本發(fā)明涉及snp標(biāo)記及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及與斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記，用于檢測前述snp標(biāo)記的引物對和試劑盒，前述snp標(biāo)記、引物對、試劑盒在斜帶石斑魚選育中的用途，以及檢測斜帶石斑魚生長速度的方法。
背景技術(shù)：
：石斑魚是名貴的海水經(jīng)濟魚類。近十多年來，石斑魚人工繁育技術(shù)已相對成熟，石斑魚的養(yǎng)殖規(guī)模也逐漸擴大，石斑魚產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，對于促進漁民增收，滿足國民水產(chǎn)品需求，優(yōu)化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)結(jié)構(gòu)有重要意義。但是，種質(zhì)退化，優(yōu)良品種缺乏是石斑魚產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的主要瓶頸。因此，培育石斑魚優(yōu)良新品種已成為我國石斑魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的魚類選育方法完全依賴于表型，存在周期長和效率低等無法逾越的障礙。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種，是指利用dna分子標(biāo)記對育種材料進行選擇，綜合改良選育物種的重要經(jīng)濟性狀，是傳統(tǒng)遺傳育種與現(xiàn)代分子生物學(xué)有機結(jié)合的育種方法。分子育種為魚類育種開辟了一條新的途徑，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記在魚類育種中的作用將日益突出。在石斑魚的育種中，人們希望通過對于生長性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的dna標(biāo)記的選擇，以實現(xiàn)早期選種和提高育種準(zhǔn)確性的目標(biāo)，從而取得更大的遺傳進展。然而，現(xiàn)階段能夠有效用于石斑魚育種的生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記仍有待挖掘。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的目的在于提出一種與石斑魚生長性狀相關(guān)，能夠有效用于石斑魚選育的snp標(biāo)記及其應(yīng)用。其中，需要說明的是，snp(singlenucleotidepolymorphism,snp，即單核苷酸多態(tài)性)是1996年由美國麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心學(xué)者lander提出的一類分子遺傳標(biāo)記，主要是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。snp表現(xiàn)出的多態(tài)性僅涉及到單個堿基的變異，表現(xiàn)是有轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的在于提供一種檢測斜帶石斑魚生長速度的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記，所述snp標(biāo)記的序列如seqidno：1所示，如seqidno：1所示序列自5’端起第501位堿基是c或t。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該snp標(biāo)記為seqidno：1所示核苷酸序列(全長1001bp)自5’端起第501位堿基以y表示，y代表c或t。上述snp標(biāo)記的tt基因型個體的生長速度顯著高于cc基因型個體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該位點處基因型為純合tt的斜帶石斑魚的體重顯著高于此處基因型為純合cc的斜帶石斑魚。進而，根據(jù)本發(fā)明的實施例，通過檢測斜帶石斑魚的上述snp，能夠有效地確定其生長速度，具體地，如前所述，該snp位點為純合tt的斜帶石斑魚的體重顯著高于此處基因型為純合cc的斜帶石斑魚，例如該snp位點的基因型為tt時，則能夠確定待測斜帶石斑魚的屬于生長速度快的個體。由此，發(fā)明人確定，本發(fā)明的snp標(biāo)記與斜帶石斑魚的生長速度緊密相關(guān)，能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標(biāo)記輔助育種。進而能夠根據(jù)實際育種需求選擇生長速度對斜帶石斑魚育種材料進行早期選擇，進一步能夠有效提高育種的效率和準(zhǔn)確性，提高斜帶石斑魚繁殖群體的遺傳水平，從而能夠準(zhǔn)確、高效地選育出斜帶石斑魚優(yōu)良品種。此外，根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，利用本發(fā)明的snp標(biāo)記進行斜帶石斑魚分子標(biāo)記輔助育種，具有早期篩選、節(jié)省時間、成本低廉、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。本發(fā)明還提供了一種用于檢測上述snp標(biāo)記的引物對。所述引物對具有seqidno：2-3所示的核苷酸序列。具體地，本發(fā)明的引物對的序列如下所示：上游引物：5’-ctcctctgctgctcagcttt-3’(seqidno：2)；下游引物：5’-ccgtacctccactgatgtga-3’(seqidno：3)。利用本發(fā)明的引物對能夠有效地對待測斜帶石斑魚的上述與生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記所在的片段進行pcr擴增，進而通過測序能夠有效實現(xiàn)對該snp標(biāo)記的檢測，確定待測斜帶石斑魚該snp標(biāo)記位點的基因型，進而能夠有效確定待測斜帶石斑魚的生長速度。具體地，該snp標(biāo)記位點處基因型為純合tt的斜帶石斑魚的生長速度顯著高于此處基因型為純合cc的斜帶石斑魚，例如該snp位點的基因型為tt或ct時，則能夠確定待測斜帶石斑魚屬于生長速度快的個體。由此，用于檢測上述snp標(biāo)記的引物對，能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標(biāo)記輔助育種，進而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育斜帶石斑魚優(yōu)良品種。本發(fā)明還提供了一種用于檢測上述snp標(biāo)記的試劑盒。該試劑盒中包含有如seqidno：2-3所示的核苷酸序列的引物對。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用本發(fā)明的試劑盒中所包含的引物對，能夠有效實現(xiàn)對待測斜帶石斑魚的上述與生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記的多態(tài)性檢測，確定待測斜帶石斑魚該snp標(biāo)記位點的基因型，進而能夠有效確定待測斜帶石斑魚的生長速度。具體地，該snp標(biāo)記位點處基因型為純合tt的斜帶石斑魚的生長速度顯著高于此處基因型為純合cc的斜帶石斑魚，例如該snp位點的基因型為tt時，則能夠確定待測斜帶石斑魚屬于生長速度快的個體。由此，本發(fā)明的用于檢測上述snp標(biāo)記的試劑盒，能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標(biāo)記輔助育種，進而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育斜帶石斑魚優(yōu)良品種。本發(fā)明還提供了上述snp標(biāo)記、引物對或試劑盒在斜帶石斑魚選育中的用途。如前所述，通過能夠用于檢測本發(fā)明的與斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記的試劑，例如前述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，能夠有效地檢測確定待測斜帶石斑魚的上述snp標(biāo)記的基因型，進而基于獲得的基因型能夠有效確定待測斜帶石斑魚的生長速度，從而能夠有效輔助斜帶石斑魚選育。本發(fā)明還提供了一種檢測斜帶石斑魚生長速度的方法。該方法通過對待測斜帶石斑魚進行上述snp標(biāo)記的檢測，確定所述待測斜帶石斑魚的生長速度。具體地，可以通過能夠用于檢測本發(fā)明的與斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記的試劑例如前述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，對待測斜帶石斑魚進行pcr擴增、測序，以便檢測確定待測斜帶石斑魚的上述snp標(biāo)記的基因型，進而基于獲得的基因型能夠有效確定待測斜帶石斑魚的生長速度。其中，如前所述，該snp標(biāo)記位點處基因型為純合tt的斜帶石斑魚的生長速度顯著高于此處基因型為純合cc的斜帶石斑魚，例如當(dāng)該snp位點的基因型為tt時，則待測斜帶石斑魚的屬于生長速度快的個體。由此，本發(fā)明的檢測斜帶石斑魚生長速度的方法，能夠快速、高效、準(zhǔn)確地檢測斜帶石斑魚生長速度，進而能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標(biāo)記輔助育種，從而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育斜帶石斑魚優(yōu)良品種。另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的檢測斜帶石斑魚生長速度的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征：根據(jù)本發(fā)明的實施例，對待測斜帶石斑魚進行snp標(biāo)記檢測的方法不受特別限制。測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcrsinglestrandconformationpolymorphism，pcr-sscp)、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr-restritcionfragmentlengthpolymorphism，pcr-rflp)及飛行時間質(zhì)譜等技術(shù)均可以實現(xiàn)snp的檢測。其中，測序是一種準(zhǔn)確性最高、靈活性強，通量大、檢測周期短的檢測技術(shù)。只需在snp位點的兩側(cè)設(shè)計一對引物，擴增200-1000bp的產(chǎn)物，再通過測序即可直接檢測snp位點的基因型。因而，本發(fā)明采用測序的方法進行snp標(biāo)記檢測。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，通過對待測斜帶石斑魚進行前面所述的snp標(biāo)記的檢測，確定所述待測斜帶石斑魚的生長速度，進一步包括以下步驟：提取待測斜帶石斑魚的基因組dna；利用前面所述的引物對，將所述待測斜帶石斑魚的基因組dna進行pcr擴增，以便獲得pcr擴增產(chǎn)物；對所述pcr擴增產(chǎn)物進行測序，以便獲得測序結(jié)果；基于所述測序結(jié)果，確定所述待測斜帶石斑魚的所述snp標(biāo)記的基因型；以及基于所述待測斜帶石斑魚的所述snp標(biāo)記的基因型，確定所述待測斜帶石斑魚的生長速度。由此，能夠有效提高檢測斜帶石斑魚生長速度的效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，提取待測斜帶石斑魚的基因組dna的方法不受特別限制，可以采用任何已知的基因組dna提取方法或試劑盒進行。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，采用常規(guī)酚氯仿方法抽提待測斜帶石斑魚的基因組dna。由此，能夠有效獲得質(zhì)量好、純度高的基因組dna，便于后續(xù)步驟進行。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述待測斜帶石斑魚的基因組dna進行pcr擴增的條件不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該pcr擴增的擴增體系以25μl計為：50-100ng/μl的模板dna1μl，10pmol/μl的seqidno：2-3所示的上下游引物各1μl，10mmol/l的dntpmix2.0μl，5u/μl的taqdna聚合酶0.125μl，10×pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，余量為雙蒸水；該pcr擴增的反應(yīng)條件為：94℃5分鐘；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30個循環(huán)；72℃5分鐘。由此，能夠快速、高效、準(zhǔn)確地擴增本發(fā)明的snp標(biāo)記所在的片段，獲得目標(biāo)擴增產(chǎn)物，便于后續(xù)步驟的進行。根據(jù)本發(fā)明的實施例，對所述pcr擴增產(chǎn)物進行測序的方法不受特別限制，只要能夠有效獲得pcr擴增產(chǎn)物即snp標(biāo)記所在的片段的序列即可。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以采用選自hiseq2000、solid、454和單分子測序方法的至少一種對所述pcr擴增產(chǎn)物進行測序。由此，能夠高通量、快速、高效、準(zhǔn)確地獲得測序結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的實施例，基于測序結(jié)果，通過比對石斑魚參考基因組序列，能夠有效確定待測斜帶石斑魚的所述snp標(biāo)記的基因型為tt還是cc。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述snp標(biāo)記的tt基因型個體的生長速度顯著高于cc基因型個體。即本發(fā)明前面所述的snp標(biāo)記與斜帶石斑魚的生長速度緊密相關(guān)。由此，基于確定的待測斜帶石斑魚的該snp標(biāo)記的基因型，能夠準(zhǔn)確有效地確定待測斜帶石斑魚的生長速度即生長速度性狀，例如該snp位點的基因型為tt時，則待測斜帶石斑魚的屬于生長速度快的個體。進而本發(fā)明的方法能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標(biāo)記輔助育種，從而能夠輔助早期實現(xiàn)短時間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育斜帶石斑魚優(yōu)良品種。需要說明的是，本發(fā)明的與斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用具有如下優(yōu)點：(1)本發(fā)明提供的snp標(biāo)記不受斜帶石斑魚的年齡、性別等限制，可用于斜帶石斑魚的早期選育，可顯著促進斜帶石斑魚的育種進程；(2)檢測斜帶石斑魚如seqidno.1所示自5’端起第501位snp位點的方法，準(zhǔn)確可靠，操作方便；(3)斜帶石斑魚如seqidno.1所示自5’端起第501位的snp位點的檢出，為斜帶石斑魚生長性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。具體實施方式除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1與斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記的獲得1.1斜帶石斑魚群體的獲得所采用的群體為海南某石斑魚養(yǎng)殖場2010年11月10日孵化的斜帶石斑魚，親本為29條野生雄魚和12條野生雌魚(捕獲于海南三亞的南海海域)，2010年12月10日，15,000尾魚苗被轉(zhuǎn)移至一個網(wǎng)箱繼續(xù)飼養(yǎng)。2011年8月8日，從該網(wǎng)箱隨機選出198個個體，剪取魚體背鰭鰭條于95％乙醇-20℃保存，用于基因組dna提取。1.2斜帶石斑魚基因組dna提取本試驗采用常規(guī)酚氯仿方法抽提斜帶石斑魚鰭條中的基因組dna，具體步驟如下：(1)取0.3～0.5g鰭條于1.5mleppendorf管中，剪碎，在超凈工作臺上開蓋干燥20min；(2)待乙醇基本揮發(fā)后，te緩沖液(10mmol/mltris、1mmol/mledta、sds5％，ph＝8.0)洗滌1～2次，再加入600μldna抽提液(0.001mol/ltris-cl、0.1mol/ledta、sds5％，ph＝8.0)和3μl蛋白酶k(200mg/ml)，55℃水浴消化3h左右，前30min每10min輕搖離心管1次，消化至管內(nèi)液體澄清；(3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：異戊醇(v:v:v)＝25：24：1)600μl，輕輕來回顛倒離心管10min，12000r離心10min。取上層水相用等體積上述酚氯仿再抽提，直至水相與有機相之間沒有白色沉淀；(4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍體積已預(yù)冷的無水乙醇沉淀dna，顛倒混勻，4℃靜置30min，12000r離心10min，沉淀再用70％乙醇洗滌，離心晾干沉淀后加50μl無菌水溶解。4℃保存?zhèn)溆没?20℃長期保存。1.3構(gòu)建簡化基因組測序(restrictionsiteassociateddnasequencing，rad-seq)文庫并測序獲得斜帶石斑魚體重相關(guān)的snp標(biāo)記基于hiseq2000高通量測序平臺，采用rad簡化基因組測序方法對198個個體的dna樣本進行測序，產(chǎn)生0.4g左右的數(shù)據(jù)量，平均覆蓋0.4x的斜帶石斑魚基因組。同時還對這198個個體進行體重等生長性狀表型鑒定。采用plink軟件對數(shù)據(jù)進行處理篩選處理，然后使用基于混合線性模型的emmax軟件進行g(shù)was分析，從261,366個snp中找到了一個與體重顯著相關(guān)的snp位點。該snp位點位于seqidno.1所示序列的501bp位點處，在seqidno.1序列中用y表示該處位點，且此處位點的堿基為c或t。該位點處基因型為純合tt的斜帶石斑魚的體重顯著高于此處基因型為純合cc的斜帶石斑魚。實施例2與斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記的測序驗證與應(yīng)用2.1提取待測斜帶石斑魚鰭條中的基因組dna待測斜帶石斑魚來自實施例1中的斜帶石斑魚群體，隨機選取180尾魚，按照實施例1中所述的dna提取方法抽提基因組dna。2.2擴增含snp位點的核苷酸片段以前述提取獲得的各待測斜帶石斑魚的基因組dna為模板，利用正向引物f：5’-ctcctctgctgctcagcttt-3’(seqidno：2)和反向引物r：5’-ccgtacctccactgatgtga-3’(seqidno：3)，擴增出待測snp標(biāo)記所在的核苷酸片段。其中，pcr反應(yīng)體系以25μl計為：50-100ng/μl模板dna1μl，10pmol/μl引物f和r各1μl，10mmol/ldntpmix2.0μl，5u/μltaqdna聚合酶0.125μl，10×pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，余量為雙蒸水；pcr反應(yīng)條件為：94℃5分鐘；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30個循環(huán)；72℃5分鐘。2.3測序識別snp位點基因型將上述步驟中獲得的各pcr擴增產(chǎn)物于abi3730測序儀上進行單向測序，識別seqidno：1序列中501bp處(即本發(fā)明的snp標(biāo)記)的基因型。其中，60個待測斜帶石斑魚個體該snp位點的基因型及其體重如下表1所示。表160個個體該snp位點的基因型及其體重個體編號體重(g)基因型個體編號體重(g)基因型s12720ccs7772ccs3932ccs10174ccs11536ccs11674ccs11936ccs1874ccs7536ccs10978ccs836ccs13880ccs15538ccs18180ccs2240ccs9880ccs6640ccs1182ccs6442ccs18290ccs6846ccs12992ccs9046ccs17292ccs1348ccs19792ccs14448ccs73100ccs3448ccs71104ccs448ccs135114ccs6248ccs189118ccs14350ccs85132ccs2050ccs27156ccs15652ccs95170ccs10254ccs2146tts654ccs26150tts2356ccs187180tts14258ccs174180tts17564ccs179186tts9164ccs185190tts12366ccs165210tts14768ccs188228tts6970ccs72262tts15272ccs163262tt2.4snp位點基因型與生長速度的關(guān)聯(lián)分析基于表1的結(jié)果，利用sas9.0軟件mixed程序進行線性模擬分析snp位點的基因型與生長速度的關(guān)聯(lián)性，其中分析時以個體體重代表表型值，采用的模型如下：yijk＝μ+gi+aj+eijk。其中，yijk為個體體重值，μ群體體重均值，gi為基因型效應(yīng)向量，aj為微效多基因向量，eijk為隨機殘差效應(yīng)向量。snp位點的基因型與生長速度的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見下表2。表2snp位點的基因型頻率及與體重的關(guān)聯(lián)分析由表2可知，tt純合型個體體重均值比cc純合型個體體重均值大。表2所示的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，gt基因型個體體重的均值與tt基因型個體體重的均值的差異達極顯著性水平(p<0.01)。進而，證明seqidno：1所示核苷酸序列自5’端起第501位堿基g或t，與斜帶石斑魚生長速度顯著相關(guān)，為斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記，該snp標(biāo)記的tt基因型個體的生長速度顯著高于cc基因型個體。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。sequencelisting<110>鎮(zhèn)江華大檢測有限公司<120>snp標(biāo)記及其應(yīng)用<130>2017<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1001<212>dna<213>斜帶石斑魚<221>斜帶石斑魚生長速度相關(guān)的snp標(biāo)記的核苷酸序列<400>1gcacgcactttaatagacatcaaacatcgacggtgcgatatagccccagggattatattg60cagcctgttgtgcgactgccggctgcagggctctcactcaatactagatcagattcaaaa120atcgatttccccttcagtcacctaagtcgttttcatatcaggtatgactgatttgtacca180tgtctgagtatgattgcccccccacctccactcctctgctgctcagctttcacatttaat240gctgttccgtagctaagtacactttcatcatcatctacctgacatttttgctacgtgtag300aaaagggcgccgcagacatacactgctgcttcagggactatcatctgcttctggccagag360gaggagctctctaccacccactgaagctctgacagcagggtggagattgcagcgaagcct420gatctaagtctgtccacagtgggctgcgctgccatctgatatagagactcttgcataacc480agttaaaaacatcttgtagtyacattaaatagcagtccagctttgtgttatcgaacagtt540gctgttcatacttgatgtgcactgtaccagaactttacacaagaccaccttttcaagtgg600acttgggcaagcatacttccttgtacactggtacactggttcacactaatcaaacaaagt660ggactttgaggtcaagtgtactcagatctgggcccaggtctctgatgtgaaacccccatt720agagacaaaagaatgagaaaataggttgaaaaatgccagtttcccattaaataatgcatt780tcctccgatgacaacacaagaaattaaggagtcatggtttaaaccataagttagcaagta840attcctgtctgatttaaatagctaatcgaacacacagcactttcacatcagtggaggtac900ggtaatgtcatttcattcactctgggcttcattctcaaaggctgtgtcataaccagtttc960aaactagcgctttaacaccaactatgtattaaacttccttt1001<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<221>正向引物f<400>2ctcctctgctgctcagcttt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<221>反向引物r<400>3ccgtacctccactgatgtga20當(dāng)前第1頁12