與糖和EDC在堿性pH下接觸并冷凍干燥。所述物料可用胺化分子在合適的pH下重新構(gòu)成。類似的方法可使用帶有胺或酰肼基團的小分子,這種小分子在冷凍干燥之后可結(jié)合于羧酸物質(zhì)。為了確定使含有胺和羧基官能團兩者的物質(zhì)(例如蛋白)的自聚合最小化的條件,人們可使用SDS-PAGE分析以檢測二聚物、三聚物和高級聚合物的存在。用這種初始篩選鑒別的緩沖液亞集,然后可在冷凍干燥條件下進行檢查。在本發(fā)明中,使用在各種緩沖液中的EDC和未修飾的BSA,我們發(fā)現(xiàn)對以下緩沖液存在最小反應(yīng)EPPS pH 8.5; CHES pH 9.3。在具有較低pH值的HEPES和MOPS下可檢測到聚合,并且在pH 5或pH 6的MES緩沖液中發(fā)生廣泛交聯(lián)。因此在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,含有羧基和胺基兩者的蛋白分子可接觸并與在〉pH 7和優(yōu)選地〉pH 8的緩沖液中的EDC —起冷凍干燥。隨后可在酸性緩沖液中與含有胺-或羧基-的小分子進行反應(yīng)。優(yōu)選地小分子為過量發(fā),以防止或使蛋白的自聚合達到最小。不管所研究的特異性EDC介導(dǎo)的反應(yīng),在任何生物結(jié)合實驗中,必須建立終止反應(yīng)的方法??捎糜诮K止本發(fā)明反應(yīng)的方法與用于其它EDC結(jié)合程序的那些方法相同。按照本發(fā)明方法進行的反應(yīng)可通過稀釋反應(yīng)混合物,或者加入能夠使EDC失活或以其它方式干擾結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì),或者通過這些方法的組合進行猝滅。過量的EDC和副產(chǎn)物的物理分離可通過脫鹽快速和容易地實現(xiàn),尤其是如果結(jié)合反應(yīng)的產(chǎn)物為直徑大于脫鹽色譜基質(zhì)的孔隙的大分子時。干擾碳二亞胺反應(yīng)的物質(zhì)也為已知的。例如,硫醇使碳二亞胺失活,并可以與反應(yīng)混合物中的生物分子適配的濃度使用。在抗體分子或其它具有二硫橋(disulfidebridges)的分子的情況下,需要其完整性以保持正確的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能,則非常高濃度的硫醇可為禁忌的。已知羧基加速碳二亞胺通過O-?;愲逯虚g體水解分解,并且如果過量存在,對于有限量的碳二亞胺,可在結(jié)合反應(yīng)中與任何生物分子上的羧基競爭。對于這種方法,人們應(yīng)該考慮自猝滅劑產(chǎn)生的O-?;愲逖苌镆部膳c連接于結(jié)合混合物中的生物分子的胺反應(yīng)的可能性。用這種方式將胺封端(Capping)在所有情況下可為不合適的。 同樣,足夠高濃度的胺可用于進攻EDC,但是必須考慮將猝滅劑分子再次連接于在結(jié)合中產(chǎn)生的O-?;愲宀糠值目赡苄?。羥胺也已被報道干擾EDC介導(dǎo)的反應(yīng),并且也可用作猝滅劑。雖然在磷酸鹽緩沖液中的反應(yīng)經(jīng)常推薦使用EDC,有壓倒性的證據(jù)顯示,磷酸鹽減少反應(yīng)效率。在結(jié)合反應(yīng)結(jié)束時加入磷酸鹽緩沖液可為希望的,尤其是如果其它類型的猝滅劑為禁忌時。無論使用什么類型的猝滅劑,最希望的濃度應(yīng)通過考慮EDC的初始濃度、允許用于猝滅步驟的時間、結(jié)合打算的應(yīng)用和結(jié)合反應(yīng)中涉及的分子類型進行確定。對于其中過量的EDC不與結(jié)合物物理分離的一步法,直接使EDC失活為選擇的方法。在特別優(yōu)選的實施方案中,巰基乙醇為猝滅劑,并且以PH >7,優(yōu)選地為約pH 8的緩沖液引入。緩沖液可為例如TBS或PBS。最后,本發(fā)明的方法已經(jīng)用于不同類型的帶有覆層的微粒,包括膠乳微粒、金微粒和Q點。生物分子和小的有機分子也已與EDC—起被冷凍干燥并用于結(jié)合反應(yīng)。這些方法也可應(yīng)用于另一種羧基活化劑,WRK。涂覆每一種類型的顆粒需要的葡聚糖的最小尺寸可以變化,但是從本文描述的方法顯而易見的是,葡聚糖的大小范圍應(yīng)對于任何新型顆粒作為第一步進行評價。也顯而易見的是,可對冷凍干燥的混合物的組成進行多種變化,而不背離本發(fā)明的精神和范圍,這將在以下進行更充分的舉例說明。本發(fā)明將通過以下實施例中的說明,并參照附圖
進行更充分的描述,其中
圖I顯示在多種緩沖液條件下將EDC預(yù)先溫育5分鐘(A)或24小時(B)后,如在生物結(jié)合測定(BSA凝膠化)中測定的EDC的穩(wěn)定性(實施例I);
圖2顯示在用各種緩沖液溫育之后,如通過與苯胺反應(yīng)測量的EDC的穩(wěn)定性。Fd意指樣品在于試驗中測試之前被冷凍干燥。(_)意指樣品沒有冷凍干燥。(b)空白試驗(平均5個樣品)(實施例2);
圖3顯示在各種羧基化分子存在下,在MES緩沖液pH 6或EPPS緩沖液(pH 8. 5)中溫育之后,如通過與苯胺反應(yīng)測量的EDC的穩(wěn)定性。Ac,乙酸鈉;Cit,枸櫞酸三鈉;Ed,EDTA。b,空白試驗(實施例2);
圖4顯示一種典型的橫向流動試驗,其中在EDC下的存在(A)或不存在(B)下,將琥珀酰化葡聚糖涂覆的微粒冷凍干燥,并在帶有兔IgG斑點的試紙條上進行測試之前與山羊抗兔IgG反應(yīng)(實施例8);
圖5顯示使有兔IgG斑點的橫向流動試紙條與山羊抗兔IgG Q點結(jié)合物一起運行的熒光讀數(shù)。結(jié)合物通過向冷凍干燥的琥珀酰化葡聚糖涂覆的Q點/EDC混合物中加入山羊抗兔IgG的溶液來制備(實施例10);
圖6顯示橫向流動測試,其中在帶有兔IgG斑點的試紙條上進行測試之前,琥珀?;暇厶峭扛驳奈⒘Ec不同濃度的伍德沃德氏(Woodward)試劑K和山羊抗兔IgG反應(yīng)。A, 100mM WRK; B, 10 mM WRK; C,I mM WRK (實施例 11);和
圖7顯示橫向流動測試,其中在帶有兔IgG斑點的試紙條上進行測試之前,琥珀?;暇厶峭扛驳奈⒘Ec10 mM伍德沃德氏(Woodward)試劑K和山羊抗兔IgG反應(yīng)。A MES緩沖液,pH 6; B, MOPS緩沖液,pH 7.0; MES緩沖液,pH 5 (實施例12).
實施例I. BSA結(jié)合測定
在 0.5MMES (pH 6.0)中以 100 mg/ml 濃度制備BSAt^fEDC (Fluka,產(chǎn)品編碼 03449)在水中的樣品(IM)與各種受試緩沖液或溶液(各100 mM)以1:1比例混合。將EDC/緩沖液混合物在25°C下預(yù)先溫育,在不同時間點抽取100 ul等分試樣并加入到O. 4 ml BSA溶液中,得到最終的EDC濃度(假定在溫育期間不分解)為100 mM。約每10秒鐘將試管倒置,并在每一種情況下測定形成凝膠花費的時間(即倒置時流體不移動的時間點)。在預(yù)先溫育時間為5分鐘和24小時后的結(jié)果分別顯示在圖IA和圖IB中。注釋倒數(shù)值已被繪制,以致最短的膠凝時間相當(dāng)于具有最大高度的棒條。在與EDTA pH 8、乙酸鈉pH 4或枸櫞酸三鈉一起預(yù)先溫育5分鐘后未見凝膠化。在用磷酸鹽緩沖液(堿性pH)、硼酸鹽和碳酸鈉預(yù)先溫育后可見顯著的凝膠化延遲。用HCl預(yù)先溫育5分鐘導(dǎo)致最快速的凝膠化反應(yīng),但是樣品在預(yù)先溫育24小時后未能引起凝膠化。甚至在預(yù)先溫育6天后(數(shù)據(jù)未顯示),6個樣品(水,MOPS, EPPS, Tris, Hepes, NaOH)仍能引起B(yǎng)SA的凝膠化。檢查在膠凝時間與新鮮制備的EDC的濃度之間的關(guān)系(濃度,用于凝膠化的時間[分鐘·秒]):100 mM, 6. 59; 90 mM, 8. 12; 80 mM, 9. 18; 70 mM, 11. 20; 60 mM,13. 21; 50 mM, 16. 12; 40 mM, 22. 47; 30 mM, 50. 14; 20 mM和 10 mM;未凝膠化。因此甚至在預(yù)先溫育6天后,一些EDC混合物顯示分解少于80%。在最好的情況下(水/EDC)觀察到凝膠化時間〈20分鐘,相當(dāng)于分解水平少于60%。實施例2.苯胺測定
苯胺測定基本上如由Williams等(Anal. Biochem. 114,173-176 [1981])描述的那樣,伴隨微小的改進來進行。將含有EDC (100 ul)的樣品加入到100 ul的苯胺鹽酸鹽(IM)中,并在25°C下溫育I分鐘。將混合物的50 ul等分試樣加入到I. 20 ml的2M HCl中,并在230 nm下相對于對照組(不含EDC)讀取吸光度。用選擇的緩沖液(10 mM最終,自以下儲備液制備1M MOPS, pH 7.2; IM Hepes,pH 7. 5; 0. 5M EPPS pH 8. 5; 0. 5M MES, pH 6; 0. 5M CHES pH 9. 3)檢查 EDC (10 mM 最終)的穩(wěn)定性。在溫育3小時時間之后(數(shù)據(jù)未顯示),觀察到很少或者沒有活性喪失。然后檢查用于與EDC冷凍干燥的這些緩沖液的適用性。如在實施例6中描述的那樣冷凍干燥的物質(zhì)用水重新構(gòu)成,并在苯胺測定中進行測試。對于CHES/EDC混合物可見活性顯著喪失,但是其它混合物僅呈現(xiàn)活性的適度喪失(圖2)。在100 mM MES緩沖液(pH 6)和100 mM EPPS (pH 8. 5)中研究一些據(jù)報道催化EDC分解的物質(zhì)(乙酸鹽,枸櫞酸鹽,EDTA)的作用。制備緩沖液/催化劑混合物并在加入EDC之前將pH值調(diào)節(jié)到所指定的數(shù)值。在用乙酸鹽(單羧基)、枸櫞酸鹽(三羧基)或EDTA (四羧基)溫育3小時之后,在MES緩沖液可見一些活性喪失。使用多元羧酸催化劑,活性喪失的幅度要大得多。在EPPS緩沖液中,活性喪失很不明顯(圖3)。實施例3. AM-葡聚糖(AM-Dextran)的制備
通過與IM溴乙酸在2M NaOH中反應(yīng),將葡聚糖(最終濃度100 mg/ml)轉(zhuǎn)化為CM (羧甲基)葡聚糖。在25°C下48小時之后,通過小心加入小等分試樣的濃HCl將溶液中和至pH 7. 5。通過將 I. 5 ml 部分在用 50 mM MES pH 6. O 平衡的 S 印 hadex G25 (PD IO 柱,GEBiosciences)上脫鹽,將CM-葡聚糖與過量的反應(yīng)物和副產(chǎn)物分離。CM-葡聚糖用2 ml體積洗脫,向其中加入乙二胺在O. 5M MES pH 6. O中的400 ul的2M儲備液。從IM儲備液加入EDC,至最終濃度為100 mM,并將混合物于25°C下溫育過夜。另外加入EDC至100 mM濃度,并如以上那樣重復(fù)溫育。AM-葡聚糖混合物用I ml部分在Sephadex G25上脫鹽至50 mM MES pH 6. O中,得到最終濃度為 25 mg/ml。這種方法用于平均大小為500 kDa,150 kDa, 40 kDa 的葡聚糖聚合物(Pharmacosmos 產(chǎn)品編碼 5510 0500 4006, 5510 0150 4006, 5510 0040 4006)。實施例4.膠乳顆粒用AM-葡聚糖涂覆
藍色膠乳微球(270 nm直徑;parking area 61, Seradyn, 產(chǎn)品編碼83100670020350) (I ml)通過稀釋至4 ml的150 kDa AM-葡聚糖(實施例3)中進行涂覆。在25°C下溫育30分鐘之后,加入EDC至最終濃度為100禮,并在25°C下輕輕攪動微粒24小時。實施例5.琥珀酰化微粒的生產(chǎn)
將如在實施例4中所述生產(chǎn)的葡聚糖涂覆的顆粒用得自2M儲備液,pH 7. 5的400 mMIfepes緩沖液補充,并加入琥珀酸酐(1M在DMSO中)至最終濃度為100 mM。輕輕攪拌反應(yīng)混合物,并通過定期加入小等分試樣的5M NaOH保持在pH 6-pH 7之間。一旦pH已經(jīng)穩(wěn)定(通常在約10分鐘后),將混懸液轉(zhuǎn)移至纖維素酯滲析袋中(I百萬Dalton截止值;Spectrum,產(chǎn)品編碼131486),并對25 mM MES (pH 6.0)進行廣泛滲析。每一批的稀釋用橫向流動分析校準,并將原料材料用25 mM MES緩沖液稀釋至合適的工作濃度。實施例6.葡聚糖涂覆的膠乳微粒的冷凍干燥
相同的基本程序被用于如在實施例4和5中所述制備的各種葡聚糖涂覆的膠乳微粒。微粒首先通過脫鹽或滲析到1-10 mM濃度的緩沖液中進行緩沖交換?;蛘?,將緩沖濃縮液(至少O. 5M)加入到懸浮于水中的微粒中,得到需要的最終緩沖液濃度。所使用的緩沖液類型包括EPPS, pH 9,EPPS pH 8. 5,MOPS pH 7. 2,MOPS pH 7,Hepes, pH 7. 0,MES pH6和MES pH 5。將0.8 ml份的緩沖的帶覆層的微粒溶液補充100 ul海藻糖儲備液(I g溶于2 ml水中)和100 ul的EDC儲備液(范圍0-100 mM,取決于要求的最終濃度)。在大多數(shù)情況下,最終濃度為1,5或10mM。將體積如要求的那樣按比例放大或縮小以得到需要量的物料用于冷凍干燥。將微?;旌喜?0 ul或100 ul每份分配,用液氮冷凍,并按照以下程序在Virtis Advantage冷凍干燥器中冷凍干燥步驟I,溫度_40°C,持續(xù)時間1320分鐘;步驟2,溫度-10°C,持續(xù)時間60分鐘;步驟3,溫度+20°C,持續(xù)時間60分鐘。這些管提供足夠的物料以進行I或2次橫向流動測試。按比例放大通過冷凍干燥更大體積或通過使用更濃的微粒來實現(xiàn)(實施例20)。實施例7.橫向流動試紙條的生產(chǎn)和使用
沿著試紙條約三分之一距離用在150 mM NaCl加上5%甲醇中的O. 5 ul純化的兔IgG(2 mg/ml)對硝化纖維素膜(約4 cm X O. 4 cm)點樣(spotted)。使所述試紙條在室溫下干燥至少60分鐘,但是通常為2-24小時,然后用在TBS,pH 8或50 mM磷酸鈉,pH 7. 2中的O. 1% BSA封閉。試紙條用在水中的O. 5%海藻糖洗滌,并空氣干燥。為了測試用山羊抗兔IgG涂覆的微球,將最接近兔IgG斑點位置的試紙條末端浸潰到50 ul微?;鞈乙褐?,將吸水紙墊應(yīng)用至另一個末端。使試紙條滲開直到整個樣品進入硝化纖維素膜。在一些情況中,通過將試紙條轉(zhuǎn)移至50 ul緩沖液中另外4-5分鐘清除背景??筛淖兙彌_液并且特定的緩沖條件在別處給出。實施例8.冷凍干燥的微粒與抗體的反應(yīng)冷凍干燥的微粒用在MES緩沖液(50-200 mM) (pH 6)中含有山羊抗兔IgG (1-50 ug)的溶液重新構(gòu)成,最終體積為50 ul。在溫育合適的時間期間(2. 5分鐘至最多I小時)之后,通過用Iml TBS pH 8. O稀釋來猝滅樣品。樣品以18000xg離心15分鐘。小心棄去上清液,并將丸粒重新懸浮于含有O. 1% Tween 20的50 ul的TBS中。圖4顯示在10 mM EDC存在或不存在下,用10 mM EPPS緩沖液(pH 8.5)冷凍干燥的藍色膠乳270 nm葡聚糖涂覆的琥珀酰化微粒得到的一個典型實例。實施例9. Q點結(jié)合反應(yīng)
Q點(Crystalplex 20 nm,產(chǎn)品編碼NCC-665,羧基化的納米團簇(nanoclusters),發(fā)射最大665 nm; 28 mg/ml)用50 mM MOPS (pH 7. O)稀釋1/10,并將100 ul的混懸液與400 ul的150 kDa AM-葡聚糖(實施例3)在50 mM MOPS (pH 7. O)中合并,且在25°C下,于Spiramix上溫育30分鐘。自2M儲備液加入EDC (26 ul),得到100 mM的最終濃度。在溫育5-16小時之后,向混懸液中加入80 ul在DMSO中的IM琥珀酸酐,連同160 ul的2MHEPES/10 mM EDTA, pH 7. 5 和 40 ul 的 50 mM MOPS pH 7. O0 在 Spiramix 上溫育 30 分鐘后,使樣品在用水平衡的F1DlO柱上脫鹽。琥拍?;募{米團簇以12000 rpm,在microfuge旋轉(zhuǎn)15分鐘,并將丸粒重新懸浮于400 ul水中。實施例10.在EDC存在下冷凍干燥的Q點的反應(yīng)
將如在實施例9中所述制備的Q點混懸液部分(50 ul)與5 ul的海藻糖儲備液(I g+ 2 ml 水)、2· 5 ul 的 200 mM EPPS, pH 8. 5 和 3 ul 的或者 100 mM EDC (最終濃度為 5mM)或者水混合。將樣品冷凍,并使用在實施例6中概述的方案冷凍干燥,然后在_20°C下儲存2天。制備含有山羊抗兔IgG (13 ul的2. 3 mg/ml)、60 ul的O. 5 M MOPS, pH 7. O和77 ul水的混合物,并向冷凍干燥的Q點的每一試管中加入50 ul份(10 Ug抗體)。如在實施例8中描述的那樣進行結(jié)合和洗滌。如在實施例7中描述的那樣進行橫向流動試驗。通過使50 ul緩沖液沿著試紙條滲開清除背景,并切除相當(dāng)于固定化的兔IgG區(qū)域的面積,且讀取50 ul TBS中的黑色96孔板(激發(fā)350 nm/發(fā)射665 nm)。對于用或不用EDC制備的結(jié)合物,熒光讀數(shù)分別為43552和5034,如在圖5中顯示的那樣。實施例11.伍德沃德氏試劑K的濃度的優(yōu)化
將葡聚糖涂覆的微粒(200 ul)(如在實施例4中所述制備)使用NAP-5柱脫鹽至350ul水中。制備在水中的1M、100 mM和10 mM的伍德沃德氏試劑K (WRK)的儲備液。將40ul的微粒與3 ul的I mg/ml山羊抗兔IgG (3 ug) UO ul水和6 ul的WRK儲備液混合,得到100 mM、10 mM和I mM的最終濃度。在25°C下30分鐘后,加入950 ul的TBS,并將樣品用微型離心機旋轉(zhuǎn)15分鐘。將丸粒再次懸浮于60 ul TBS/0. 1% Tween 20中,并用橫向流動試驗測試樣品(實施例7)。通過視覺評價,含有100 mM WRK的樣品在離心之前顯然含有聚集體,并且這一點通過橫向流動試紙條底部的物料積聚得到證實,如在圖6中所示。實施例12.用于與伍德沃德氏試劑K反應(yīng)的緩沖液的優(yōu)化
將在水中的40 ul琥珀?;?70 nm藍色膠乳微粒(如在實施例5中描述的那樣制備)與3 ul的I mg/ml山羊抗兔IgG (3 ug)、6 ul的100 mM WRK (10 mM最終濃度)和10 ul的選自以下清單的緩沖液混合1M MES pH 6. O; IM MOPS pH 7. 0; IM MES pH 5.0。在結(jié)合30分鐘后,用TBS洗滌并離心,將每一種丸粒重新懸浮于60 ul的TBS/0. 1% Tween20中。用橫向流動試驗測試樣品(實施例7)。結(jié)果顯不在圖7中。在pH 5. O下反應(yīng)后可見最大斑點強度。實施例13.用伍德沃德氏試劑K冷凍干燥膠乳微粒
將如在實施例4中描述的那樣制備的200 ul琥珀?;乃{色270 nm葡聚糖涂覆的微粒脫鹽至400 ul的25 mM MES (pH 5)中。將40 ul份的脫鹽微粒與5 ul海藻糖儲備液(I g在2 ml水中)和5 ul的100 mM WRK混合,并用液氮冷凍。按照實施例6的程序進行冷凍干燥。實施例14. EDC用小有機染料冷凍干燥
將羧基熒光素(Sigma C7153)溶于25 mM Epps pH 9. O中,得到具有pH 4. O的10 mM儲備液。將O. 5 ml樣品用O. 5 ml的100 mM EPPS (pH 9. O)稀釋,并加入100 ul的海藻糖儲備液(I g加上2 ml水)。pH測量為7. 71。加入EDC (11 ul的IM儲備液)至最終濃度為10 mM,并將100 ul等分試樣如在實施例6中所述進行冷凍干燥。冷凍干燥的樣品(2個試管;兩者為陽性對照)與100 ul的500 kDa AM-葡聚糖在50 mM MES pH 6. O中反應(yīng)(如在實施例3中所述制備)I小時,之后加入100 ul 14. 3 mM巰基乙醇,并使反應(yīng)繼續(xù)進行另外I小時。與以上反應(yīng)相平行,2個試管(兩者為陰性對照)的干燥的羧基熒光素/EDC混合物各自用100 ul猝滅劑(14.3 mM巰基乙醇)重新構(gòu)成。I小時后,加入在50 mMMES (pH 5. O)中的100 ul的500 kDa AM-葡聚糖,并繼續(xù)溫育另外I小時。將陽性和陰性對照管的內(nèi)容物合并,并通過在分開的NAP-5柱上脫鹽交換至500 ul TBS0對于1/100稀釋的陽性和陰性對照的熒光值(激發(fā)490 nm/發(fā)射535)分別為44129和229 (平均值,n=3)。實施例15. EDC用蛋白分子冷凍干燥
BSA (I ml的10%溶液)通過與9 ml的O. 5 M MES/2M乙二胺(pH 6)加上I ml的EDC(IM)在25°C下反應(yīng)4小時進行陽離子化。將I ml的反應(yīng)混合物在HHO柱上脫鹽至I. 25ml的10 mM EPPS (pH 8. 5)中,向其中加入125 ul的海藻糖儲備液(I g在2 ml水中)。將兩個600 ul等分試樣分配至單獨的管中,一個管(類型A)補充6 ul的IM EDC和另一個管(類型B)補充6 ul水。來自每一種類型的100 ul等分試樣按照實施例6的程序冷凍干燥。使羧基熒光素溶于100 mM MES (pH 6)中,并向每一種類型的管中的一只加入100ul等分試樣。30分鐘后,加入等體積的IOX TBS并將管放置過夜。將樣品在NAP-5柱上脫鹽至TBS中。如在實施例14中那樣對1/100稀釋的類型A和類型B樣品測量熒光值,分別為33200和103熒光單位。實施例16.用BSA涂覆金顆粒
將金顆粒(200 ul的15 OD材料,或者20 nm或者40 nm裸金;Bioassay Works)加入到在水中的I ml的10 mg/ml BSA中。在20°C下溫育過夜后,樣品用管形材料(Spectrum,產(chǎn)品編碼131486)對2種變化的IL水進行滲析(每一個滲析3小時)。滲析的金通過加入100 mM儲備液(pH 9)達到10 mM EPPS。自10 mM儲備液加入EDC至I mM。最后加入海藻糖至3. 33% w/v。樣品用液氮冷凍,并按照實施例6的程序冷凍干燥。實施例17.硫醇/氨基葡聚糖的生產(chǎn)
將CM-葡聚糖(500 kDa) I ml與200 ul的混合二胺溶液和來自IM儲備液的EDC混合(至最終濃度為100 mM),混合的二胺溶液通過以20:80體積比合并胱胺在O. 5 M MES (pH 6.0)中的2M溶液和在O. 5 M MES (pH 6)中的2M乙二胺來制備。在25°C下溫育過夜后,將樣品脫鹽至O. I M磷酸鹽緩沖液(pH 8. O)中,并自200 mM儲備液加入DTT至最終濃度為20 mM。在25°C下溫育I小時后,將樣品脫鹽至100 mM MES緩沖液(pH 6)中,并立即如在實施例18中描述的那樣用于涂覆金顆粒。實施例18.用硫醇化的葡聚糖涂覆金顆粒
金顆粒(15 0D)用如在實施例17中描述的那樣制備的硫醇/氨基葡聚糖稀釋至1/10,并在25°C下溫育過夜。對于每ml顆粒,加入100 ul的2 M H印es,隨后加入琥珀酸酐(自DMSO中的IM儲備液)至最終濃度為100禮。30分鐘后,材料經(jīng)2個周期的離心洗滌,并用20 mM MOPS緩沖液(pH 7. 2)洗滌。向每ml顆粒中加入100 ul的海藻糖儲備液(I g在
2ml水中),隨后加入EDC (來自在水中的IM儲備液)至濃度為10 mM。樣品按照實施例6中描述的的程序進行冷凍干燥。實施例19.自緩沖液濃縮物制備的溶液的pH控制
制備以下緩沖液濃縮物:0.5 M EPPS, 8. 5; IM MOPS pH 7. 2; IM Hepes, pH 7. 5;I M MES pH 6和O. 5 M CHES, pH 9. 3。在水中制備I M EDC。各種緩沖液/EDC混合物通過適當(dāng)稀釋儲備液物質(zhì)進行制備,得到在10 mM緩沖液中的O mM、l mM或10 mM EDC0各種溶液的 pH 值為(緩沖液,O mM EDC 的 pH,I mM EDC 的 pH,10 mM EDC 的 pH) : EPPS, 7. 59,
7.67, 7. 73; MOPS, 6. 18, 6. 25, 6. 34; Hepes, 6. 58, 6. 64, 6. 73; MES, 5. 22, 5. 29,
5.35; CHES, 8. 64, 8. 74, 8.82。從這些數(shù)據(jù)可見,除了 EPPS,具有pKa值在pH 7-8之間的緩沖液(例如MOPS,Hepes)也可制備為在pH 8-8. 5范圍的濃縮物,以實現(xiàn)最終pH值在pH 7-pH 8 之間。實施例20.濃膠乳微粒的制備
將I ml的150 kDa AM-葡聚糖(實施例3)與O. 11 ml的海藻糖(I g在2 ml水中)混合,用液氮冷凍,并使用實施例6中給出的程序冷凍干燥。所述干燥粉末用I ml的儲備液藍色270 nm羧基化膠乳顆粒(Seradyn,產(chǎn)品編碼83100670020350)重新構(gòu)成,并在室溫下溫育24小時,之后加入100 ul的I M EDC0在溫育18小時后,加入200 ul的2M Hepes/10mM EDTA,隨后加入在DMSO中的100 ul的琥珀酸酐(I M)。在25°C下30分鐘后,使物料對3種變化的IL的25 mM MES緩沖液(pH 6. O)進行滲析。然后將I ml滲析的樣品使用PDlO柱緩沖交換至I. 5 ml 10 mM EPPS緩沖液。對于每ml在EPPS緩沖液中的微粒加入100 ul海藻糖,隨后自I M儲備液加入EDC,得到最終濃度為10 mM。使用合適大小的玻璃小瓶,將樣品以不同大小的等分試樣冷凍干燥。例如,將10 ul樣品分配至X-小瓶(Cronus,VZM-0309CF-100);將40 ul 樣品分配至香檳玻璃瓶(Cronus, VZM-1509CC-100) ;0. 4 ml 體積在2 ml血清小瓶(Voigt 7010. 90. 0540)中冷凍干燥,和I ml體積分配至10 ml血清小瓶(Wheaton, 223686)中。實施例21.與冷凍干燥的ADP/EDC混合物結(jié)合
將 500 ul 的 20 mM ADP 一鉀鹽(Fluka 產(chǎn)品編碼 01899)與 200 ul 的 O. 5 M EPPS pH
8.5,100 ul的海藻糖(I g在2 ml水中)、200 ul水和5 ul的或者2 M EDC (最終濃度為
10mM)或者水混合。將100 ul的等分試樣使用實施例6中給出的干燥程序冷凍干燥。兩種類型的干燥粉末(即含有和不含EDC)用100 ul的如在實施例15中描述的那樣制備的(但是脫鹽至水中而不是EPPS緩沖液中)陽離子化BSA和100 ul的O. 5 M MES (pH 6. 2)重新 構(gòu)成。在25°C下反應(yīng)18小時后,通過在用O. 15 M NaCl平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上脫鹽去除游離的ADP。合并含有蛋白的部分(0.3 ml),并通過與75 ul用于無機磷酸鹽的 PiColorlock Gold 比色檢測試劑(Innova Biosciences 產(chǎn)品編碼 303-0030),在 100°C下加熱進行酸水解5分鐘。200 ul用或不用EDC制備的水解的BSA-ADP結(jié)合物樣品的減去吸光度的空白值(A65tl)分別為I. 22和0. 08。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)試劑的方法,所述試劑用于含有羧基或磷酸酯基的第一反應(yīng)物與含有胺基的第二反應(yīng)物之間的結(jié)合反應(yīng),所述方法包括 a)形成以下組分的溶液或混懸液 i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物質(zhì),其能夠作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分,以促使在羧基和胺基之間形成酰胺鍵,或在磷酸酯基和胺基之間形成氨基磷酸酯鍵,和 )第一反應(yīng)物或第二反應(yīng)物;和 b)干燥所述溶液或混懸液。
2.依據(jù)權(quán)利要求I的方法,其中羧基活化或磷酸酯活化的 物質(zhì)和第一或第二反應(yīng)物以溶液,優(yōu)選地以水性溶液的形式混合。
3.依據(jù)權(quán)利要求I的方法,其中羧基活化或磷酸酯活化的物質(zhì)包含碳二亞胺或伍德沃德氏試劑K (WRK)。
4.依據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中羧基活化或磷酸酯活化的物質(zhì)包含EDC或CMC。
5.依據(jù)任何一項前述權(quán)利要求的方法,其中步驟b)包含冷凍干燥。
6.依據(jù)任何一項前述權(quán)利要求的方法,其中所述溶液或混懸液包含含有羧基或磷酸酯基的第一反應(yīng)物。
7.依據(jù)任何一項前述權(quán)利要求的方法,其中溶液或混懸液中的第一或第二反應(yīng)物包含有色的、發(fā)熒光的、酶、磁性或顆粒標記。
8.依據(jù)任何一項前述權(quán)利要求的方法,其中溶液或混懸液中的第一或第二反應(yīng)物包含顆粒。
9.依據(jù)權(quán)利要求8的方法,其中顆粒具有聚合物涂覆層。
10.依據(jù)任何一項前述權(quán)利要求的方法,其中溶液或混懸液包括多羥基材料。
11.依據(jù)任何一項前述權(quán)利要求的方法,其中溶液或混懸液包括緩沖劑。
12.依據(jù)任何一項前述權(quán)利要求的方法,其中溶液或混懸液的pH大于4,優(yōu)選地大于6,大于7或大于8。
13.—種通過任何一項前述權(quán)利要求的方法生產(chǎn)的試劑。
14.一種干燥的試劑,所述干燥的試劑用于含有羧基或磷酸酯基的第一反應(yīng)物與含有胺基的第二反應(yīng)物之間的結(jié)合反應(yīng),所述試劑包含以下組分的均勻混合物i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物質(zhì),這種物質(zhì)能夠作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分,以促使在羧基和胺基之間形成酰胺鍵,或在磷酸酯基和胺基之間形成氨基磷酸酯鍵,和ii)第一反應(yīng)物或第二反應(yīng)物。
15.依據(jù)權(quán)利要求13或14的試劑,所述試劑在容器中。
16.一種結(jié)合試劑盒,所述試劑盒包含提供的依據(jù)權(quán)利要求13、14或15的試劑和使用說明書。
17.一種實施結(jié)合反應(yīng)的方法,所述方法包括使用依據(jù)權(quán)利要求13、14或15中任何一項的試劑,或者使用依據(jù)權(quán)利要求16的結(jié)合試劑盒。
18.—種生產(chǎn)基本上如上所述的試劑的方法。
19.一種用于基本上如上所述的結(jié)合反應(yīng)的試劑。
20.一種實施基本上如上所述的結(jié)合反應(yīng)的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明描述了一些方法,所述方法使碳二亞胺或其它羧基活性物質(zhì)能夠與羧酸或磷酸酯或胺或其組合混合,以致形成均勻混合物,該混合物然后經(jīng)干燥,優(yōu)選地用冷凍干燥方法。這種混合物然后與實體物質(zhì)接觸,優(yōu)選地包括用所述實體物質(zhì)的緩沖溶液溶解混合物,以致在實體物質(zhì)與混合物中的組分之間發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。
文檔編號C07C267/00GK102933547SQ201180022576
公開日2013年2月13日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者N.吉, A.德拉吉 申請人:創(chuàng)新生物科學(xué)有限公司